3种实蝇基因组DNA提取及ISSR-PCR反应体系的建立

为探讨高品质实蝇基因组DNA提取,研究模板DNA浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶用量、dNTP浓度、退火温度及时间对ISSR-PCR扩增结果的影响,以3种实蝇为材料,建立通用且稳定的实蝇ISSR-PCR反应体系。结果表明：获得了高品质实蝇基因组DNA;确立了通用且稳定的实蝇ISSR-PCR反应体系：10×PCR Buffer 2.5 μL,模板DNA 50 ng,引物0.25 μmol/L,Taq DNA聚合酶0.50 U,dNTP 200 μmol/L,最后加ddH2O至25 μL;明确了ISSR-PCR扩增程序：94℃预变性5 min,94℃变性30 s,52.4℃退火45 s,72℃延伸90 s,循环36次,最后72℃延伸7 min,4℃保存。体系的建立弥补了实蝇传统形态检测的不足,为快速准确鉴定、种群异质性及遗传多样性分析奠定了基础。     

应用均匀设计优化文冠果ISSR-PCR反应体系

采用均匀设计,对引物浓度、TaqDNA聚合酶浓度、Mg2+浓度和dNTP浓度4个因素分别设置5个水平,对文冠果ISSR-PCR反应体系进行优化,在此基础上对模板DNA浓度、PCR反应过程中的退火温度进行梯度检测,构建了文冠果ISSR-PCR优化反应体系,在20μL ISSR-PCR反应体系中,各因素的最佳浓度分别为:2×PCR buffer、0.2mmol·L-1 dNTP、0.3μmol·L-1引物、2.5mmol·L-1 Mg2+和0.4UTaqDNA聚合酶,进一步对扩增程序中的循环次数和退火温度,以及ISSR引物进行筛选,获得的扩增程序为:94℃预变性5min,接着进行40个循环:94℃变性35s,52~56℃退火35s,72℃延伸45s;循环结束后,72℃延伸10min。     

春兰ISSR-PCR反应体系的优化

以春兰为材料,对影响ISSR-PCR扩增结果的因素如模板DNA、dNTPs、MgCl2、primer、TaqDNA聚合酶的浓度及引物退火温度、反应循环数进行了探讨,确立了适合春兰ISSR-PCR分析的最佳反应体系和PCR扩增参数:在15μL反应体系中含1×buffer,0.2 mmol/L dNTPs,2.0 mmol/L MgCl2,0.2μmol/L引物,0.3 UTaqDNA聚合酶,20 ng模板DNA。PCR扩增程序:94℃预变性2.5 min;94℃变性45 s,48~58℃退火(退火温度随引物不同而定)45 s,72℃延伸2 min,35个循环;72℃延伸5 min。     

均匀设计优化喜盐鸢尾ISSR-PCR体系

以新疆野生喜盐鸢尾DNA为模板, 采用U20(54)和U12(34)均匀设计表,通过4因素5水平和4因素3水平两轮均匀优化试验,对影响ISSR-PCR扩增结果的一些因素如Mg2+ 、dNT P、引物以及TaqDNA聚合酶浓度以及循环数和退火温度等进行优化筛选, 建立了适合喜盐鸢尾的最佳ISSR-PCR反应体系:在25 μL反应体系中,包括2.5 μL 10×PCRBuffer ,2.0mmol/L M g2+,250 μmol/L dNTP,0.1 μmol/L 引物,0.5U TaqDNA 聚合酶,40 ng模板DNA.扩增程序为 :94℃预变性3 min;接着进行40个循环:94℃变性45 s,52.1℃退火30 s,72℃延伸1.5 m in;循环结束后,72℃延伸5 min,4℃保存.     

荷花ISSR-PCR反应体系的建立及优化

以荷花叶片提取的基因组DNA为材料,通过对影响ISSR-PCR扩增效果的一些因素,如dNTPs浓度、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶用量、引物用量、模板DNA用量以及退火温度等进行筛选和优化,确立了可用于荷花ISSR-PCR分析的最适宜的PCR反应体系:20μL PCR反应体积含0.4 mmol.L-1dNTPs、3.5 mmol.L-1Mg2+、1.5 UTaqDNA聚合酶、0.4μmol.μL-1引物、3 ng模板DNA。PCR扩增程序为:94℃预变性2 min,94℃变性30 s,54.5℃退火30 s,72℃延伸1 min,45个循环,最后72℃延伸7 min,置4℃保存。应用该ISSR体系对6份荷花种质进行了扩增,证实了该体系的适用性和稳定性。     

九节茶ISSR反应体系的建立及优化

以九节茶叶片提取的基因组DNA为材料,对影响ISSR-PCR扩增效果的一些因素,诸如dNTPs浓度、TaqDNA聚合酶用量、引物用量、模板DNA用量、退火温度以及循环次数等指标进行筛选和优化.结果表明:20μL ISSR反应体系含10×PCR Buffer、0.4 mmol.L-1dNTPs、2 UTaqDNA聚合酶、0.6μmol.μL-1引物、5 ng模板DNA;PCR扩增程序为:94℃预变性2 min,94℃变性30 s,44.8℃退火30 s,72℃延伸1 min,35个循环,最后于72℃延伸7 min,置4℃保存.应用该ISSR体系对10份九节茶种质进行了扩增,证实了该体系的适用性和稳定性.     

沙地云杉ISSR-PCR反应体系的初步优化

以沙地云杉叶基因组DNA为材料,采用单因素试验方法对ISSR-PCR体系中的主要成分Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物浓度、退火温度进行筛选,建立并优化沙地ISSR-PCR反应体系。结果表明,UBC835是最适引物,适宜退火温度为50℃。沙地云杉ISSR-PCR分析的最适反应体系(20μL PCR反应体系)为:2.0 mmol/L Mg2+、1.0 U/μL Taq DNA聚合酶、0.25 mmol/L dNTPs、0.25μmol/L引物、50 ng/μL模板DNA。PCR扩增程序:94℃预变性4 min;94℃变性45 s,50℃退火45 s,72℃延伸2 min,40个循环;72℃延伸7 min,4℃保存。     

福建含笑ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以福建含笑叶片提取的基因组DNA为材料,对影响ISSR-PCR扩增效果的一些因素,如dNTPs浓度、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶用量、引物用量、模板DNA用量以及退火温度等指标进行筛选和优化,确立了可用于福建含笑ISSR-PCR分析最适宜的PCR反应条件:20μL PCR反应体积中含0.4 mmol.L-1dNTPs,2.5 mmol.L-1Mg2+,1.5 UTaqDNA聚合酶,0.6μmol.μL-1引物,30 ng模板DNA。PCR扩增程序:94℃预变性2 min,94℃变性30 s,47.3℃退火30 s,72℃延伸1 min,45个循环,72℃延伸7 min,4℃保存。应用ISSR体系对5份福建含笑种质进行了扩增,证实了该体系的适用性和稳定性。     

天然山地樟子松遗传多样性研究的ISSR-PCR反应体系的优化

以樟子松基因组DNA为模板,研究了ISSR的影响因素,建立了一套适宜于樟子松的ISSR优化反应体系及程序,以期为进行樟子松种群间遗传分化的研究奠定基础。研究结果表明,20μL反应体系中,模板DNA、引物、Mg2 、dNTP和TaqDNA聚合酶5种主要成分的最适浓度分别为35ng、150nmol/L、1.5mmol/L、200μmol/L、1.5U。反应程序为:94℃预变性5min,之后进行34个循环,每个循环包括94℃变性30s、56℃退火45s、72℃延伸2min,最后于72℃延伸7min。在扩增过程中,引物的适宜退火温度比其Tm值平均高4℃,扩增出足量产物至少需要35个热循环。     

大蒜RAPD反应体系的建立及优化

该试验以弥渡紫皮大蒜叶片基因组DNA为试材,采用不同浓度MgCl2、引物、dNTP、TapDNA聚合酶对大蒜的RAPD体系进行单因素反应条件优化.结果表明,25μL总反应体积中,最佳浓度配比为模板DNA 40ng,MgCl2 2.0 mmol/L,引物12 pmol,dNTP 50μmol/L,Taq DNA聚合酶1 unit,10×反应缓冲液2.5μL.扩增程序为94℃变性3 min,94℃变性30 s,37℃退火30 s,72℃延伸1 min,共35个循环,72℃最终延伸10 min.     

建兰ISSR-PCR反应体系的建立和优化（摘要）（英文）

[目的]研究建兰[Cymbidium ensifolium（Linn.） Sw]总基因组DNA的提取方法,并对建兰ISSR-PCR反应体系进行优化,建立更为完善的反应体系。[方法]用改良的CTAB法提取叶片的基因组DNA,用1.0%琼脂糖电泳检测DNA质量;用分光光度计测定其纯度和浓度,DNA纯度以OD260/OD280的比值来估算,浓度估算法为：DNA浓度（ng/μl） =OD260×50×稀释倍数。计算DNA获得率（DNA量/所用叶片量×100%）。对建兰ISSR-PCR反应的4项影响因素（DNA模板、TaqDNA聚合酶、Mg2 ＋和dNTPs）逐个作5水平进行研究,以筛选最优的建兰ISSR-PCR反应体系。[结果]获得高质量的建兰基因组DNA,以及优化了的建兰ISSR-PCR反应体系,即25μl PCR反应体积中,2.5μl 10×PCR buffer,2.5 mmol/LMgCl2,240 ng模板DNA,160μmol/LdNTPs,1.25 UTaqDNA聚合酶,0.4μmol/L引物,双蒸水15.78μl。最佳扩增程序为：94℃预变性5min,然后进行40个循环：94℃变性30 s,50 ～60℃退火（退火温度随引物不同而定） 30 s,72℃延伸50 s,72℃延伸7 min。[结论]建立了建兰ISSR-PCR反应体系最适合的条件,为进一步利用ISSR分子标记技术进行建兰遗传多样性研究提供了基础。     

番茄ISSR-PCR反应体系的优化与验证

研究番茄ISSR-PCR反应体系中主要因子TaqDNA聚合酶、dNTP、引物和DNA模板的浓度及各引物的退火温度对扩增结果的影响,建立番茄ISSR- PCR反应的优化体系,为ISSR 技术在番茄分子辅助育种应用提供参考。实验确定番茄ISSR-PCR 20 μL反应体系为：2.0 μL 10×PCR缓冲液,0.3 μmol/L引物,50 ng模板DNA,0.5 mmol/LdNTP,2 U TaqDNA聚合酶,各引物最佳退火温度有所不同。     

适用于川芎的ISSR-PCR反应体系的建立及优化(英文)

[目的]建立和优化适合川芎的ISSR-PCR反应体系。[方法]以川芎叶片为材料,利用改良CTAB法提取了叶片基因组DNA,利用单因素试验分析了DNA模板、Mg2+、dNTP、引物和TaqDNA聚合酶的浓度对ISSR-PCR反应的影响,对适合川芎的ISSR-PCR反应条件进行了优化。[结果]确定了适合川芎的ISSR-PCR反应体系为25.0μl,其中含2.5μl10×TaqDNA聚合酶缓冲液、2.1mmol/LMgCl2、300μmol/LdNTP、0.4μmol/L引物、1.0UTaqDNA聚合酶和20~40ng模板DNA。[结论]为进一步对全国17个不同分布区的川芎资源进行遗传多样性研究奠定了基础。     

五节芒ISSR-PCR反应体系的优化

［目的］保护五节芒的种质资源并为其开发利用奠定基础。[方法]以五节芒DNA为材料,分析DNA浓度、Mg^2＋浓度、dNTP浓度、Taq DNA聚合酶的含量以及退火温度对ISSR-PCR扩增结果的影响。并通过单因子试验对ISSR-PCR反应体系进行优化。［结果］建立了五节芒ISSR-PCR的最佳体系：25 μl反应体系中10×PCR Buffer 2.5 μl、0.2 mmol/L 4×dNTP、1.5 mmol/L Mg^2＋、0.75 U Taq DNA聚合酶。PCR反应程序为94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30s;51-53 ℃退火30 s,72 ℃延伸50 s,40个循环;72 ℃再延伸7 min。利用优化反应体系从100个ISSR通用引物中筛选出了11个稳定性高、重复性好的引物。［结论］这一优化体系的建立为今后利用ISSR标记技术研究五节芒遗传多样性奠定了基础。     

适用于川芎的ISSR-PCR反应体系的建立及优化

[目的]建立和优化适合川芎的ISSR-PCR反应体系。[方法]以川芎叶片为材料,利用改良CTAB法提取了叶片基因组DNA,利用单因素试验分析了DNA模板、Mg2＋、dNTP、引物和TaqDNA聚合酶的浓度对ISSR-PCR反应的影响,对适合川芎的ISSR-PCR反应条件进行了优化。[结果]适合川芎的ISSR-PCR反应体系为25.0μl,其中含2.5μl 10×TaqDNA聚合酶缓冲液、2.1 mmol/LMgC l2、300μmol/L dNTP、0.4μmol/L引物、1.0 UTaqDNA聚合酶和20～40 ng模板DNA。[结论]为进一步对全国17个不同分布区的川芎资源进行遗传多样性研究奠定了基础。     

青海云杉ISSR-PCR反应体系的建立与优化(英文)

[Objective] The experiment aimed to determine the optimum ISSR-PCR reaction system of Picea crassifolia kom. [Method] Picea crassifolia kom. was used as material to select and optimize influencing factors of ISSR-PCR such as Mg2+, dNTPs, Taq DNA polymerase, template DNA, primers, annealing temperature. [Result] The optimum ISSR-PCR reaction system in 20 μl reaction system was consisted of 1 μl 10×buffer, 1.5 mmol/L Mg2+, 0.2 mmol/L dNTPs, 1.0 U Taq DNA polymerase, 40 ng template DNA, 0.6 μmol/L primers. According to gradient test of annealing temperature in optimum ISSR-PCR reaction system of Picea crassifolia kom, it was found that the optimum annealing temperature of UBC 818 was 54.2 ℃ and the annealing temperature was different for different primers.[Conclusion]The construction of ISSR-PCR reaction system provided technical basis for classification of germplasm resources, construction of genetic map, gene mapping of Picea crassifolia kom. through using ISSR technology.     

珙桐基因组DNA的提取及ISSR-PCR体系的优化

采用改良的CTAB法提取珙桐基因组DNA,并采用正交试验设计方法优化其ISSR-PCR反应体系。结果表明：改良CTAB法提取基因组DNA的质量符合ISSR-PCR扩增反应的要求。最佳反应体系为：20μL反应液中含有2.0μL10×buffer、2.75 mmol/L Mg^2＋、0.125 mmol/L dNTPs、0.7μmol/L引物、0.75 UTaq酶和40 ng模板;PCR反应参数为：94℃5 min;94℃30 s,53.2℃45 s,72℃1 min,共40个循环;72℃7 min。     

油橄榄ISSR-PCR反应体系优化与引物筛选

[目的]对油橄榄ISSR-PCR反应体系进行优化,并筛选出多态性ISSR引物。[方法]以油橄榄嫩叶片提取的基因组DNA为模板,通过单因子试验针对反应体系主要因子Mg2+、dNTPs、引物浓度及模板用量进行油橄榄ISSR-PCR反应体系优化。[结果]优化的油橄榄ISSR-PCR反应体系为:总体系20μl中含1×Taq Buffer,3.5 mmol/L Mg2+,0.4 mmol/L dNTPs,1.0μmol/L引物,1.0 U Taq DNA聚合酶,20 ng DNA模板。反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,52～55℃退火30 s,72℃延伸2 min,40个循环;72℃延伸10 min,4℃保存。同时利用上述反应体系和反应程序筛选出了扩增稳定、多态性高、扩增条带清晰的ISSR引物11条。[结论]为进一步油橄榄种质资源的多样性研究和品种鉴定奠定了基础。     

青钱柳ISSR-PCR反应体系的优化

采用改进的SDS法提取青钱柳基因组DNA,测试青钱柳ISSR扩增的最适退火温度,并采用单因素试验,测试了模板DNA、Mg2+、dNTP、BSA、引物\Taq酶6个因素对青钱柳ISSR扩增的影响。结果表明:合适的退火温度为56.3℃;适宜的扩增体系为:10μlPCR反应体积中,1×Taq酶配套缓冲液浓度为(10 mmol/LTris.HCl,pH值9.0,浓度为50 mmol/LKCl,0.1%Triton X-100),12 ng模板DNA,浓度为1.5 mmol/LMgCl2,浓度为1.0 mmol/L4×dNTP,1mg/ml BSA,15 pmol引物,0.75 UTaq酶。