鲤鱼AFLP-银染体系的建立与优化

以鲤科鱼类建鲤为材料,对扩增片断长度多态性(AFLP)反应体系进行优化,建立适合于鲤鱼的AFLP反应体系.通过对AFLP常规流程中基因组DNA提取、酶切.连接、预扩、选扩及电泳-银染过程的优化,初步建立了适合鲤鱼的AFLP分析体系:采用鲤血细胞DNA提取;MseI和EcoRI 37 ℃双酶切5 h;预扩引物为E+A和M+C;选扩引物E+3与M+3浓度配比为1:8,为提高引物与模板的结合效率,选扩程序均采用touch-down程序;最后结合经典AgNO3-Na2CO3银染显色.通过优化的AFLP程序,从64对引物中筛选出8对多态性引物,为进一步的鲤鱼种质资源研究奠定基础.     

苦瓜AFLP分子标记反应体系的建立

利用AFLP分子标记技术,采用MseI/EcoRI酶切组合,从64对引物中筛选出6对带型分布均匀、多态性高且分辨能力强的引物,分别为:E1/M5、E4/M8、E6/M4、E7/M5、E7/M7、E8/M3,并确定了适用于苦瓜AFLP反应的最佳酶切-连接、预扩增和选择性扩增反应体系,从而为今后利用AFLP分子标记技术对苦瓜进行深入研究打下基础.     

板栗叶片DNA的提取及AFLP反应体系的建立

以初展开的板栗嫩叶为材料,利用改进的CTAB法,提取到高质量的板栗叶片总DNA。通过优化酶切连接、预扩增、选择性扩增等试验条件,建立了板栗AFLP银染反应体系,得到了清晰的板栗AFLP指纹图谱。为板栗品种的分子标记和板栗品种间亲缘关系等研究奠定了基础。研究结果表明:①DNA模板的质量影响酶切以及后续的连接扩增反应。以初展开的嫩叶提取的板栗叶片总DNA纯度最高,所含蛋白质、小分子杂质少,改良的CTAB提取法可用于板栗AFLP分析,形成清晰的AFLP指纹。②先进行酶切后再进行酶连的反应体系比酶切酶连一起进行的体系效果更好。板栗基因组DNA最佳酶切反应体系为:模板DNA总量500ng,反应体积为25μl,10×Y+/TanqoTMBuffer2.5μl,BSA0.8μl,EcoRI5U,MseI5U。连接反应体系中T4DNA连接酶浓度2U即达最佳效果。酶切、酶连反应最佳温度均为37℃。③以板栗为材料进行AFLP标记时,E AAC+M CAA、E AAC+M CAT和E AGT+M CAT三个引物均获得较好的多态性。其中以E AGT+M CAT引物组合的扩增条带信号强度一致性好,条带分布均匀,能够得到稳定、清晰、分辨率较高的指纹谱带,可进行中国板栗的遗传变异分析。     

沙棘木蠹蛾AFLP引物筛选及反应体系的建立

该文以沙棘木蠹蛾幼虫为材料,用改进的SDS-蛋白酶K法获得了高质量的符合AFLP分析要求的基因组DNA。通过对AFLP试验过程中的酶切 连接、预扩增、选择性扩增等各关键因素的比较研究,建立了一套优化的沙棘木蠹蛾AFLP分子标记体系,获得了清晰的指纹图谱。研究结果表明:利用EcoRⅠ/MseⅠ双酶切系统以酶切 连接2～4 h, 预扩增产物稀释20倍、Mg 2+浓度为1.5 mol/mL的选择性扩增效果最好。进一步利用该反应体系从80对E+3 /M+3选择性引物中筛选出10对多态性丰富、分辨率高、谱带清晰的引物组合。该研究结果为利用AFLP标记技术开展沙棘木蠹蛾的种群遗传结构、遗传分化等方面的研究奠定了基础。      

大竹蛏AFLP分子标记反应体系的建立与优化

[目的]建立一套适合大竹蛏的AFLP分子标记反应体系,为大竹蛏的遗传多样性研究提供技术支持。[方法]采用比较实验法,以大竹蛏基因组DNA为模板,对其AFLP体系中的酶切时间、预扩产物稀释倍数及选扩引物E＋3/M＋3的配比等进行优化。[结果]优化的AFLP体系为：酶切时的DNA模板浓度为100 ng/μl,双酶切2 h;预扩模板最佳用量1.0μl;预扩产物的最适稀释倍数为40倍;选扩引物浓度配比为1∶4。同时,筛选出12对引物组合,可用于大竹蛏的AFLP分析。[结论]采用优化的AFLP反应体系及筛选后的引物,对大竹蛏群体进行了初步扩增,得到了清晰的电泳图谱。     

菊属部分植物的AFLP分析

利用AFLP技术,对菊属植物12个分类群进行分析.选择EcoRI/ MseI 这一酶切组合,5个E+3/M+2引物组合及1个E+3/M+3引物组合进行选择性扩增.共得到287条条带,其中多态性条带占85.7%.利用UPGMA方法对扩增数据进行分析,结果表明:所选的两个栽培品种‘滁菊'和‘亳菊'可归并为一个品种,该品种与毛华菊、野菊、甘菊亲缘关系相对较近,紫花野菊次之,小红菊相对最远.各野生种间,野菊、甘菊和菊花脑间的亲缘关系极近,且同一分布区内的不用种间有比较频繁的种质渗入.研究表明AFLP技术是进行菊属植物亲缘关系研究极为有效的工具.     

枸杞属AFLP分析体系优化与建立

以枸杞属种质资源为试材,对AFLP分析过程中包括DNA的提取质量和浓度、Mse I/EcoR I以及T4 DNA连接酶的浓度、反应时间等影响因素进行了研究.建立了一种适于枸杞AFLP银染技术的优化体系.该体系中各优化因素为:模板DNA的用量为300～400 ng,酶切体系中Mse I和EcoR I各加入3 U,T4 DNA连接酶加入2.0U,采用酶切与连接在同一体系中一步完成,其酶切温度为37℃,反应时间为5 h.与22℃连接过夜.并对预扩增、选择性扩增和银染的效果进行了检测,以引物M+CAC/E+AGG构建了枸杞种质资源的AFLP指纹图谱,该图谱扩增带多,多态性强,且质量好.     

杜仲AFLP反应体系的建立及优化

【目的】建立并优化适合杜仲的AFLP技术体系,为进一步构建其遗传图谱及开展分子标记辅助育种奠定基础。【方法】对杜仲基因组DNA提取方法、酶切与连接体系、预扩增和选择性扩增程序的影响因素进行分析,并对适合杜仲AFLP分析的引物组合进行筛选。【结果】模板DNA的提取采用改进的CTAB法,酶切模板DNA用量500 ng,酶切时间6 h,连接反应时间6 h,预扩增产物最适稀释倍数30倍。同时筛选出E-AAG+M-CAA,E-AAG+M-CAT,E-AAG+M-CTA,E-AAG+M-CTG,E-ACA+M-CAA,E-ACA+M-CTA,E-ACC+M-CTG共7对适合杜仲AFLP分析的引物组合。【结论】经重复验证,建立的AFLP反应体系适用于杜仲的AFLP分析。     

北京地区常见鼠尾草属植物AFLP亲缘关系分析(英文)

[目的]采用AFLP分子标记技术对北京地区鼠尾草属(Salviaspp.)植物的7个种23份样本进行亲缘关系分析。[方法]利用21对引物组合中筛选出的稳定性好、多态性较高的6对引物(E+ATT/M+AC;E+ATT/M+GA;E+AAG/M+CTG;E+AAG/M+CCT;E+AAG/M+ACT;E+AAC/M+ACT)用于扩增北京地区鼠尾草属植物基因组DNA,反应体系分为两步:①梯度降温扩增。第1个循环为94℃,30s;65℃,30s;72℃,60s。以后每个循环的退火温度依次降低0.7℃,共13个循环;②普通扩增。94℃,30s;56℃,30s;72℃,60s;23个循环。扩增后采用6%聚丙烯酰胺凝胶和BG-Power3500型电源和DYC-20A型电泳槽,在恒功率60W的条件下电泳至溴酚蓝指示线刚刚跑出玻璃板。银染后在灯光下统计扩增条带数,构成二进制矩阵表。用NTSYSpc2.10e软件进行分析,采用UPGMA方法进行聚类分析,通过Treeplot模块生成聚类图。[结果]对23份鼠尾草属植物进行AFLP分析,得到367个扩增位点,其中多态性位点359个,占总扩增位点的97.82%。在遗传距离为0.32的水平下,23份鼠尾草属植物样本归为7个组:一串红(S.splendens)组、蓝花鼠尾草(S.farinacea)组、朱唇(S.coccinea)组、雪见草(S.plebe-ia)组、丹参(S.miltiorrhiza)组、荫生鼠尾草(S.umbratica)组和罗马尼亚鼠尾草(S.officinalis)组。蓝花鼠尾草、朱唇、雪见草、丹参、荫生鼠尾草、罗马尼亚鼠尾草与一串红的亲缘关系依次增远;一串红种内,自选品种(系)与商品种亲缘关系较远。[结论]该研究结果可为北京地区开展鼠尾草属植物的种间和种内远缘杂交提供理论参考。     

波尔山羊和江苏本地山羊的AFLP和RAPD分析

 实验山羊共 10 5只 ,其中波尔山羊 6 0只 (公母羊各半 ,采血样 2 0个 ,组织样 4 0个 ) ,徐淮山羊 30只 (公母羊各半 ,每羊采血样 1个 ) ,海门山羊 15只 (公羊 7只 ,母羊 8只 ,每羊采血样 1个 )。分别提取DNA ,按品种构建DNA池。应用 36个选择性引物组合对波尔山羊、徐淮山羊和海门山羊品种间AFLP多样性进行研究 ,其中 2 9个引物组合共扩增出 32 5 3个标记 ,包括多态标记 92个 ,平均每个引物组合扩增 3.17个多态标记 ,多态频率达2 .8%。多态标记数较多的引物组合为 :E0 0 +ACG/M 0 0 +CAA(13个 )、E0 0 +ACG/M0 0 +CAG(10个 )、E0 0 +AAC/M0 0 +CAC(8个 )和E0 0 +AAC/M0 0 +ACT(7个 )。从 93个随机引物中筛选出品种间多态性较强、重复性好的引物 2 2个 ,对 3个品种池DNA进行RAPD扩增 ,共扩增出 183个标记 ,其中多态标记 6 0个 ,平均每个引物扩增2 .73个多态标记 ,多态频率为 32 .8%。两种方法得到一致结果 ,即徐淮山羊与海门山羊遗传距离最近 ,徐淮山羊与波尔山羊次之 ,海门山羊与波尔山羊遗传距离最远。按UPGMA法将海门山羊与徐淮山羊聚为一类 ,其次为波尔山羊。两种方法均能较好地反映 3个山羊品种的遗传差异 ,但AFLP方法多态标记数更多。     

部分牡丹品种遗传多样性的AFLP分析

【目的】研究牡丹遗传多样性为合理利用牡丹种质资源、培育观赏价值高的牡丹新品种提供依据。【方法】利用荧光标记AFLP技术，采用8对M+3和P+3引物组合对30份牡丹栽培品种进行了总基因组DNA水平上的多态性检测。【结果】检测结果共获得1 123条可统计的条带，其中965条呈多态性，多态性带百分率达86%。揭示了牡丹栽培种质丰富的遗传多样性。8组引物在30个品种中检测到数目不等的品种特异带型，这些品种的特异带型对供试牡丹品种具有一定的鉴别价值。【结论】8对引物能将30个牡丹品种完全区分开。聚类分析结果表明多数来源地相同的牡丹种质表现出较为密切的亲缘关系。     

采用AFLP技术分析17个荷花(Nelumbo nucifera)品种的系统关系

【目的】采用AFLP技术,对17个荷花品种进行亲缘关系分析。【方法】从64个AFLP引物组合中筛选出10对多态性较高的引物,以17个荷花DNA为模板,进行PCR扩增,并对产物进行聚丙烯凝胶电泳分析。【结果】共获得条带523条,其中多态性条带370条,多态性比例达到70.75%;根据扩增条带信息进行聚类,可将17个品种分为2组;其中有5对引物,每对引物单独使用均可将17个品种完全区分开。【结论】AFLP用于鉴别荷花品种,具有较高的可行性;本研究为荷花分类和杂交育种的亲本选择提供参考信息。     

Comparison Between AFLP and RFLP Markers in Detecting the Diversity of Rice (Oryza sativa L.)

AFLP and RFLP were used to study the diversity of 20 rice cultivars. 15 primer combinations were used in the AFLP analysis and 47 - 118 bands were amplified in each lane. A total of 107 polymorphic bands were detected in the RFLP analysis using 49 RFLP probes. The cluster analysis based on RFLP data showed that 20 rice cultivars could be divided into an indica group and a japonica group, as did the AFLP data; however AFLP is more suitable in detecting the difference of pedigree and ecotype among the 20 cultivars.The genetic distance based on AFLP and RFLP data showed the same tendency, but AFLP markers increased the measure of genetic distance among intra-subspecific cultivars and decreased the measure of genetic distance among inter-subspecific cultivars relative to RFLP markers. That indicated that AFLP is more suitable than RFLP in the diversity study and RFLP is more suitable to study the indica-japonica differentiation of cultivars.     

马铃薯品种遗传多样性的AFLP分析

利用AFLP分子标记技术对19份克新系列马铃薯品种进行了遗传多样性分析,用30对引物组合进行了初筛,选出7对有多态性的引物组合进行了详细研究。每对AFLP引物组合扩增出54￣90条带,共获得495条带,其中多态性条带为302条。AFLP分析表明19个材料的遗传距离介于0.2091￣0.7679之间,平均值为0.4811。聚类分析将19份材料划分为4类,其中第2类包括14个品种,占总数73.86%,表明多数品种亲缘关系较近,但有少数品种亲缘关系较远,说明克新系列马铃薯的遗传基础有所拓宽。研究表明:AFLP指纹分析技术具有很高的分辨率,适于进行马铃薯遗传多样性研究。     

牡丹矮化品种亲缘关系的AFLP分析

利用荧光标记AFLP技术, 采用8对M+3和P+3引物组合对4个牡丹野生种和26个矮化及高大品种间的亲缘关系进行了分析. 共获得1 133条可统计的条带, 其中 948 条呈多态性,多态性带百分率达84%, 揭示了牡丹组植物丰富的遗传多样性. 聚类结果表明: 在受试的4个牡丹野生种中,与栽培牡丹亲缘关系从近到远依次为: 杨山牡丹、矮牡丹、紫斑牡丹和卵叶牡丹; 矮牡丹和卵叶牡丹有较近的亲缘关系. 牡丹品种间的聚类结果表明, 部分矮化品种、高大品种分别相聚,而一些矮化与高大品种也相聚.不同相似系数的遗传聚类划分与株高间并没有完全一致的关系, 但在其他性状相差不大时, 株高相近的品种间亲缘关系相对较近.      

茶树AFLP--银染技术体系与品种指纹图谱的建立

通过对影响茶树AFLP—银染技术体系的关键因素作对比研究，建立了一套优化的茶树AFLP分子标记体系．应用该体系研究不同茶树品种的AFLP指纹，结果同一引物对不同品种扩增及不同引物对同一品种扩增都呈现出十分丰富的多态性，图谱清晰，分辨率高。     

节瓜基因组AFLP体系建立的研究

以节瓜雌性系K36和强雄系G为材料,从DNA提取、酶切连接、预扩和选扩等方面进行选择优化,建立高效稳定的AFLP分析体系,同时从64对AFLP引物组合筛选出多态性好的引物组合6对,并以该体系开展节瓜雌性性状分子标记和图谱构建等遗传分析研究。     

AFLP and RAPD Analysis of the Boer and Indigenous Breeds of the Goat in Jiangsu

Blood and tissue samples were collected from 105 goats including 60 Boer goats (30 for eachsex), 30 Xuhuai goats (15 for each sex) and 15 Haimen goats (7 stud and 8 does). DNA was extracted andDNA pools were constructed on the basis of goat breeds. In 36 selective primer combinations, 29 combinationsamplified totally 3 253 markers including 92 polymorphic markers by amplified fragment length polymor-phism (AFLP). On average, 3.17 polymorphic markers were amplified per combination, with a polymorphicfrequency of 2.8%. The primer combinations amplifying more polymorphic markers (showed in brackets)were involved in E00+ACG/M00+CAA (13), E00+ACG/M00+CAG (10), E00+AAC/M00+CAC (8)and E00+AAC/M00+ACT (7). A total of 183 markers including 60 polymorphic markers were amplified byRAPD from the pooled DNA of three breeds using 22 primers with strong polymorphism and high reproduc-ibility selected from 93 RAPD primers. On average, 2.73 polymorphic markers were amplified per primer,with a polymorphic frequency of 32.8%. The results of AFLP and RAPD coincidently suggested that the ge-netic distance is the closest between Xuhuai and Haimen goat, next between Xuhuai and Boer goat, and the far-thest between Haimen and Boer goat. According to the UPGMA method, Haimen and Xuhuai goats can begathered together as a cluster, then Boer goat. Both methods can be used to implicate the genetic difference ofthese three breeds, in particular AFLP has more polymorphic markers.     

应用AFLP标记筛选甘蓝型油菜R4和22B的多态性

应用AFLP分子标记,对甘蓝型油菜恢复系R4和保持系22B进行引物多态性筛选。在414对AFLP引物中,初步筛选到有多态性的引物组合147对;其中重复性好、多态性比率高的引物组合120对;每对引物可扩增出50条左右的条带,其中,多态性条带数为12.4条。AFLP是构建图谱中效率较高的分子标记。     

两个芒果品种的AFLP指纹图谱

对ＡＦＬＰ技术在芒果上的应用进行了尝试,并利用１６对引物构建了两个芒果育种亲本的指纹图谱,获得了两个品种间分子水平上的多态性信息。