PVYNTN-NW榆林分离物的全基因组序列测定与分析

【目的】马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）是马铃薯病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus）代表成员,是马铃薯和烟草生产中分布最为广泛并造成严重经济损失的病毒之一。研究旨在揭示PVY榆林分离物ShX14的全基因组特征,并准确判断其株系分子类型。【方法】根据已经报道的PVY不同基因保守区设计11对简并引物,采用片段重叠法从感染 PVY的马铃薯病叶中扩增、克隆获得榆林分离物ShX14的全长序列,并对其序列特征、重组位点、系统发育关系等进行分析。同时,应用系统发育与性状关联分析（phylogeny-trait association analysis）评估PVY分离物与株系的关联性。【结果】测序获得的ShX14分离物核苷酸序列全长为9 724 nt（不含3′端的多聚腺苷酸尾）。该病毒基因组含有一个9 186 nt的开放阅读框,编码3 061个氨基酸的多聚蛋白（polyprotein）。在P3顺反子中+2相位上也发现由移码（reading frame shift）产生的PIPO蛋白。全基因组序列比较分析显示,ShX14分离物与HN2、SYR-NB-16分离物（PVY^NTN-NW株系SYR-I型）的核苷酸、氨基酸序列的一致性分别为98%-99%和98%-100%。该分离物的P1、HC-Pro/P3和CP基因的5′端均检测到显著的重组信号,重组位点分别位于2 318、5 674 和8 385 nt,与PVY^NTN-NW株系（SYR-I型）的重组位点相似。系统发育分析结果显示该分离物与HN2、SYR-NB-16分离物相聚成簇,表明其在系统发育关系上,与PVY^NTN-NW株系（SYR-I 型）的亲缘关系最近。系统发育分析与性状关联分析结果显示该分离物与PVY^NTN-NW株系（SYR-I 型）的关联系数（association index, AI）、简约分值（parsimony score, PS）和最大单系分支（maximum monophyletic clade, MC）3个统计检验均显著,表明其与PVY^NTN-NW株系（SYR-I型）存在显著的关联性。同时,应用多重RT-PCR成功扩增出约为1 000、600和400 bp的3个特异性片段,与PVY^NTN-NW株系（SYR-I型）的特异条带大小相一致。这些结果也进一步确定该分离物属于 PVY^NTN-NW株系（SYR-I型）。【结论】ShX14 分离物为N×O重组分离物,属于PVY^NTN-NW株系（SYR-I型）,为后续深入开展该分离物的生物学等研究奠定了基础。     

采用多基因联合方法鉴定福建长乐和福清产区马铃薯Y病毒株系组成

【目的】马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是马铃薯生产上危害较为严重的病毒,也是制约马铃薯可持续发展的主要病毒之一。论文旨在开发一套简便、准确、快速的PVY分子鉴定技术,并采用该技术及时查明福建省部分产区PVY病害的发生、分布及PVY株系组成。【方法】采用ELISA方法对采自福建省长乐市、福清市马铃薯种植区疑似受PVY感染的样品进行检测,并根据文献报道的PVY P1、VPg和CP基因保守区设计3对简并引物,对ELISA检测后的阳性样品进行基因扩增、克隆,并将获得的序列进行核苷酸序列一致性、重组位点、基因型分布和系统发育分析。【结果】ELISA检测结果表明,17份样品中有13个样品与PVY抗体呈阳性反应,其他呈阴性反应。13个阳性样品均能成功扩增出3个与P1、VPg和CP基因预期大小一致的特异片段。BLAST比对分析显示P1、VPg和CP基因与文献报道的已知PVY分离物的核苷酸序列一致性分别为72%—99%、85%—99%和88%—99%。P1、VPg和CP 3个基因联合序列分析显示,FQ01分离物与PVY~(N-Wi)株系的核苷酸序列一致性最高,FQ08分离物与PVYE株系的核苷酸序列一致性最高,CL01、CL02、CL05和CL13 4个分离物与PVY~(NTN-NW)株系SYR-I型的核苷酸序列一致性最高,CL03、CL04、FQ02、FQ06、FQ09、FQ11和CL12 7个分离物与PVY~(NTN-NW)株系SYR-II型的核苷酸序列一致性最高。重组分析显示,除CP基因外,长乐市和福清市两个产区的PVY分离物的P1和VPg基因中均检测到显著的重组信号。基因型统计分析结果显示,长乐产区的P1基因为N型(60%)和N×O重组型(40%),VPg基因均为N×O重组型,而CP基因均为O型,而福清产区的P1基因为N型(25%)和N×O重组型(75%),VPg基因为N×O重组型(87.5%)和O型(12.5%),而CP基因除了一个分离物为N型外,其他均为O型。系统发育分析显示分离物FQ01与PVYN-Wi株系聚为一簇,FQ08与PVYE株系聚为一簇,CL01、CL02、CL05和CL13与PVY~(NTN-NW)株系SYR-I型聚为一簇,CL03、CL04、FQ02、FQ06、FQ09、FQ11和CL12与PVY~(NTN-NW)株系SYR-II型聚为一簇,表明在系统发育关系上,分离物FQ01与PVYN-Wi株系最近,FQ08与PVYE株系最近,CL01、CL02、CL05和CL13与PVY~(NTN-NW)株系SYR-I型最近,CL03、CL04、FQ02、FQ06、FQ09、FQ11和CL12与PVY~(NTN-NW)株系SYR-II型最近。【结论】PVY在福建省长乐市、福清市马铃薯种植区普遍存在,重组株系已成为田间的主流株系,且PVY~(NTN-NW)已成为优势重组株系。     

青海省部分地区马铃薯Y病毒cp基因序列分析

马铃薯Y病毒(PVY)是危害我国马铃薯的主要病毒之一,其在自然条件下极易发生基因变异而产生株系分化现象。为揭示青海马铃薯Y病毒分离物cp基因的分子变异,利用RT-PCR方法扩增获得了16个马铃薯Y病毒分离物的cp基因序列,采用SDT、DANMAN、RDP和MEGA软件对其进行分子变异分析。序列一致率结果表明,16个分离物的核苷酸序列均为801个碱基,一致率为98.0%~100%,编码267个氨基酸,一致率为94.8%~100%。重组分析表明,16个分离物未发生基因重组。系统发育分析发现,11个分离物与PVY^N-Wi株系相聚成簇,表明其在系统发育关系上与PVY^N-Wi株系的亲缘关系最近,占被检出病毒分离物的68.7%;另外5个分离物与PVY^O株系相聚成簇,表明其在系统发育关系上与PVY^O株系亲缘关系最近;未发现PVY^C株系、PVY^N株系、PVY^E株系和PVY^NTN株系存在。     

马铃薯Y病毒广东分离物HC-Pro基因的克隆和序列分析

利用RT-PCR法对广东烟草样品的马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)辅助成分蛋白质(Helpercomponent proteinase,HC-Pro)基因进行了克隆,并对其进行了序列分析。测序结果表明广东PVY HC-Pro(命名为PVY-HC-GD)基因(用PVY-HC-GD表示)全长1 395 bp,编码465个氨基酸。与已报道的PVY HC-Pro基因核苷酸序列相比发现,PVY-HC-GD与PVY NTN株系(PVYNTN)(AB331517)的PVYHC-Pro基因核苷酸序列相似性最高,达99.6%。而氨基酸序列比较表明,PVY-HC-GD与PVY N株系(PVYN)(AM268435)的PVY HC-Pro氨基酸序列相似性最高,为99.1%。进一步将PVY-HC-GD的核苷酸和其编码的氨基酸序列与其他报道的同源基因比对构建了系统关系树,结果显示广东烟草样品中PVY-HC-GD与PVYNTN PVY HC-Pro亲缘关系最近。     

贵州芸薹黄化病毒的分子检测及基因型鉴定

【目的】对贵州省白菜、萝卜和甘蓝感染芸薹黄化病毒（Brassica yellows virus,BrYV）进行分子检测及基因型鉴定,为马铃薯卷叶病毒属病毒的防治提供理论参考。【方法】在贵州省遵义市、威宁县、关岭县、平坝县等县（市）共采集284份蔬菜（白菜、萝卜和甘蓝）疑似病毒病样品,利用马铃薯卷叶病毒属的通用引物进行RT-PCR分子检测,并对检测出的16个BrYV分离物进行P0和CP基因序列扩增,再与已报道的BrYV基因序列进行比对,从而构建系统发育进化树,鉴定其基因型。【结果】284份疑似病毒病样品中,有43份样品检测出BrYV,检出率为15.14%,其中,感染BrYV白菜样品12份,占白菜总样品数的12.77%;感染BrYV萝卜样品14份,占萝卜总样品数的20.29%;感染BrYV甘蓝样品17份,占甘蓝总样品数的14.05%。贵州16个BrYV分离物P0基因核苷酸序列的相似性为89.9%~100.0%,CP基因核苷酸序列的相似性为93.5%~100.0%,二者编码的氨基酸序列相似性均为100.0%。基于P0基因构建的系统发育进化树可知,BrYV-Pingba-BC-2、BrYV-Zunyi-LB-1和BrYV-Zhijing-BC-1均与BrYV-BJS和BrYV-BBJ聚为一类,其余13个分离物均与BrYV-ABJ和BrYV-AJS聚为一类。基于CP基因构建的系统发育进化树可知,贵州不同地区不同蔬菜作物的16个BrYV分离与BrYV-A和BrYV-B基因型无明显分界,亲缘关系均较近。BrYV P0基因检测到5个重组事件,BrYV CP基因未检测到潜在重组事件。【结论】BrYV在贵州白菜、萝卜和甘蓝上普遍发生,但对萝卜的危害最重,主要存在BrYV-A和BrYV-B 2种基因型。     

中国部分马铃薯产区马铃薯Y病毒(PVY)的株系分化与鉴定

分别克隆了黑龙江、山西、贵州等3省内的4个马铃薯产区的PVY p1基因和cp基因,通过系统地基因序列分析对各分离物的株系种类进行了鉴定.结果表明中国马铃薯产区PVY株系分化现象明显,其中黑龙江省克山农场分离为PVYNTN株系;贵州省贵阳市分离物、威宁自治县分离物、山西省临县分离物为PVYN:O株系.PVYN:O株系分布普遍,可能已经成为中国部分马铃薯产区PVY的主要流行株系.     

青海省马铃薯Y病毒P1基因序列分析

【目的】本研究通过对不同PVY分离物基因的测序及分析,了解青海省PVY株系特点,进而对PVY病毒的分子检测和预防控制提供理论基础。【方法】采用RT-PCR扩增的方法,对青海省18个PVY的P1基因进行克隆测序和进化树分析。【结果】P1目的基因共825个碱基,编码275个氨基酸;经比对样品的P1基因序列,核酸一致率达90.3%～100.0%,其中Y-39、Y-47和Y-513个样品与其它样品有55～61个碱基的差异;试验样品与国内外已报道的PVY P1基因相比较,经进化树分组后,主要分为A、B、C 3组,其中A组包含了大部分来自青海的样品,是本地区的优势组群;而另一组4个样品的P1基因与本地优势组群有较大差异,且4个样品间也有一定的差异。通过与GeneBank中已上传的序列提供的信息相比对,发现14个样品的P1基因与PVY~(N-Wi)株系较近;其余4个样品与PVP~(NTN)株系较近。【结论】由P1基因分析表明,青海省马铃薯Y病毒株系具有地域特点,另外的4个样品说明青海PVY有可能是不同区域间种薯调运以及PVY本身重组特性而产生的。     

马铃薯Y病毒两分离物特性及其侵染寄主的超微结构比较研究

报道了马铃薯Y病毒两分离物的生物学和血清学特性、病毒粒体形态大小以及它们引起的寄主细胞病变特征等方面的差异.从山东省主要烟草和马铃薯种植区病毒样品中分离到两个马铃薯Y病毒分离物,分别为PVY-T 和PVY-P.两分离物在寄主植物上的症状表现、体外抗性、蚜传特性、血清学以及病毒粒体大小等方面存在着明显的差异.同时,这些结果与作对照的PVY标准株系PVYN 和PVYO相比较,初步推测分离物PVY-T属于PVYO株系 ,而P VY-P则属于PVYN.通过对受侵染寄主的细胞超微结构观察比较发现,这两种PVY分离物在寄主细胞内的分布特征、内含体以及与寄主互作后所引起的细胞病变也明显不同,这些可能成为区别PVY不同株系的依据之一.     

大麦黄矮病毒合肥分离物的鉴定及CP基因进化分析

[目的]为了明确合肥地区大麦黄矮病毒株系种类及分子变异情况。[方法]利用生物学手段和RT-PCR方法鉴定了2009年采自合肥地区的19个分离物,并测定了分离物的外壳蛋白基因（CP基因）的序列。[结果]合肥地区的12个分离物被鉴定为BYDV-PAV,CP基因序列比对发现核苷酸一致性为95.8%～99.7%。系统进化树分析得知,12个合肥分离物序列聚类到一个分支上,它们与中国分离物PAV-CN（AY855920）的CP基因亲缘关系最近。[结论]掌握合肥地区大麦黄矮病毒的株系分布及分子变异情况,对指导该地区小麦黄矮病的抗性育种和防治工作有着非常重要的意义。     

贵州烟田马铃薯Y病毒优势株系全序列克隆及系统进化分析

为了解马铃薯Y病毒在贵州烟田的发生和流行规律,对2013—2015年采集到的贵州省多个烟区呈现典型茎脉坏死症状的疑似受马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)侵染的烟草样品进行单斑分离和病毒鉴定,并以现有PVY序列信息为参考,设计了4对PVY特异引物,经过RT-PCR扩增、T载体连接、序列测定以及序列拼接,并利用MEGA软件进行系统进化分析。结果发现PVY福泉分离物(PVY Fuquan isolate,PVY-FQ)和PVY大方分离物(PVY Dafang isolate,PVY-DF)为优势株系并获得了PVY-FQ和PVY-DF的全基因组序列。PVY FQ整条基因组由9 699个碱基组成,编码多聚蛋白的开放阅读框位于第188~9 373nt;PVY DF整条基因组由9 706个碱基组成,编码多聚蛋白的开放阅读框位于第190~9 375nt。2条序列的基本特征与已报道PVY基因组一致。对PVY-FQ和PVY-DF全序列与已报道PVY序列进行系统进化分析发现,PVY-FQ与PVY NTN株系具有较高的亲缘关系,而PVY-DF与PVYN具有较高亲缘关系。     

中国野生柑橘上衰退病毒分离株分子特征分析

 【目的】了解中国野生柑橘上携带柑橘衰退病毒（CTV）分离株的CP/HinfⅠRFLP组群构成和分子特征。【方法】运用RT-PCR对采自中国云南、广西、四川、湖南、江西等省11个野生柑橘上CTV分离株的病毒衣壳蛋白基因(CPG)进行扩增，利用RFLP和SSCP对CPG进行分析，并将测定的CPG序列进行同源性比较和聚类分析。【结果】发现野生柑橘上11个CTV分离株以单一组群感染为主；这些CTV分离株CPG的核苷酸序列和相应的氨基酸序列同源性分别为92.5％～99.5％和95.0％～100％；与GenBank收录的9个全基因组CTV分离株的相应基因序列进行聚类分析，其核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为92.1％～98.8％和94.6％～100％。【结论】序列同源性比较说明CTV CPG具有高度保守性，同时系统进化分析表明收集到的野生CTV分离株与国外分离株分属5大类群，具有较复杂的亲缘关系。     

烟草抗马铃薯Y病毒病相关基因NtPsaN的克隆及表达分析

【目的】从高抗PVY烟草品种VAM中克隆抗病相关基因,分析该基因的序列特征、进化关系和表达特性,研究其在烟草抗PVY防御反应中的作用,为培育抗PVY烟草新品种奠定基础。【方法】利用SSH结合cDNA芯片筛选出来的病害诱导特异表达基因片段,通过RACE技术克隆烟草抗病相关基因;生物信息学分析该基因保守结构域以及序列特征;采用MEGA4.0软件构建系统进化树;利用实时荧光定量RT-PCR技术研究该基因的表达特性。【结果】克隆了1个烟草抗病相关基因,命名为NtPsaN,该基因具有PsaN基因家族保守结构域,OFR长度507bp,编码168个氨基酸;构建了PsaN亚基系统进化树;实时荧光定量RT-PCR结果显示接毒之后该基因表达与不接毒对照相比有明显上调趋势。【结论】克隆得到一个烟草PVY抗病相关基因NtPsaN,其表达受PVY侵染诱导,该基因可能在烟草抵御PVY病害侵染过程中起重要作用。     

PVYN与PVYO病毒RT-PCR快速检测体系研究

 马铃薯Y病毒（PVY）是侵染马铃薯的重要病毒之一，严重影响马铃薯的生产。本文通过对PVY病毒N株系（PVYN）与O株系（PVYO）的基因序列进行比较，在其外壳蛋白同源区设计一对通用引物，建立了PVY病毒的RT-PCR检测体系。另外在N株系与O株系同源区设计一条3′引物，选择N株系与O株系差异区设计两条5′端引物，建立了可鉴定PVYN与PVYO的复合RT-PCR体系。这个体系的建立，对于马铃薯脱毒苗的检测与PVY病毒的调查及病理研究都具有一定的应用价值。     

CP基因3'端短片段介导的对马铃薯Y病毒的抗性

【目的】探明马铃薯Y病毒脉坏死株系（PVYN）CP基因3′端序列短片段的不同结构转基因诱导转基因植物产生RNA介导抗性的有效性。【方法】以PVYN的CP基因cDNA 3′端202 bp片段构建非翻译的正向重复和反向重复结构的植物表达载体转化烟草。【结果】攻毒试验表明前者没有一例转基因植株表现为抗病，而转化反向重复结构的转基因植株82.8%表现近似免疫的高度抗病型，Southern印迹杂交证明目的基因已整合到烟草基因组，Northern印迹杂交结果显示反向重复结构转基因植物的抗病性与RNA的表达量呈现负相关。【结论】抗病性是RNA介导的病毒抗性。3′端短片段诱导产生的转基因抗病株比例比5′端短片段诱导产生的高。     

侵染西番莲的夜来香花叶病毒的分子鉴定及特异性检测

【目的】鉴定福建果园西番莲上的夜来香花叶病毒(Telosma mosaic virus,Te MV),并建立用于该病毒特异性检测的分子快速检测方法,为该病毒的防治提供参考依据。【方法】采用血清学检测、电镜观察、通用简并引物RT-PCR、特异性引物RT-PCR对福建西番莲样品进行病毒检测,并对阳性样品的PCR产物进行克隆、测序;根据已报道的夜来香花叶病毒基因序列和本研究的序列测定结果,设计一对用于扩增Te MV外壳蛋白(coat protein,CP)基因全长的特异性引物,通过反应条件优化,建立该病毒的特异性RT-PCR检测方法;序列测定结果利用BLAST程序和DNAMAN软件进行比对,同时对获得的CP基因序列采用Mr Bayes软件的贝叶斯法(Bayesian inference,BI)构建系统发育树并进行系统发育分析。【结果】血清学检测发现,一株表现有花叶、皱缩症状的西番莲样品与马铃薯Y病毒属(Potyvirus)通用抗体反应呈阳性;电镜观察结果表明,该株疑似带毒样品中含有大小约750 nm×12 nm的弯曲线状病毒粒子;Potyvirus通用简并引物RT-PCR从该样品中扩增到一条与预期大小相符的目的片段,克隆、测序获得长度为680 bp的序列,该序列与已报道的Te MV核苷酸序列一致性最高(98.2%)。特异性引物扩增获得的CP基因序列全长为816 bp(命名为BXGFJ-13分离物),与已报道的Te MV核苷酸序列、氨基酸序列一致性分别为86.2%—98.4%和88.2%—97.8%。系统发育分析结果表明,13个Te MV分离物共形成3个类群,相同地区或寄主来源的分离物优先相聚成簇,表现出很强的地理和寄主特异性。本研究获得的BXGFJ-13分离物与中国广西分离物(KJ789129)先以较高的后验概率聚为一个分支,再与泰国2个分离物(AM409188、AM409187)聚为第2类群(Group II),表明其在系统发育关系上与中国广西分离物的亲缘关系最近。利用特异性引物Te MV-CPf/Te MV-CPr建立的RT-PCR方法,具有良好的特异性,仅能从感染Te MV的西番莲样品上扩增出目的片段,而从黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、甜菜花叶病毒(Beet mosaic virus,Bt MV)、大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)、虎眼万年青花叶病毒(Ornithogalum mosaic virus,Or MV)、洋葱黄矮病毒(Onion yellow dwarf virus,OYDV)、东亚西番莲病毒(East Asian Passiflora virus,EAPV)等其他病毒样品及阴性对照上均未扩增出目的片段。灵敏度测定结果显示,该方法能从稀释102倍的RNA上扩增出目的片段。【结论】根据国际病毒分类委员会(ICTV)关于Potyvirus病毒不同成员的分类标准,同时结合血清学检测、电镜观察结果,证实福建果园表现花叶、皱缩症状的西番莲上携带有Te MV;建立的特异性RT-PCR方法能够用于Te MV的快速检测。     

马铃薯Y病毒衣壳蛋白抗原表位分析及其快速ELISA检测方法的建立

【目的】马铃薯Y病毒（potato virus Y,PVY）是影响马铃薯产量和品质的主要病毒之一,目前尚未发现有效的防治药剂,脱毒种薯的应用是预防PVY危害的主要防治措施。建立灵敏度高、特异性强的PVY快速检测方法,为脱毒种薯质量控制提供技术支撑。【方法】将PVY衣壳蛋白（coat protein,CP）分段表达为有重叠部分的小段多肽,以其为抗原通过Western blot分析PVY-CP的抗原表位。以P/N值最大为标准,通过常规双抗夹心ELISA（DAS-ELISA）对识别不同抗原表位的单克隆抗体（monoclonal antibody,MAb）进行配对试验,筛选一组检测效果最优的配对单克隆抗体,并确认捕获抗体和检测抗体。通过方阵滴定法确定捕获抗体及检测抗体的最佳工作浓度,通过控制变量法确定检测抗体与抗原的最佳共同孵育时间。以不同浓度的PVY-CP蛋白为抗原,检验快速DAS-ELISA的灵敏度。以感染不同病毒的马铃薯样品为抗原,检测快速DAS-ELISA的特异性。同时通过快速DAS-ELISA与RT-PCR检测50份田间采集的疑似感染PVY的马铃薯样品,将二者结果相比较检验检测方法的符合率。运用建立的快速DAS-ELISA对不同株系PVY感染的马铃薯样品进行检测。【结果】利用PVY-CP的6条分段表达多肽筛选到一组能进行DAS-ELISA的配对单克隆抗体（9G6和3D3）,并以这对单抗为基础建立了PVY快速DAS-ELISA检测方法。以9G6为捕获抗体包被酶标板,检测抗体3D3经辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）标记后以2 μg·mL^-1的工作浓度与抗原在37℃共同孵育5 min。该检测方法检测限为0.5 ng·mL^-1,特异性分析结果显示该法仅在检测感染PVY的马铃薯样品时呈阳性反应,检测马铃薯S病毒（potato virus S,PVS）、马铃薯M病毒（potato virus M,PVM）、马铃薯卷叶病毒（potato leaf-roll virus,PLRV）等其他常见马铃薯病毒样品均呈阴性反应。通过快速DAS-ELISA与RT-PCR同时对50份田间采集的马铃薯样品进行检测,有48份样品检测结果一致,符合率达96%,且对PVY^N及PVY^O样品检测结果均呈阳性。【结论】建立的PVY检测方法灵敏度高、特异性强,30 min即可完成检测,方便快捷,为PVY的高通量检测、脱毒种薯的生产提供了关键技术支持。     

柑橘碎叶病毒外壳蛋白基因的克隆和序列分析

 【目的】了解中国CTLV分离物外壳蛋白（CP）基因的变异情况。【方法】对来源于中国不同地区、不同寄主品种的18个柑橘碎叶病毒（CTLV）分离物进行RT-PCR、克隆、测序,应用DNAMAN软件进行序列分析。【结果】18个分离物的CP基因全长714 nt, 推导的CP含237个氨基酸。CP核苷酸序列及推导的氨基酸序列最大相似性分别为88.5％～99.9％和91.1％～99.6％。与核苷酸序列G289→A或C、A409→C和G414→T的单碱基突变相对应,CTLV外壳蛋白第97、137、138位氨基酸在强、弱毒分离物之间存在差异,多数弱毒分离物为Q97或K97、Q137、H138,而多数强毒分离物为E97、R137或K137、Q138。在根据CP氨基酸序列构建的系统进化树上,本研究获得的18个CTLV分离物至少可以划分为2个组群,其中,在指示植物上表现较弱症状的多数(4/6)CTLV分离物划分在第Ⅰ组群,多数(10/12)CTLV强毒分离物划分在第Ⅱ组群。【结论】CTLV外壳蛋白基因相对保守,其第289、409、414位碱基在强、弱毒分离物之间存在差异,可能与病毒致病性相关。     

番红花种球中虎眼万年青花叶病毒的分子鉴定与序列分析

【目的】对一批荷兰进境番红花种球(Crocus sativus)进行病毒鉴定,以防止危险性病毒传入危害。【方法】根据已报道的马铃薯Y病毒科(Potyviridae)通用引物(Sprimer和M4T),采用RT-PCR方法对一批番红花种球样品进行检测,取其中一个RT-PCR产物进行克隆测序,利用Gen Bank上的基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool,BLAST)和MEGA 6中的基于对数期望的多重序列比较(Multiple Sequence Comparison by Log-Expectation,MUSCLE)进行序列比对分析,并根据外壳蛋白基因(coat protein,CP)序列利用最大似然法(maximum likelihood method)进行系统发育分析。【结果】RT-PCR检测结果显示该批样品扩增到一条约1.7 kb的预期大小片段,说明该批番红花种球样品中存在Potyviridae科病毒。测序获得长度为1 666bp的序列(命名为2677-NL),含有部分核内含体b基因(nuclear inclusion b,NIb)、完整的CP和3′端非编码区(3′-UTR),其核苷酸序列与虎眼万年青花叶病毒(Ornithogalum mosaic virus,Or MV)的SW3.3分离物具有最高序列一致性(99.6%),与Or MV参考基因组序列(Reference genomic sequences,Ref Seq;NC_019409)的序列一致性为99.1%。该分离物的CP与6个Or MV印度分离物(JQ686722、JQ686720、JN692498、JN692497、JN692496、JF682235)的核苷酸和氨基酸序列一致性分别为71.5%—77.3%和65.7%—79.7%,与其他32个Or MV分离物的核苷酸和氨基酸序列一致性分别为77.9%—99.5%和82.9%—99.2%。基于CP进行的系统发育分析表明,Or MV可分为两个类群,而2677-NL与5个澳大利亚分离物(JQ807995、JQ807996、NC_019409、AF185964、AF185965)相聚成簇,表明其在系统发育关系上与Or MV澳大利亚分离物的亲缘关系最近。【结论】根据国际病毒分类委员会(ICTV)关于Potyviridae科病毒种类的分类标准,2677-NL为Or MV的一个分离物,证实该批番红花种球受到Or MV的侵染。这是世界上首次在番红花中发现Or MV的报道。