河北省马铃薯Y病毒株系分子鉴定及其RT-PCR检测

根据马铃薯Y病毒(PotatovirusY,PVY)的外壳蛋白基因序列,设计合成了一对寡核苷酸引物,从感染PVY的马铃薯田间病叶组织中提取出病毒的RNA,进行cDNA合成及PCR扩增,得到一条长度约800bp的特异PCR扩增产物,与理论设计的基因片段大小一致,本试验建立了快速、灵敏、简便的PVY检测的方法。将RT-PCR扩增产物克隆到质粒pGEM-T上,并进行了序列分析。结果表明,克隆的cDNA片段由801个核苷酸组成,编码267个氨基酸组成的理论分子量为29kD蛋白,与PVY外壳蛋白的大小一致,与基因库登记的代表性株系相比,它们之间的核苷酸序列同源性为89 6%～98 8%,氨基酸序列的同源性为93 3%～98 5%,说明PVYCP基因具有高度的保守性(记为PVY-HBEI),与国内报道的PVY-CHU、PVY-ZHJ和PVY-ZHOU株系的氨基酸序列同源性分别为96 6%、98 5%和97 8%,与PVYN和PVYO株系的氨基酸序列同源性分别为93 6%和97 8%,从分子水平上确定PVY-HBEI归属于普通株系(PVYO株系)。     

芜菁花叶病毒两分离物的CP基因及HC-Pro基因的比较

芜菁花叶病毒杭州分离物(HZWT)和昆明分离物(YNQC)在7种寄主上的致病性相似.利用IC-RT-PCR对两分离物的CP和HC-Pro基因进行PCR扩增,扩增产物克隆后进行序列测定,CP基因序列长度均为864个核苷酸,编码288个氨基酸;HC-Pro基因序列长度均为1374个核苷酸,编码458个氨基酸.两分离物的CP和HC-Pro基因的核苷酸同源率分别为99.3%和94.5%,氨基酸同源率分别为100%和98.7%.HZWT和YNQC的CP基因与已报道的TuMV其他分离物的核苷酸序列同源率为89.2%～99.3%,氨基酸同源率分别为88.5%～99.7%;HC-Pro基因与TuMV其他分离物的核苷酸序列同源率分别为80.6%～97.0%,氨基酸同源率分别为95.0%～99.6%.     

采用多基因联合方法鉴定福建长乐和福清产区马铃薯Y病毒株系组成

【目的】马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)是马铃薯生产上危害较为严重的病毒,也是制约马铃薯可持续发展的主要病毒之一。论文旨在开发一套简便、准确、快速的PVY分子鉴定技术,并采用该技术及时查明福建省部分产区PVY病害的发生、分布及PVY株系组成。【方法】采用ELISA方法对采自福建省长乐市、福清市马铃薯种植区疑似受PVY感染的样品进行检测,并根据文献报道的PVY P1、VPg和CP基因保守区设计3对简并引物,对ELISA检测后的阳性样品进行基因扩增、克隆,并将获得的序列进行核苷酸序列一致性、重组位点、基因型分布和系统发育分析。【结果】ELISA检测结果表明,17份样品中有13个样品与PVY抗体呈阳性反应,其他呈阴性反应。13个阳性样品均能成功扩增出3个与P1、VPg和CP基因预期大小一致的特异片段。BLAST比对分析显示P1、VPg和CP基因与文献报道的已知PVY分离物的核苷酸序列一致性分别为72%—99%、85%—99%和88%—99%。P1、VPg和CP 3个基因联合序列分析显示,FQ01分离物与PVY~(N-Wi)株系的核苷酸序列一致性最高,FQ08分离物与PVYE株系的核苷酸序列一致性最高,CL01、CL02、CL05和CL13 4个分离物与PVY~(NTN-NW)株系SYR-I型的核苷酸序列一致性最高,CL03、CL04、FQ02、FQ06、FQ09、FQ11和CL12 7个分离物与PVY~(NTN-NW)株系SYR-II型的核苷酸序列一致性最高。重组分析显示,除CP基因外,长乐市和福清市两个产区的PVY分离物的P1和VPg基因中均检测到显著的重组信号。基因型统计分析结果显示,长乐产区的P1基因为N型(60%)和N×O重组型(40%),VPg基因均为N×O重组型,而CP基因均为O型,而福清产区的P1基因为N型(25%)和N×O重组型(75%),VPg基因为N×O重组型(87.5%)和O型(12.5%),而CP基因除了一个分离物为N型外,其他均为O型。系统发育分析显示分离物FQ01与PVYN-Wi株系聚为一簇,FQ08与PVYE株系聚为一簇,CL01、CL02、CL05和CL13与PVY~(NTN-NW)株系SYR-I型聚为一簇,CL03、CL04、FQ02、FQ06、FQ09、FQ11和CL12与PVY~(NTN-NW)株系SYR-II型聚为一簇,表明在系统发育关系上,分离物FQ01与PVYN-Wi株系最近,FQ08与PVYE株系最近,CL01、CL02、CL05和CL13与PVY~(NTN-NW)株系SYR-I型最近,CL03、CL04、FQ02、FQ06、FQ09、FQ11和CL12与PVY~(NTN-NW)株系SYR-II型最近。【结论】PVY在福建省长乐市、福清市马铃薯种植区普遍存在,重组株系已成为田间的主流株系,且PVY~(NTN-NW)已成为优势重组株系。     

贵州烟田马铃薯Y病毒优势株系全序列克隆及系统进化分析

为了解马铃薯Y病毒在贵州烟田的发生和流行规律,对2013—2015年采集到的贵州省多个烟区呈现典型茎脉坏死症状的疑似受马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)侵染的烟草样品进行单斑分离和病毒鉴定,并以现有PVY序列信息为参考,设计了4对PVY特异引物,经过RT-PCR扩增、T载体连接、序列测定以及序列拼接,并利用MEGA软件进行系统进化分析。结果发现PVY福泉分离物(PVY Fuquan isolate,PVY-FQ)和PVY大方分离物(PVY Dafang isolate,PVY-DF)为优势株系并获得了PVY-FQ和PVY-DF的全基因组序列。PVY FQ整条基因组由9 699个碱基组成,编码多聚蛋白的开放阅读框位于第188~9 373nt;PVY DF整条基因组由9 706个碱基组成,编码多聚蛋白的开放阅读框位于第190~9 375nt。2条序列的基本特征与已报道PVY基因组一致。对PVY-FQ和PVY-DF全序列与已报道PVY序列进行系统进化分析发现,PVY-FQ与PVY NTN株系具有较高的亲缘关系,而PVY-DF与PVYN具有较高亲缘关系。     

侵染烟草的黄瓜花叶病毒株系分化研究

根据已报道的黄瓜花叶病毒(CMV)外壳蛋白(CP)基因序列合成1对引物,对侵染烟草的黄瓜花叶病毒贵州分离物的病毒外壳蛋白基因进行基因扩增和序列分析。结果表明:40个CMV贵州分离物和CMV株系亚组ⅠB系列CP基因核苷酸相似性为95.1%~100.0%,与CMV株系亚组ⅠA系列CP基因核苷酸相似性为92.3%~98.2%,亚组ⅡCP基因核苷酸相似性为78.2%~80.5%。表明贵州CMV分离物与CMV株系亚组ⅠB系列同源性关系更密切,因而它们都属于CMV株系亚组ⅠB系列。     

青海省马铃薯Y病毒P1基因序列分析

【目的】本研究通过对不同PVY分离物基因的测序及分析,了解青海省PVY株系特点,进而对PVY病毒的分子检测和预防控制提供理论基础。【方法】采用RT-PCR扩增的方法,对青海省18个PVY的P1基因进行克隆测序和进化树分析。【结果】P1目的基因共825个碱基,编码275个氨基酸;经比对样品的P1基因序列,核酸一致率达90.3%～100.0%,其中Y-39、Y-47和Y-513个样品与其它样品有55～61个碱基的差异;试验样品与国内外已报道的PVY P1基因相比较,经进化树分组后,主要分为A、B、C 3组,其中A组包含了大部分来自青海的样品,是本地区的优势组群;而另一组4个样品的P1基因与本地优势组群有较大差异,且4个样品间也有一定的差异。通过与GeneBank中已上传的序列提供的信息相比对,发现14个样品的P1基因与PVY~(N-Wi)株系较近;其余4个样品与PVP~(NTN)株系较近。【结论】由P1基因分析表明,青海省马铃薯Y病毒株系具有地域特点,另外的4个样品说明青海PVY有可能是不同区域间种薯调运以及PVY本身重组特性而产生的。     

中国马铃薯Y病毒的检测鉴定及CP基因的分子变异

【目的】查明马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）病在中国的发生情况,及时、准确地鉴定出PVY并对其分子变异进行分析。【方法】采用ELISA 方法对采自中国14个省（直辖市）马铃薯种植区疑似受PVY感染的样品进行了检测,并对其中的部分材料镜检验证,然后根据CP基因序列设计1对简并引物针对随机选择感染PVY的14个省（直辖市）代表样品进行CP基因扩增克隆,将测序得到的序列进行分子变异分析,并使用贝叶斯法（Bayesian inference,BI）重建系统发育关系。【结果】ELISA检测结果表明,691份样品中220个样品与PVY抗体呈阳性反应,其余呈阴性反应;ELISA检测的阳性材料在透射电镜下均可观察到明显的风轮状内含体,14个PVY分离物均成功扩增出预期大小（约800 bp）的特异性片段,CP基因的核苷酸序列与已报道PVY不同株系的核苷酸序列一致性均在88%以上;在14个PVY分离物CP基因中共发现有29个多态性位点,其中6个简约信息位点,23个单一变异位点。系统发育分析结果显示,14个PVY分离物与PVYN:O株系相聚成簇,表明其在系统发育关系上,与PVYN:O株系的亲缘关系最近。【结论】PVY CP基因高度保守,但不同地区分离物也存在一定的分子变异,本研究可为今后了解PVY病毒病流行、变异趋势及其防治提供依据。     

甘蔗花叶病毒河南分离物HC-Pro基因的序列分析及其RNA沉默表达载体构建

采用RT-PCR方法从河南地区甘蔗花叶病毒(Sugarcane mosaic virus,SCMV)感染的玉米叶片中,克隆了辅助成分-蛋白酶基因(helper component.proteinase,HC-Pro).该基因长1 380 bp,编码460个氨基酸.序列比对表明.HC-Pro编码的氨基酸序列与北京、山东地区SCMV分离物的相似性分别达到97%和98%.而与以前数据库登录的河南分离物的相似性仅98%,说明河南地区SCMV可能发生了变异.选取长582 bp的HC-Pro片段,构建了表达发夹RNA的基因沉默双元表达载体pRNAi-HC-Pro(±),成功转化了农杆菌LBA4404.     

烟草(云烟87)NBS-LRR类同源抗病基因克隆及分析

[目的]克隆并分析烟草NBS-LRR类抗病基因的同源序列(RGAs),为采用同源克隆技术挖掘烟草抗病基因提供理论参考.[方法]从基于NBS-LRR类抗病基因保守序列设计的简并引物中筛选扩增效果较好的引物用于扩增烟草RGAs,采用DNAMAN 6.0翻译成氨基酸序列,并与已知的其他植物抗病基因进行聚类分析.[结果]克隆获得6条与参比抗病基因具有高度同源性的烟草RGAs,大小在500 bp左右,但仅有4条RGAs具有连续的开放阅读框(ORF)及编码NBS功能结构域的核苷酸序列,命名为TRGA-87-1~TRGA-87-4.这4个烟草RGAs编码的氨基酸序列均含有NBS类抗病蛋白的多个典型保守基序,与已知的多种植物抗病基因编码的氨基酸序列均具有较高的相似性,其中,与烟草相关抗病基因编码的氨基酸序列相似性最高,为97.00%~100.00%,与其他植物的抗病基因编码氨基酸序列相似性为29.00%~53.00%,这些序列可分为3个亚类,其中TRGA-87-2与烟草N和亚麻L6聚为一类(TRGAⅠ),属于TIR-NBS-LRR类;TRGA-87-3和TRGA-87-4与水稻Xa-1和番茄Mi聚为一类(TRGAⅡ),属于non-TIR-NBS-LRR类,TRGA-87-1与拟南芥RPM1聚成一类(TRGAⅢ),属于non-TIR-NBS-LRR类.[结论]同源扩增技术可用于烟草中抗病基因的克隆、功能分析及定位等研究.     

香蕉束顶病毒基因附加组分的克隆及序列分析

采用PCR的方法分别克隆了香蕉束顶病毒(BBTV)广东分离物NS株系和NSP株系的附加组分,将之命名为BT-NS和BT-NSP。序列分析发现,2个附加组分基因全长均为1 094 nt,其核苷酸的同源率为97.3%,编码氨基酸的同源率为98.4%;与BBTV台湾分离物附加组分S1、S2和越南分离物附加组分S3相比,BT-NS/NSP与S1的氨基酸序列相似率最高,与S2的相似率最低。每一附加组分的ORF均含有推导的与脱氧核苷酸结合的基序,具有潜在的复制酶活性。通过对BBTV编码复制酶基因组分的进化树分析发现,BT-NS/NSP与BBTV台湾附加组分S1的亲缘关系最近,与广东分离物NSP株系DNA组分1的亲缘关系较远。     

NtMAP70基因在烟草抗马铃薯Y病毒过程中的作用

为了探明微管结合蛋白70(MAP70)在抗马铃薯Y病毒(PVY)中的作用机制,克隆了烟草Nt MAP70基因的全长,并进行了生物信息学分析.利用实时荧光定量PCR研究了该基因在烟草不同时期和不同部位中的表达水平,结果表明,NtMAP70在烟草的各个生长期均有表达,且在根中的表达量最高.构建了基于双生病毒卫星诱导的烟草Nt MAP70的沉默载体,以中国番茄黄化曲叶病毒(TYLCCNV)为辅助病毒在烟草中沉默了该基因.与对照相比,在Nt MAP70基因沉默的烟草中PVY侵染速率明显减缓,病毒含量显著降低.     

河南省马铃薯Y病毒的分子检测与鉴定

利用RT-PCR技术对郑州市和信阳市的马铃薯Y病毒(potato virus Y,PVY)进行了鉴定。依据PVY p1基因序列设计合成1对引物,以带毒的马铃薯叶片总RNA为模板,RT-PCR扩增得到0.58kb的目的DNA片段,而健康对照无此片段。对PCR产物进行序列测定,Blast分析表明,该DNA序列与PVY N:O株系p1基因序列相似性可达99%,证明所得DNA片段确为PVY p1基因,从而建立了PVY的RT-PCR检测方法。在此基础上,从节省检测时间、优化反应程序及反应体系等方面进行了改进。     

PVYNTN-NW榆林分离物的全基因组序列测定与分析

【目的】马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY）是马铃薯病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus）代表成员,是马铃薯和烟草生产中分布最为广泛并造成严重经济损失的病毒之一。研究旨在揭示PVY榆林分离物ShX14的全基因组特征,并准确判断其株系分子类型。【方法】根据已经报道的PVY不同基因保守区设计11对简并引物,采用片段重叠法从感染 PVY的马铃薯病叶中扩增、克隆获得榆林分离物ShX14的全长序列,并对其序列特征、重组位点、系统发育关系等进行分析。同时,应用系统发育与性状关联分析（phylogeny-trait association analysis）评估PVY分离物与株系的关联性。【结果】测序获得的ShX14分离物核苷酸序列全长为9 724 nt（不含3′端的多聚腺苷酸尾）。该病毒基因组含有一个9 186 nt的开放阅读框,编码3 061个氨基酸的多聚蛋白（polyprotein）。在P3顺反子中+2相位上也发现由移码（reading frame shift）产生的PIPO蛋白。全基因组序列比较分析显示,ShX14分离物与HN2、SYR-NB-16分离物（PVY^NTN-NW株系SYR-I型）的核苷酸、氨基酸序列的一致性分别为98%-99%和98%-100%。该分离物的P1、HC-Pro/P3和CP基因的5′端均检测到显著的重组信号,重组位点分别位于2 318、5 674 和8 385 nt,与PVY^NTN-NW株系（SYR-I型）的重组位点相似。系统发育分析结果显示该分离物与HN2、SYR-NB-16分离物相聚成簇,表明其在系统发育关系上,与PVY^NTN-NW株系（SYR-I 型）的亲缘关系最近。系统发育分析与性状关联分析结果显示该分离物与PVY^NTN-NW株系（SYR-I 型）的关联系数（association index, AI）、简约分值（parsimony score, PS）和最大单系分支（maximum monophyletic clade, MC）3个统计检验均显著,表明其与PVY^NTN-NW株系（SYR-I型）存在显著的关联性。同时,应用多重RT-PCR成功扩增出约为1 000、600和400 bp的3个特异性片段,与PVY^NTN-NW株系（SYR-I型）的特异条带大小相一致。这些结果也进一步确定该分离物属于 PVY^NTN-NW株系（SYR-I型）。【结论】ShX14 分离物为N×O重组分离物,属于PVY^NTN-NW株系（SYR-I型）,为后续深入开展该分离物的生物学等研究奠定了基础。     

福建长汀小米椒病毒病的病原鉴定

1987—1988年从小米椒的主要产地长汀县采回具有花叶、叶片斑驳、皱缩、畸形.叶脉肿大、黄化、小叶和侧枝丛生等病株的标样189份,经5科10种鉴别寄主的传染性试验、血清学反应(酶联免疫吸附测试)和电子显微镜观察,鉴定出4种小米椒病毒病原:马铃薯 X 病毒(PVX),马铃薯 Y 病毒(PVY),烟草花叶病毒(TMV)和黄瓜花叶病毒(CMV).其中复合感染的样本占42.9%,病毒病原为 PVX,PVY 2种或 PVX,PVY,TMV 3种病毒的复合感染,其中以 PVX,PVY TMV 3种病毒感染占优势,为29.75%,是为害小米椒的主要毒源种类;单独浸染的样本88份,占46.6%,其中 PVX 占18.1%,PVY13.9%,TMV9.06%,CMV5.5%;未知病原样本20份占10.6%.     

青海省部分地区马铃薯Y病毒cp基因序列分析

马铃薯Y病毒(PVY)是危害我国马铃薯的主要病毒之一,其在自然条件下极易发生基因变异而产生株系分化现象。为揭示青海马铃薯Y病毒分离物cp基因的分子变异,利用RT-PCR方法扩增获得了16个马铃薯Y病毒分离物的cp基因序列,采用SDT、DANMAN、RDP和MEGA软件对其进行分子变异分析。序列一致率结果表明,16个分离物的核苷酸序列均为801个碱基,一致率为98.0%~100%,编码267个氨基酸,一致率为94.8%~100%。重组分析表明,16个分离物未发生基因重组。系统发育分析发现,11个分离物与PVY^N-Wi株系相聚成簇,表明其在系统发育关系上与PVY^N-Wi株系的亲缘关系最近,占被检出病毒分离物的68.7%;另外5个分离物与PVY^O株系相聚成簇,表明其在系统发育关系上与PVY^O株系亲缘关系最近;未发现PVY^C株系、PVY^N株系、PVY^E株系和PVY^NTN株系存在。     

马铃薯Y病毒的RT—PCR检测

通过两种方法提取了烟草病叶中PVY病毒的RNA,然后针对PVY~N的CP基因序列,设计合成了一对特异性引物,运用反转录PCR技术对提取的PVY－RNA进行了体外扩增,结果得到与预期大小相一致的780bp片段,而对照未得到任何产物,从而建立了运用RT－PCR手段检测植物中PVY的又一有效途径,并运用此方法对东北三省部分地区马铃薯种薯中PVY的带毒情况进行了检测。     

马铃薯Y病毒两分离物特性及其侵染寄主的超微结构比较研究

报道了马铃薯Y病毒两分离物的生物学和血清学特性、病毒粒体形态大小以及它们引起的寄主细胞病变特征等方面的差异.从山东省主要烟草和马铃薯种植区病毒样品中分离到两个马铃薯Y病毒分离物,分别为PVY-T 和PVY-P.两分离物在寄主植物上的症状表现、体外抗性、蚜传特性、血清学以及病毒粒体大小等方面存在着明显的差异.同时,这些结果与作对照的PVY标准株系PVYN 和PVYO相比较,初步推测分离物PVY-T属于PVYO株系 ,而P VY-P则属于PVYN.通过对受侵染寄主的细胞超微结构观察比较发现,这两种PVY分离物在寄主细胞内的分布特征、内含体以及与寄主互作后所引起的细胞病变也明显不同,这些可能成为区别PVY不同株系的依据之一.     

一株对TMV和PVY具有拮抗活性生防菌的筛选与鉴定

【目的】筛选对烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）和马铃薯Y病毒（Potato virus Y,PVY)具有显著拮抗活性的菌株。【方法】从山东诸城等植烟区采集烟草病毒病高发区健康烟株中烟100（Nicotiana tabacum var. Zhongyan 100）的根际土壤,分离抗TMV的活性菌株,通过生理生化测定和分子鉴定确定菌株。采用Real-time PCR技术定量检测该菌株对TMV和PVY的抑制作用进一步验证该菌株的抗病毒活性。田间试验进行3个处理,菌液与病毒混合,2 h后接种（I）,喷菌液2 h后接种病毒汁液（II）,接种病毒汁液2 h后喷施菌液（III）,以8%宁南霉素和肥皂水分别与等体积病毒汁液混合为阳性对照,以LB培养基与病毒汁液混合为空白对照。利用菌株发酵液对剪刀上病毒的钝化作用进行验证试验。【结果】筛选到的菌株通过枯斑寄主半叶法显示其对TMV的抑制效果达98%以上,命名为4A1,分子鉴定结果显示该菌株16S rDNA序列与Pseudomonas monteilii的16s rDNA序列同源率达到99%;菌株4A1为革兰氏阴性,氧化酶、淀粉水解VP、吲哚等反应为阴性,明胶液化、葡萄糖反应为阳性,能运动,确定该菌株为蒙氏假单胞菌（P. monteilii）。Real-time PCR检测结果显示其发酵液对TMV、PVY具有显著的抑制活性。田间试验结果显示,处理I可有效降低大部分病毒侵染,TMV和PVY发病率分别为5.3%和7.7%,病情指数分别为0.8和2.9;处理II可显著减少TMV和PVY的侵染几率,发病率分别为33.3%和36.7%,病情指数分别为4.2和6.0;处理III烟株发病率为95.0%和92.0%,病情指数为24.5和20.1;CK组TMV、PVY发病率分别为99.3%和95.4%,病情指数为别为38.6和45.1。菌株对剪叶工具的处理,钝化病毒效果可达95%以上,防效显著高于其它处理。【结论】在烟叶生产上,该菌株可以作为生产工具的生物消毒剂和抗病毒剂。     

广西百色烟草主要病毒病种类鉴定

[目的]分析鉴定广西百色烟草主要病毒病种类。[方法]2006～2010年连续5年对百色市烤烟主产区697个烟草病毒样品和132份土壤样品及126份蚜虫（Myzus persicae）样品进行多重RT-PCR检测。[结果]在所有采集的烟草样品中多数能检测到烟草病毒的存在,检出率为99.0%;检出烟草花叶病毒（TMV）病样521个,检出率为74.8%;黄瓜花叶病毒（CMV）病样149个,检出率为21.4%;马铃薯Y病毒（PVN）检出率为37.7%,共263个。其中,TMV与CMV混合侵染的有56个,检出率为8.0%;TMV与PVY混合侵染的166个,检出率为23.8%;CMV与PVY混合侵染的有131个,检出率为18.8%;TMV、CMV和PVY共同侵染的有55个,检出率为7.9%。132份植烟土壤中均含有TMV病毒,检出率为100.0%,而PVY和CMV均未测出。126份蚜虫样品中,12份蚜虫中检测出只有PVY存在7,份蚜虫中只有CMV存在7,7份蚜虫中同时存在PVY和CMV。[结论]危害百色烟草病毒主要为TMV、PVY和CMV,其中TMV初侵染源为土壤中存在的TMV病毒,而PVY和CMV的初侵染源主要为迁入的带毒蚜虫。     

山西省马铃薯Y病毒pl基因的克隆与序列分析

依据马铃薯Y病毒基因组序列,设计合成了1对引物,以从山西省获得的带毒马铃薯叶片总RNA为模板,通过RT-PCR扩增得到852 bp的基因片段并进行了序列测定。BLAST分析表明,该DNA序列与PVY N:O株系pl基因序列相似性最高可达99%。