凡纳滨对虾中发光坎氏弧菌的分离、鉴定及致病性

为研究凡纳滨对虾死亡的致病机理,实验采用TCBS培养基从濒死凡纳滨对虾肝胰腺分离到浅绿色、直径3～7 mm的发荧光菌落;革兰氏染色为阴性短杆菌;经API20E鉴定,分离株PvL-1与坎氏弧菌参考菌株CAIM249相似度为90%;fitZ序列与坎氏弧菌CP020076相似度为99.31%;gapA序列与坎氏弧菌EF596552相似度为98.89%;采用坎氏弧菌种特异性引物对PvL-1进行PCR分析,可扩增出坎氏弧菌种特异性片段,不能扩增出轮虫弧菌和哈维氏弧菌特异性片段,上述结果表明PvL-1为坎氏弧菌成员。分离菌株在10%脱纤维羊血平板呈β溶血,脱脂奶粉平板出现明显透明圈,表明存在溶血性和胞外蛋白酶活性。分析了PvL-1的急性肝胰腺坏死病、溶血素基因、菌毛基因和其他毒力基因,表明PvL-1具有AP4、TLH、vcahHly、flaC、mukF、gloB、sodB和esrB等毒力基因。PvL-1可使健康凡纳滨对虾发病死亡,濒死凡纳滨对虾与自然发病虾呈现类似症状,对凡纳滨对虾半数致死浓度(LD50)2.94×104 CFU/尾;病理组织观察发现,人工感染发病凡纳滨对虾肝胰腺小管细胞脱落、崩解、血细胞浸润等,与自然发病凡纳滨对虾病理特征相同。研究表明,本次实验分离到可发光的坎氏弧菌PvL-1,对凡纳滨对虾有较强致病性,拓展了对凡纳滨对虾发光坎氏弧菌的认知。     

拟态弧菌OmpU抗原表位的预测与多表位疫苗分子的设计

以拟态弧菌安徽分离株ＯｍｐＵ基因序列为基础，应用ＤＮＡＳｔａｒＰｒｏｔｅａｎ软件联合采用多种方法对ＯｍｐＵ的二级结构、柔性、亲水性、表面可能性和抗原指数等方面进行分析，预测ＯｍｐＵ的抗原表位，并以此设计多表位疫苗分子序列。结果表明，拟态弧菌ＯｍｐＵ至少含有９个Ｂ细胞表位，其中第２４～３１、５６～６６、９３～１１１、１２３～１２９、 １８３～１９８、２５３～２５８和２７５～２８７共７个区段的平均抗原指数较高。使用ＡＡＹ接头以ｅｐｉｔｏｐｅ５－ｅｐｉｔｏｐｅ７－ｅｐｉｔｏｐｅ２－ｅｐｉｔｏｐｅ６－ｅｐｉｔｏｐｅ３－ｅｐｉｔｏｐｅ４－ｅｐｉｔｏｐｅ１排列方式串联的多表位序列最接近原蛋白构象，各表位间相对独立，抗原性参数也较好，可作为研制多表位疫苗的候选分子序列。     

养殖牙鲆弧菌病病因菌初步研究

１９９８年７月自荣成市寻山水产集团总公司养鱼场养殖牙鲆病死鲆体内分离到１株细菌，经人工感染试验证明是鲆菌病病原菌，该菌主要特征为：革兰氏阴性，弧状，以极生单鞭毛运动，氧化酶阳性，发酵葡萄产酸不产气，不产生Ｈ２Ｓ，不产生色素，生长温度范围１０－４２℃，pH范围６－１０，盐度范围０.5-6,经Ｂiolog Microstation System鉴定为河川弧菌－Ｉ，该菌株对环丙沙星，氟哌酸，利福平，呋喃唑酮，呋喃妥因，红霉素，链老素等药物敏感.     

养殖大黄鱼低温弧菌病病原的研究

浙江沿海深水网箱养殖大黄鱼冬天发生大量死亡，从病鱼体内分离出致病力较强的细菌GYC0227。人工感染试验证实这株菌为大黄鱼的病原菌。对细菌进行了形态、生理生化特性的测定，并进行了16S rRNA分子鉴定。PCR扩增获得了GYC0227菌株大小约1．5kb的16S rDNA部分基因片段，产物经回收纯化，克隆到pMD18-T载体，转化大肠杆菌TG1，对阳性克隆子进行酶切及PCR鉴定，并测序，将测定的序列递交NCBI进行BLAET同源序列比对，与溶藻弧菌的标准菌株的16S rDNA具有96％的同源性。结合菌株的生理生化特性，GYCD227菌株属于溶藻弧菌。该菌适应于低温生长，生长温度范围为7—25℃，并测定了其对14种药物的敏感性。     

海水网箱养殖高体Shi弧菌病致病菌研究

从患病高体Ｓｈｉ病灶上分离到７株可疑致病菌，人工感染试验证明，菌株９５－５－３和９５－５－５为强毒菌株，这２株菌进行人工感染，死亡率均为１００％，症状与自然发病相似。这２株菌的特征一致，根据形态有主生理生化特征，应归入哈维氏弧菌。药敏实验的结果表明，磺胺类药物和先锋必素对致病菌有较强的抑制作用。     

海水网箱养殖高体鱼师弧菌病致病菌研究

从患病高体鱼师病灶上分离到７株可疑致病菌，人工感染试验证明，菌株９５－５－３和９５－５－５为强毒菌株，这２株菌进行人工感染，死亡率均为１００％，症状与自然发病相似。这２株菌的特征一致，根据形态有主生理生化特征，应归入哈维氏弧菌。药敏实验的结果表明，磺胺类药物和先锋必素对致病菌有较强的抑制作用。     

杂色鲍幼苗“急性死亡脱落症”病原菌分析

从“急性死亡脱落症”发病期的杂色鲍幼苗体内和病苗附着的薄膜上，共分离到4株优势菌，即NA0301、NA0302、NA0303和NA0304。经人工浸泡感染实验证明，从病幼苗体内和苗附着的薄膜上分离到的优势菌株NA0301和NA0302是杂色鲍幼苗的致病菌，它们均为革兰氏阴性、短杆状、极生鞭毛，能运动。常规生理生化和Biolog细菌鉴定系统测试结果表明，菌株NA0301与溶珊瑚弧菌（Vibrio coralliilyticus）的亲缘关系最近，而菌株NA0302与溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）的亲缘关系最近。为了进一步确定它们的分类学地位，分别测定了溶珊瑚弧菌和溶藻弧菌的16S rDNA序列，分析相关细菌相应序列的同源性，并构建系统进化树。结果表明，菌株NA0301与溶珊瑚弧菌的亲缘关系最近，菌株NA0302与溶藻弧菌的亲缘关系最近。因此，菌株NA0301和菌株NA0302分别鉴定为：溶珊瑚弧菌和溶藻弧菌。[中国水产科学，2006，13（4）：655—661]     

致病性哈维氏弧菌溶血素基因克隆及其检测

从山东沿海的发病鲈鱼（Lateolabrax japonicus）分离到1株致病性哈维氏弧菌（Vibrio harveyi），从该菌的染色体DNA扩增出一条长约1．4kb的特异性片段。DNA序列分析表明，该克隆片段含有完整的1254bp溶血素基因，该溶血素基因与哈维氏弧菌VIB645的溶血素基因VhhA和VhhB的相似性分别为99．0％和98．5％；与副溶血弧菌（V．parahaemolyticus）热稳定性溶血素基因（TDH）的相似性为74．5％；与拟态弧菌（V．mimicus）、创伤弧菌（V．vulnificus）、霍乱弧菌（V．chderae）磷脂酶基因的序列相似性分别为57．4％、59．2％、53．0％；与最小弧菌、创伤弧菌、霍乱弧菌、霍氏弧菌（V．hollisae）、河流弧菌（V．tguvialis）、鳗弧菌（V．anguillarum）的溶血素基因的相似性仅为19．9％～24．8％。根据溶血素基因的保守区段，设计了1对特异引物。分析表明，该引物能特异检测哈维氏弧菌。其可检测的DNA最小量为0．001ng。用该方法对55株不同来源的患病鱼分离的疑似病原菌进行检测，结果检出8株哈维氏弧菌，检出率为14．55％，从健康动物中检出数占所检弧菌数的6．25％，海洋环境为10．53％，海水养殖环境为26．53％，表明哈维氏弧菌在不同的海水环境及健康海洋动物中普遍存在，在养殖水体中的数量高于其他海水环境。     

一株凡纳滨对虾病原菌的分离、鉴定及其致病力分析

从患病凡纳滨对虾肝胰腺中分离出菌株20100612001,经人工感染实验证实,该分离菌株对凡纳滨对虾的半数致死量为1.44×106CFU/ml。形态学观察和革兰氏染色表明,该菌株为革兰氏阴性,无芽孢,有一根端极鞭毛;呈球杆状、球状、棒状或梨状且有两极浓染现象;在2216E培养基上为透明或半透明的圆形菌落,而在TCBS选择性培养基上为绿色或蓝绿色菌落。经Biolog碳源利用反应、脂肪酸气相色谱分析得出,该菌株与副溶血弧菌、需钠弧菌等的生理生化特性最相似;16SrD-NA序列测定表明,该菌株与弧菌属中几株病原菌的同源性均达到98.9%以上。在分子进化树中该菌株与副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus的进化地位最接近。综合上述实验结果分析得出,该细菌分离物为副溶血弧菌。     

对虾养殖体系中细菌群体感应抑制菌株的筛选及其特性初步研究

从对虾养殖环境及肠道内筛选能够抑制细菌群体感应的活性菌株,并探讨了影响菌株活性的环境因素及其对病原坎氏弧菌(Vibrio campbellii)毒力基因表达的影响。采用滤纸片法和高通量法对分离出的纯化菌株进行筛选,获得活性菌株。评估不同培养时间和盐度对活性菌株降解N-酰基高丝氨酸内酯类(AHLs)信号分子能力的影响,并检测活性菌株粗提物对坎氏弧菌毒力基因tox R和tlh m RNA表达的影响。分离得到2株活性菌株DC13和RS5,经16S r RNA基因序列分析,初步鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和巨大芽孢杆菌(B.megaterium)。AHLs信号分子对活性菌株生长无显著性影响(P0.05)。菌株DC13培养24 h后降解AHLs信号分子能力达到最大值,菌株RS5培养12~48 h降解AHLs信号分子能力无显著变化。盐度10~30时对菌株DC13降解AHLs信号分子能力无显著性影响,但是对菌株RS5降解AHLs信号分子能力影响显著(P0.05)。活性菌株粗提物的添加使坎氏弧菌毒力基因tox R的表达上调,而毒力基因tlh的表达下调。     

嗜水气单胞菌J-1株丝氨酸蛋白酶基因克隆与序列分析

根据已发表的气单胞菌胞外蛋白酶基因核苷酸序列，设计和合成了一对引物，以嗜水气单胞菌AhJ—1的基因组DNA为模板，通过PCR技术，扩增到约900bp的丝氨酸蛋白酶基因片段，并克隆到质粒载体pGEM—T中进行测序和分析，结果表明扩增的丝氨酸蛋白酶基因片段与已发表的嗜水气单胞菌丝氨酸蛋白酶Ahe2的同源性有87％，扩增片段编码343个氨基酸，推测的分子量为35700，计算机软件分析表明编码的氨基酸有较高的抗原性，可作为核酸疫苗的侯选基因片段。     

锦鲤源铜绿假单胞菌的分离鉴定及药敏试验

对从发病锦鲤分离出的病原菌主要形态与生理生化特性、16S rRNA基因序列及耐药特性等进行了研究,旨在为锦鲤疾病防治提供理论依据,对铜绿假单胞菌的进一步研究提供基本资料。发病锦鲤体长37~42 cm,体重1.5~2.0kg,眼球脓肿凸出,鳃丝被轻微腐蚀,其上可见附着物,肛门红肿并伴有黄色粘液流出。健康锦鲤体长7~10cm,体重(25±3)g。分离到的1株形态一致优势生长菌株（记为HL2）呈现圆形光滑、边缘整齐、中央隆起、略透明、乳白色,直径约1.4mm。分离菌经革兰氏染色镜检,均为革兰氏阴性、短杆状。肌肉注射感染后,供试健康锦鲤14d内全部死亡,并在试验后期注射部位轻微出血,眼球周边有白浊及化脓的现象。HL2有运动性,精氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶阳性,苯丙氨酸脱羧酶阴性,发酵麦芽糖、甘露醇、蔗糖、半乳糖等,不发酵侧金盏花醇与阿拉伯糖等。分离株HL2的序列长度为1461bp(GenBank登录号为KF413420),在系统发育树上与铜绿假单胞菌（KC959478）聚为一支。头孢曲松、卡那霉素、四环素等35种药物有效抑制HL2,庆大霉素、强力霉素、头孢拉定等5种药物具有一定的抑菌作用,青霉素G、氨苄西林、头孢唑林等15种药物无效。使用抗生素时必须更加科学、合理、有效;从药物选择、使用剂量、用药疗程等方面着手,以减少耐药菌株的产生。     

网箱养殖沉积环境中硫氧化菌的分离鉴定及生长特性

从网箱养殖区沉积物中分离硫氧化细菌,并研究其生长特性。从以硫代硫酸钠为唯一能源底物的培养基中分离得到一株硫氧化菌B1-1,经过平板菌落形态观察及其形态学特征研究,并结合16S rRNA基因序列分析及分子系统发育树的构建结果,确定菌株的种类。结果表明,菌株B1-1呈革兰氏阴性,短杆状,鉴定为Halothiobacillus hydrothermalis(GenBank登录号为KU362926)。在28℃、初始pH=8、150 r/min培养条件下,细菌在12 h进入对数生长期,36 h开始氧化硫代硫酸盐(S_2O_3~(2-)),至60 h培养液p H下降到4.8,S_2O_3~(2-)浓度从最初的2.28 g/L降到0.36 g/L,氧化率达84.2%。     

枯草芽孢杆菌B2的生长及其对仿刺参的益生特性

从大连湾地区健康的仿刺参养殖池塘沉积物中分离得到一株芽孢杆菌菌株B2,经16SrDNA鉴定以及形态学分析确定其为枯草芽孢杆菌。该菌株生长适宜温度为15~35℃,适宜pH为6~8,适宜盐度为30~50。电镜观察发现,枯草芽孢杆菌B2周围有明显可见的芽孢。枯草芽孢杆菌B2可产淀粉酶和蛋白酶,但不具有产脂肪酶的能力。将枯草芽孢杆菌B2按照仿刺参体质量的0.1%、0.2%和0.3%配成不同密度的菌液,添加至饲料中,投喂7d后发现,该菌株可有效提高仿刺参肠道内的消化酶以及体腔液中多种非特异性免疫酶的活性。结果表明,枯草芽孢杆菌B2可作为益生菌剂的基础菌株添加至仿刺参饲料中。     

齐口裂腹鱼维氏气单胞菌１６ＳｒＤＮＡ序列分析

报告齐口裂腹鱼病原菌的检测和生物学特性。从齐口裂腹鱼肠道中分离出菌株Spc0408, 采用常规形态特征的观察、生理生化试验、结合16SrDNA基因序列分析对其进行鉴定并构建系统发育树。该菌为革兰氏染色呈阴性,短杆形,无芽孢。生化鉴定结果显示具该菌有动力性,H2S、尿素阴性、不发酵木糖、鼠李糖、山梨醇等;β-半乳糖苷酶、葡磷胨水、枸橼酸盐阳性等。菌株16SrDNA的长度为1443 bp,登录号为JF929912,其和Genbank中多株维氏气单胞菌相似性高达97%,系统发育树显示菌株Spc0408和多株维氏气单胞菌聚为一簇。结合分离菌的表型特征及分子鉴定结果,可以判定该菌株在分类上属于维氏气单胞菌,本研究可以对相关病原菌的分类鉴定提供参考。     

Identification and characterization of pathogenic bacteria isolated from dead masu salmon Oncorhynchus masou masou and antibacterial activity of probiotic Lactococcus lactis subsp. lactis strain K-C2 against isolated pathogens

We focused on developing an epidemic prevention method for circulating masu salmon aquaculture using the probiotic Lactococcus lactis strain K-C2. This study aimed to evaluate the antibacterial activities of strain K-C2 against pathogens isolated from dead Yamame and masu salmon. First, we identified pathogenic bacteria that were isolated from dead masu salmon based on phylogenetic analysis of the 16S rRNA gene sequence and biological and biochemical characterization. The antibacterial activity of strain K-C2 against seven pathogenic strains isolated from dead masu salmon in this study and two strains of Aeromonas salmonicida previously isolated from dead Yamame was tested using a double agar plate method. The results of a BLAST search using 16S rRNA partial sequence data (1200–1300 bp) revealed that six of the former strains and one of the latter strains showed high similarity to Vibrio anguillarum and Tenacibaculum maritimum, respectively. Strain K-C2 showed antibacterial activity against all pathogenic bacteria. In this study, pathogenic bacteria were newly isolated from dead seawater-acclimated masu salmon, and strain K-C2 was found to have antibacterial effects against these pathogens.

     

鲶病原粘孢子虫米氏碘泡虫不同株系的比较研究

【目的】研究米氏碘泡虫（Myxobolus miyairii Kudo, 1919）不同寄生部位和不同地理分布的株系差异和遗传分化情况。【方法】基于形态特征、组织向性、地理分布、18S rDNA序列相似度、遗传距离、系统发育,对米氏碘泡虫各株系进行比较分析。【结果】米氏碘泡虫各株系孢子形态特征基本一致;米氏碘泡虫重庆株系1（鲶鳃腔膜寄生）,重庆株系2（鲶肠寄生）和江西株系（鲶肠寄生）间相似度为98.6%~99.9%,遗传距离为0.000~0.013;系统发育分析显示,米氏碘泡虫重庆株系2先与江西株系聚支,其形成的进化支再与重庆株系1形成姐妹群关系。【结论】序列比较和系统发育分析结果表明,米氏碘泡虫并没有形成地理种群特有的单系,而是依据寄生部位形成肠寄生支系和鳃腔膜寄生支系。宿主种类相同的条件下,较之于地理隔离,寄生部位差异对于米氏碘泡虫种群分化的影响更大。【意义】本文米氏碘泡虫各株系的比较研究及其结果,为人们进一步了解该寄生虫的进化生物学特征积累基础资料。     

新城疫病毒分离株融合蛋白基因的遗传变异分析

根据GenBank中报道的NDV融合蛋白基因(F)序列,设计了一对特异性引物,用该引物对所分离的LN-SN株进行了RT-PCR扩增;将扩增得到的PCR片段纯化后与pGEM-T连接得到重组质粒pGEM-F,用于核苷酸序列测定。结果该基因ORF长1662bp,编码553个氨基酸;将LN-SN毒株与GenBank中已报道的NDV毒株进行比较,F基因核苷酸序列的同源性在83.1%～98.9%之间,推导的F蛋白氨基酸序列的同源性在88.1%～99.5%之间。     

圆口铜鱼维氏气单孢菌的分离鉴定及药敏试验

从濒死圆口铜鱼的脾和肾病灶部位分离优势菌,进行纯化分离并开展生理生化鉴定、16S r DNA序列分析以及常用抗生素药物的药敏性筛选,以期丰富圆口铜鱼病害防治的基础资料。分离出的1株优势菌在BHI固体培养基上长出表面光滑的灰白色圆形菌落,边缘整齐、不透明、稍隆起;序列长度为1 399 bp,与维氏气单孢菌的同源性为100%,与维氏气单孢菌(KT964297.1;KJ650080.1;KM362731.1)聚为一支,置信度99。结合菌落形态特征和生理生化特征,鉴定菌株为维氏气单孢菌。该菌株对氟苯尼考等7种药物敏感,对利福平中度敏感,对新霉素等9种药物耐药。     

Cloning and characterization of the haemolysin determinants from Aeromonas hydrophila

Abstract. Two haemolysin genes (AHH4 and AHH-2) of Aeromonas hydrophila ATCC7966 were cloned into a plasmid vector in Escherichia coli K-12. An open reading frame (ORF) of the AHH-1 haemolysin gene was 1734 base pairs (bp). and corresponded to a protein of 577 amino acid residues. Analysis of the deduced amino sequence indicated a highly hydrophobic N-terminal region which had the characteristics of a leader peptide. The sequence also included the -10 region and the -35 region of a promoter, and a ribosome- binding site upstream from the ORF. The termination site was located downstream from the ORF. The haemolysin was a thermolabile protein with the predicted molecular mass of 60 kDa. The AHH-1 gene is distributed in various A. hydrophila and A. salmonicida strains. The nucleotide sequence of a 981 bp ORF of the AHH-2 gene was encoded with the predicted molecular mass of 377 kDa polypeptides. The homology of the nucleotide sequence was very low between the AHH-1 and AHH-2 genes, and also with the aerolysin gene cloned by Howard & Buckley (19S6). No leader peptide was found in the N-terminal region of the ORF of the AHH2 gene. The AHH-2 gene was detected in the original strain ATCC7966, but was not detected in other tested strains of A. hydrophila and A. salmonicida.