新城疫病毒分离株融合蛋白基因的遗传变异分析

根据GenBank中报道的NDV融合蛋白基因（F）序列，设计了一对特异性引物，用谜引物对所分离的LN—SN株进行了RT-PCR扩增；将扩增得到的PCR片段纯化后与pGEM—T连接得到重组质粒pGEM-F，用于核苷酸序列测定。结果谊基因ORF长1662bp，编码553个氨基酸；将LN—SN毒株与GenBank中已报道的NDV毒株进行比较，F基因核苷酸序列的同源性在83．1％-98．9％之间。推导的F蛋白氨基酸序列的同源性在88．1％-99．5％之间。     

东北地区不同宿主NDV的分离鉴定与系统发育进化分析

针对我国东北地区获得高免新城疫(NewcastleDisease,ND)抗体鸡群仍然发生新城疫(ND)的情况,应用分子流行病学技术,对所分离的18株鸡源新城疫病毒(NewcastleDiseaseVirus,NDV)和1株鸽源NDV进行系统发育进化分析。将NDV分离株通过差速离心纯化,以SDS-蛋白酶K(或Trizol法)提取病毒RNA,RT-PCR扩增其融合蛋白(F)基因532bp或280bp关键片断,经回收克隆到pMD18-T载体上进行核苷酸序列测定(GenBank序列号:AY208680-AY208698)。核苷酸和氨基酸序列进行同源性比较,结果表明各毒株之间核苷酸同源性为83.1%～100%,氨基酸同源性为85.5%～100%;系统发育进化树分析显示,其中JL-12、HLJ-3为弱毒株,与疫苗株V4同属于基因Ⅰ型;其余17株均为强毒株,其中HLJ-4、JL-14为Ⅵ型,其余15株均为基因Ⅶ型,由此可见东北地区目前新城疫的流行是由3种不同基因型的NDV毒珠(Ⅰ型、Ⅵ型、Ⅶ型)所发,但以基因Ⅶ型为主,这与我国其他地区和世界上其他国家ND的流行情况趋于一致。     

东北地区不同宿主NDV的分离鉴定与系统发育进化分析

针对我国东北地区获得高免新城疫（Newcastle Disease，ND）抗体鸡群仍然发生新城疲（ND）的情况，应用分子流行病学技术。对所分离的18株鸡菲新城疲病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）和1株鸽源NDV进行系统发育进化分析。将NDV分离株通过差速离心纯化．以SDS-蛋白酶K（或Trizol法）提取病毒RNA，RT—PCR扩增其融合蛋白（F）基因532bp或280bp关键片断，经回收克隆到pMD 18-T载体上进行核苷酸序列测定（GenBank序列号：AY208680-AY208698）。核苷酸和氧基酸序列进行同源性比较，结果表明各毒株之间核苷酸同源性为83．1％-100％，氨基酸同源性为85．5％-100％；系统发育进化时分析显示．其中JL-12、HLJ-3为弱毒株．与疫苗株V4同属于基因Ⅰ型；其余17株均为强毒袜．其中HLJ-4、JL-14为Ⅵ型，其余15株均为基因Ⅶ型，由此可见东北地区目前新城疲的流行是由3种不同基因型的NDV毒珠（Ⅰ型、Ⅵ型、Ⅶ型）所发．但以基因Ⅶ型为主．速与我国其他地区和世界上其他国家ND的流行情况趋于一致。     

禽多杀性巴氏杆菌PlpB基因交叉保护力研究

根据报道的PM70菌株的PlpB基因序列,设计PlpB基因一对寡核苷酸引物。以C48-1菌株为实验材料,成功扩增PlpB基因的全序列,该片段共831bp。将扩增基因插入原核表达载体pGEX-KG,成功构建了重组表达质粒pKG-PlpB,并对pKG-PlpB重组表达质粒进行序列测定,结果表明:扩增序列与GenBank上所报道的PM70株的PlpB基因序列核苷酸同源性在99%以上。将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经诱导获得大小约56KDa的表达蛋白。Western blot检测表明,该表达蛋白具有良好的反应原性。     

广东佛山地区鸭圆环病毒分子流行株遗传变异分析

目的 研究广东佛山地区鸭圆环病毒(DuCV)流行毒株的遗传变异情况。方法 采用常规PCR方法，对采自广东佛山的3份阳性鸭组织样品中扩增Rep基因部分片段和Cap基因，进行核苷酸序列测序，并将Rep基因部分片段、Cap基因推导的氨基酸序列与30株参考序列进行同源性比较和遗传变化分析。结果 3份阳性样品分别扩增出相应的基因片段；Rep基因部分片段、Cap基因推导的氨基酸序列进化树和同源性分析显示，3株DuCV流行株与台湾株(AY3947213)在同一进化支，均属于DuCV-2型，与同分支的参考毒株相似性分别为97.2%～100%和96.9%～100%,2个基因型中Rep基因同源性高于Cap基因；氨基酸序列的变异分析表明，与中国台湾株(AY3947213)相比较，Rep部分氨基酸和Cap氨基酸分别发生相同位置的氨基酸置换和单独突变，Cap氨基酸突变位点多于Rep氨基酸。结论 研究测得的3株DuCV流行株均属于DuCV-2型，在广东地区有一定范围的流行，且CAP蛋白的变异程度高于REP蛋白，为鸭圆环病毒感染的监控和诊断提供了依据。     

猪圆环病毒2型分离株的基因组克隆、序列测定与分析

设计合成两对覆盖PCV2基因组全长的引物,对PCV2分离株S2、P11、L进行全基因测序。将所测序列与GenBank上已公布的PCV2毒株序列进行同源性比较,并绘制系统发育进化树。结果显示,所测毒株与其它地域的24株PCV2分离株的基因组序列同源性很高。3个分离株之间的全基因核苷酸同源性在95.4%～99.3%。序列分析表明欧洲分离株和美洲分离株分别构成PCV2的两个大的分支:欧洲系和美洲系。S2、P11属于欧洲系,L属于美洲系。     

嗜水气单胞菌外膜蛋白基因ompTS的克隆与序列分析

根据已发表的外膜蛋白基因ompⅡ的核苷酸序列设计引物，从分离 自患红底板病的中华鳖的嗜水气单胞菌中扩增得到了ompTS基因，对ompTS 基因进行序列分析，发现其与ompⅡ基因的核苷酸序列有83.5%的同源性。ompTS基因最长的开放阅读框（ORF）为1068nt，编码由355个氨基酸组成，分子量为38.9kDa的蛋白质OmpTS，其氨基酸序列的前20个氨基酸残基可能组成信号肽。由ompTS基因的编码氨基酸序列与其它细菌外膜蛋白的氨基酸序列的比较结果，进一步证实细菌外膜蛋白氨基酸序列的N端存在高度保守区。根据序列分析结果推测，ompTS基因很可能是一个新的基因，编码38.9kDa的嗜水气单胞菌外膜蛋白OmpTS，该蛋白质在膜中极有可能形成孔道，具备与孔蛋白相似的性质。     

WSSV-VP39基因克隆与结构分析

根据已公布的WSSV-VP39全基因序列(GenBank No.AAL89161)设计1对引物,经PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳分析,扩增出约898bp的特异条带,将其回收后克隆入pGAPZα-A载体中,并进行序列测定与分析。结果表明,扩增序列与Gene Bank登录序列(GenBank No.AAl89161)核苷酸同源性100%。序列分析表明,WSSV-VP39基因编码蛋白无跨膜区域,有多个蛋白激酶C、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和酪氨酸硫酸化位点,1个糖基化位点。蛋白序列比对结果表明,WSSV-VP39与WSSV-VP37具有较高的同源性,其在WSSV侵染中的作用值得关注。     

重庆5个地区PRRSV ORF7基因的克隆与序列分析

采用RT-PCR方法,对来自重庆合川、长寿、綦江、大足、开县等5个区县的5个猪场的PRRS病料进行了ORF7基因的扩增,并克隆、测序和序列比对。结果发现,这5株与美洲型代表毒株VR-2332的核苷酸序列同源性为98.5%,其推导的氨基酸序列同源性为92.6%;与已发表的ORF7序列CQ0703、JX0602、HB0602比对,核苷酸同源性为99.6%,其推导的氨基酸同源性为98.0%;与疫苗株RespPRRSMLV核苷酸同源性为98.6%,氨基酸同源性为94.3%,与欧洲型代表株LV株ORF7基因序列差异较大,核苷酸同源性仅有56.6%,而且推导的氨基酸数比LV株少5个,二者同源性仅为58.1%。结果表明5个区县流行的PRRSV与VR-2332和RespPRRSMLV亲缘关系很近,均为美洲型毒株。     

斜带石斑神经坏死病毒外壳蛋白基因克隆与序列分析

从患病毒性神经坏死病的斜带石斑鱼(Epinephelus coioids)的头部提取总RNA，根据已发表的神经坏死病毒外壳蛋白基因设计引物进行RT-PCR扩增，得到预期大小的基因片段。将此基因片段转入pET载体进行序列测定和分析，结果表明：编码斜带石斑神经坏死病毒(Orange-spoued grouper nervous necrosis virus，OGNNV)外壳蛋白基因的阅读框核苷酸数为1017bp，编码338个氨基酸；基因的核苷酸序列与野田村病毒科(Nodaviridae)的几种病毒的外壳蛋白基因序列比较结果显示，该病毒与p野田村病毒属(Betanodavirus)中的赤点石斑神经坏死病毒(red-spotted grouper nervous necrosis virus，RGNNV)的同源性最高(99％)，说明该病毒株是RGNNY血清型的成员。     

溶藻弧菌HY9901鞭毛蛋白flaB基因的克隆及原核表达

参照GenBank上登录的弧菌鞭毛蛋白flaB基因序列设计引物,PCR扩增溶藻弧菌HY9901株的flaB全长基因,序列分析结果显示该基因为1134bp,编码377个氨基酸。与GenBank中其它弧菌的同源基因序列比对显示,溶藻弧菌flaB基因与副溶血弧菌flaB基因的同源性最高(92%)。将该基因定向克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达出带His-tag的融合蛋白,分子量大小与预期一致。优化的表达条件为28℃,0.4mmol/LIPTG浓度诱导10h。用纯化后的融合蛋白免疫SPF级小鼠,制备了多克隆抗体。Western-blotting结果表明鼠抗FlaB血清不仅能与诱导后的重组蛋白发生反应,而且能与天然的溶藻弧菌全菌蛋白发生反应,提示鞭毛蛋白FlaB可能是溶藻弧菌的重要保护性抗原之一,为下一步进行FlaB蛋白免疫原性的研究以及疫苗的制备奠定了基础。     

养殖澳洲宝石鱼迟缓爱德华氏菌的分离鉴定及致病基因的检测

从患病澳洲宝石鱼体内分离到一株致病菌(编号Et4),对该菌的生化特性及致病基因进行检测,并进行了药敏和人工感染实验。结果显示:菌株Et4的生化鉴定结果与迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)标准菌株(AY77513)一致;其16S rRNA序列,经同源性比对与迟缓爱德华氏菌核苷酸相似度最高,达99%;根据迟缓爱德华氏菌的致病基因Ⅲ型分泌系统装置蛋白esaV基因序列设计引物,进行PCR扩增,得到708 bp序列,该序列与迟缓爱德华氏菌的esaV基因序列相似性达99.3%,说明菌株Et4具有esaV基因。菌株Et4对环丙沙星等较敏感,对其它药物中度或不敏感,具有较强的致病力(LD50=3.74×104CFU/mL),从病鱼中可以重新分离出此菌。综合形态学、生化特性、16S rDNA序列及致病基因序列鉴定其为迟缓爱德华氏菌。     

长鳍真鲨源哈氏弧菌的主要生物学性状研究

从两尾病死的观赏用长鳍真鲨Oceanic whitetip shark，Carcharhinus longimanus L．中分离到的细菌，进行了形态特征、理化特性和对抗菌类药物的敏感性等生物学性状检验。同时，测定了16S rRNA基因序列，分析了相关细菌相应序列的同源性，构建了系统发育树。结果表明，8株供试纯培养菌（编号：HQ050226—1至HQ050226—4、HQ050227-1至HQ050227—4）为弧菌属（Vibrio Pacini 1854）的哈氏弧菌（Vibrio harveyi Johnson and Shunk 1936）。所扩增的16S rRNA基因序列长度（不包括引物结合区），HQ050226—1株为1463bp（GenBank登录号：EF635305）、HQ050227—1株为1464bp（GenBank登录号：EF635306），与GenBank数据库中哈氏弧菌的同源性在98％及99％。药敏试验结果显示，对供试37种抗菌药物中的青霉素G等4种耐药，对头孢唑啉等33种敏感。     

异育银鲫类志贺邻单胞菌的鉴定

采用API 20E系列生化鉴定、生理生化特征、电镜观察和16S rDNA序列构建系统发育树分析方法,对从濒死的异育银鲫(Carassius auratus gibelio♀×Cyprinus carpio♂)肝脏中分离到的1株致病菌(革兰氏阴性杆菌,YCS07-01株)进行了鉴定。结果显示:菌株主要生化特性为氧化酶阳性,发酵葡萄糖产酸不产气,分解肌醇;不发酵蔗糖、甘露醇、鼠李糖等;β-半乳糖苷酶、精氨酸双水解酶、赖氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶阳性。负染电镜观察,菌株为两端钝圆直杆状,无芽胞,无荚膜,有4根鞭毛,大小为0.8~1.0μm×3.0μm。在以该菌16SrDNA序列(GenBank登录号FJ375179)和GenBank数据库内同源性较高的细菌16S rDNA序列构建的系统发育树中,分离菌YCS07-01与类志贺邻单胞菌ATCC14029T(登录号X74688)的同源性为99%,并聚为一个分支。综合培养特征、形态和生理生化特性、系统发育分析等将该菌鉴定为类志贺邻单胞菌(Plesiomus shigelloides)。药敏试验结果表明菌株对羧苄青霉素和万古霉素耐药;对头孢唑啉、四环素和氨曲南中度敏感;对丁胺卡那霉素、左氟沙星、头孢他啶、复方新诺明等高度敏感。     

黄颡鱼小肠结肠炎耶尔森氏菌16SrDNA及系统发育分析

从发病黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)心脏中分离到1株细菌GM 2402,进行了分离培养、形态学观察、生理生化试验与16S rDNA基因的PCR扩增及序列分析.结果表明,菌株GM 2402为革兰氏阴性杆菌,具动力性,V-P试验、水杨酸、过氧化氢酶、脲酶等阳性,不发酵鼠李糖、乳糖等,硫化氢、枸椽酸盐等阴性.16S rDNA序列长1 417 bp,GenBank的登录号是JX 101598,且与数据库中小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)的相似性高达99.6％,系统发育树显示与小肠结肠炎耶尔森氏菌聚为一个分支.综合菌株的生化特性及分子生物学分析结果,判定菌株GM2402为小肠结肠炎耶尔森氏菌.     

罗非鱼海豚链球菌16S rRNA基因的序列测定和系统进化分析

为了从分子水平上对1株致病性罗非鱼链球菌进行分类学鉴定,利用原核生物16SrRNA基因通用引物对分离纯化的罗非鱼致病性链球菌进行16S rRNA基因的克隆及序列分析。结果扩增出长约1.5 kp目的片段,测序得到1条长度为1 447 bp核苷酸序列。核苷酸相似性分析表明,序列与NCB I公布的海豚链球菌(Streptococcus iniae,S.iniae)SCCF5L菌株16SrRNA基因核苷酸序列相似性最高(99.4%),暂称为中国广西株(S.iniae-CGX)。同时,亲源关系较近的S.iniae、S.difficilis和S.agalactiae代表菌株构建的系统发育进化树显示,所得菌株与S.iniae代表菌株组成同一进化分支,与S.agalactiae代表菌株组成的另一进化分支距离较近(95.5%),而与S.difficilis代表菌株组成的进化分支距离较远(92.3%)。上述研究证实,本试验从发病罗非鱼脑组织分离到的致病性链球菌为海豚链球菌。     

6株水产动物源气单胞菌安徽分离株的毒力基因的克隆与序列分析

根据气单胞菌主要黏附素基因（ahal）、溶血素基因（hly）和细胞兴奋性肠毒素基因（alt）完整开放阅读框（0RF）设计3对特异性引物，对6株气单胞菌安徽分离株进行ahal、hly和alt基因的PCR扩增、克隆和测序。测序结果显示，安徽分离株aim、hly和alt基因的ORF大小分别为1056--1068bp、1482bp和1104N1107bp，各编码351-355、493和367-368个氨基酸。序列分析显示：（1）属于alt^＋aim^＋hly^＋毒力基因型的3个安徽分离株间aha1核苷酸序列和推测的氨基酸序列同源性均很高，分别为98.8％-99．3％和97％-97．6％，且与国内参考株mh／Trionyx sinensis／Guangzhou（Guangdong）／AF276639的同源性高达98．5％-99％和96.8％-97．6％。而alt^＋ahal^＋hly^-HA6安徽分离株与国外参考株Ah／Fish／Barcelona（Spain）／AF183931间的核苷酸序列和氨基酸序列同源性较高，分别为95.8％和97．2％。（2）不同表型种气单胞菌安徽分离株之间及其与国内外其他分离株之间的hly核苷酸序列和推测的氨基酸序列同源性均较高，分别介于88．4％-100％之间和90.8％-98．7％之间。（3）5个安徽分离株（RA16、CA1、HA6、HA7和GA1）之间及其与惟一参考株之间的alt核苷酸序列和推测的氨基酸序列同源性分别高达93．5％-99．9％和80．2％-98．3％，但与BA17分离株间的核苷酸序列同源性（81．6％-81．7％）和推测的氨基酸序列同源性（77．5％-84．9％）均较低。这些结果表明，气单胞菌ahal和alt基因在不同毒力基因型间存在一定差异性，hly基因在不同表型种间存在较高保守性，该基因可作为研制气单胞菌基因工程亚单位疫苗的候选成分。     

半滑舌鳎皮肤溃疡病病原研究

为了对半滑舌鳎皮肤溃疡病的病原进行研究, 从患有严重皮肤溃疡病的半滑舌鳎病灶中分离病原菌, 并经人工感染确认病原。对引起此次疾病的病原菌的形态特征、理化特性、胞外产物酶活性与溶血活性及其对抗菌类药物的敏感性等生物学特性进行了研究和分析, 还测定了16 S rRNA、gyrB基因序列, 分析了相应序列的同源性并构建了系统发育树。结果从病灶中分离得到4株优势菌, 经人工注射感染证实菌株A3为引起养殖半滑舌鳎皮肤溃疡病的病原菌, 其半数致死量LD50为1.5×104.2 CFU/mL。其中, 16 S rRNA、gyrB在GenBank中的登录号分别是JN391271、JN168881。从基于16 S rRNA与gyrB基因序列构建的系统发育树看, 分离筛选出来的病原菌与哈维氏弧菌同源性最高, 结合生理生化特征和16 S rRNA、gyrB基因序列分析结果, 认为该病原菌为哈维氏弧菌。胞外产物酶活性及溶血活性检测结果表明,该病原菌具有淀粉酶、尿素酶、脂肪酶、蛋白酶和卵磷脂酶活性而不具有明胶酶活性, 在4%羊血TSA平板上呈β溶血活性。病原菌的药物敏感性试验结果显示, 该菌对四环素、强力霉素、诺氟沙星、磺胺异恶唑等敏感, 而对其他用于试验的抗生素敏感度低或具有一定的抗性。     

黄金鲫温和气单胞菌鉴定及溶血素基因检测

采用常规的培养特征、理化特性及分子生物学的方法,从患病的黄金鲫体内分离到的优势菌YD-1进行了回感试验、表观生物学、药敏试验及毒力因子检测等系统性研究。结果表明,该菌在盐度1-3%、PH4-9,温度10-30℃的营养肉汤培养基中均能生长。该菌株16S rRNA基因序列（GenBank收录号: KC561935, 长度1446bp）和gyrB基因序列（GenBank收录号: KC561934, 长度1169bp）分别与其他气单胞菌属细菌的基因同源性相思似在97%-99%之间,构建系统发育树确定该菌株为温和气单胞菌(Aeromonas sobria)。人工回感试验可引起健康银鲫死亡。对该菌毒力因子进行检测,可扩增出溶血素基因片段。药敏试验显示：该菌对多粘菌素、头孢呋辛、米诺环素、复达新、菌必治、新霉素等6种药物敏感。