两株芽孢杆菌的生长特性及其对仿刺参的益生作用

本实验室前期从大连湾地区健康的仿刺参养殖池塘沉积物中分离出两株芽孢杆菌即B6和B7。首先,通过分析二者的生长特性发现,B6和B7的最适生长温度为15~35℃;最适pH范围为6~8;最适盐度为3%~5%。菌株产酶特性检测结果表明,B6和B7均可产生淀粉酶和蛋白酶,B7产脂肪酶。将两种菌悬液投喂仿刺参后发现,B6和B7可有效提高仿刺参肠道内的消化酶活性以及体腔液中多种非特异性免疫酶活性。本研究结果表明:B6和B7可作为益生菌剂的基础菌株添加至仿刺参生长环境中,并且对仿刺参的消化及免疫功能具有正向刺激作用。     

饲料中添加枯草芽孢杆菌对彭泽鲫生长、免疫的影响

为探讨饲料中添加枯草芽孢杆菌对彭泽鲫生长、免疫及抗氧化能力的影响及其最适添加量,在室内循环水养殖系统中进行了饲养试验,以未添加枯草芽孢杆菌的饲料和分别添加0.06 %、0.12 %、0.18 %和0.24 %枯草芽孢杆菌的饲料饲喂彭泽鲫。试验结果显示:饲料中添加枯草芽孢杆菌可提高彭泽鲫的增重率和饲料转化效率,当添加量达0.12 %时,试验鱼的增重率和饲料系数与对照组相比差异显著,继续增大添加量,增重率和饲料系数的变化不显著;枯草芽孢杆菌添加量为0.24 %的试验组,试验鱼的血清总蛋白和白蛋白水平显著高于对照组;饲料中添加枯草芽孢杆菌能显著提高彭泽鲫肝胰脏和肠道内蛋白酶的含量,但对肝胰脏脂肪酶和淀粉酶活性的影响不显著;添加枯草芽孢杆菌能显著提高试验鱼血清中碱性磷酸酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶的活性。结果表明,在饲料中添加枯草芽孢杆菌能显著提高彭泽鲫的增重率,降低饲料系数,增强其消化酶的活性和抗氧化功能,其最适添加量为0.12 %。     

刺参(Apostichopus japonicus)大水面养殖池塘环境中优势益生菌筛选及其特性分析

2014年12月–2015年12月,在大连地区刺参(Apostichopus japonicus)大水面养殖池塘进行了春、夏、秋、冬四季有益菌分离筛选,从其水体和底泥中共分离得到66株细菌。以刺参"腐皮综合征"主要病原菌——灿烂弧菌(Vibrio splendidus)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)为指示菌进行拮抗作用实验,利用选择培养基对菌株产淀粉酶和蛋白酶的能力进行测定,最后通过安全性实验得到潜在益生菌株YQ-2。结果显示,该菌株对灿烂弧菌和假交替单胞菌有较强的抑制作用,抑菌圈分别达到22 mm和24 mm;对淀粉和蛋白选择培养基水解圈的直径达到22 mm和36 mm。安全性实验显示,该菌株无论是在108 CFU/ml浸浴还是投喂108 CFU/g的粉末饲料感染,30 d内供试刺参没有发病和死亡现象,健康程度好,且相对于对照组的体重明显增长,108 CFU/g粉末饲料投喂组的相对增长率达到39.31%。此外,本研究对YQ-2菌株的生理生化指标、16S r DNA序列进行了分析,其同源性与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis strain KLP2015相似度达99%,故将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌。该株枯草芽孢杆菌在大水面刺参池塘四季水体中数量为140–280 CFU/ml,高于其他菌株;同时,该菌株在水体中还具有较高的优势度,优势度分别为4.2%、3.5%、2.6%、4.6%,冬、春季节的优势度明显高于夏、秋季节;它属于土著分离菌株,对引起刺参腐皮综合征的2株病原菌具有较强的抑制作用,这对刺参大水面生态养殖具有较大的应用潜力。     

紫外诱变选育高活性蛋白酶枯草芽孢杆菌及其降解饲料能力评价

以凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)养殖池塘底泥中分离的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)BC2为出发菌株,利用紫外诱变的方法培育蛋白酶活性高的枯草芽孢杆菌菌株,并评价其降解饲料的能力。结果表明:(1)经6次紫外诱变,突变菌株B38的透明圈直径(H)与菌落直径(C)之比(H/C值)达到6.42,提高了2.13倍;(2)福林酚法测得B38的蛋白酶活性为86.82 U/m L,是出发菌株BC2的3.14倍,但紫外诱变对B38纤维素酶活性影响不显著;(3)连续传代培养10代后发现B38产蛋白酶和纤维素酶能力保持稳定,证明诱变菌株具有较好的遗传稳定性;(4)利用凯氏定氮法评价B38降解饲料蛋白的能力,发现与BC2相比,B38降解饲料中可溶性蛋白的能力提高了2.57倍,而降解不溶性蛋白的能力变化不大。本研究诱变选育的枯草芽孢杆菌B38为开发优良的水产微生态制剂产品提供了重要的前提和基础。     

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在刺参养殖中的益生作用

运用生化方法分析了不同浓度枯草芽孢杆菌制剂对养殖水质、刺参的生长、消化酶活性、非特异性免疫酶活性的影响。结果显示,与对照组相比,添加枯草芽孢杆菌制剂,能够显著降低养殖水体中的硝酸盐和亚硝酸盐,去除率最高可达42.28%和22.33%,对水体中氨氮含量和化学需氧量影响不显著;实验组刺参特定生长率显著提高,枯草芽孢杆菌添加量为6×10–6时,SGR提高40.74%,添加量为6×10–6时,淀粉酶活性提高30.27%,添加量为5×10–6时,蛋白酶活性提高53.93%,达到显著水平差异,但脂肪酶活性无显著提高;非特异性免疫酶(过氧化物酶、碱性磷酸酶、溶菌酶、超氧化物歧化酶)活性均显著高于对照组,枯草芽孢杆菌添加6×10–6效果最好,分别提高135%、27%、396%、192%。本研究表明,添加适当的枯草芽孢杆菌能够有效改善刺参养殖水体水质,提高机体消化酶和非特异性免疫酶活性,从而促进刺参生长。     

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)在刺参养殖中的益生作用

运用生化方法分析了不同浓度枯草芽孢杆菌制剂对养殖水质、刺参的生长、消化酶活性、非特异性免疫酶活性的影响。结果显示,与对照组相比,添加枯草芽孢杆菌制剂,能够显著降低养殖水体中的硝酸盐和亚硝酸盐,去除率最高可达42.28%和22.33%,对水体中氨氮含量和化学需氧量影响不显著;实验组刺参特定生长率显著提高,枯草芽孢杆菌添加量为6×10–6时,SGR提高40.74%,添加量为6×10–6时,淀粉酶活性提高30.27%,添加量为5×10–6时,蛋白酶活性提高53.93%,达到显著水平差异,但脂肪酶活性无显著提高;非特异性免疫酶(过氧化物酶、碱性磷酸酶、溶菌酶、超氧化物歧化酶)活性均显著高于对照组,枯草芽孢杆菌添加6×10–6效果最好,分别提高135%、27%、396%、192%。本研究表明,添加适当的枯草芽孢杆菌能够有效改善刺参养殖水体水质,提高机体消化酶和非特异性免疫酶活性,从而促进刺参生长。     

一株水产芽孢杆菌的筛选鉴定及其净水效果研究

从刺参(Stichopus japonicus)养殖池塘底泥中分离芽孢杆菌,筛选后获得1株优势目的菌株YT-2;根据形态学特征和生理生化特性结果,将其鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。安全性试验证实,枯草芽孢杆菌YT-2对孔雀鱼(Poecilia reticulata)和南美白对虾(Penaeus vannamei)无毒性;水质净化试验结果显示,10d后菌株YT-2对养殖水体中氨氮和亚硝酸盐的降解率分别为81.9%和64.3%,表明该菌对净化养殖池塘水质有明显的作用,具有作为益生菌开发应用的潜力。     

枯草芽孢杆菌HAINUP40水质净化作用的研究

在筛选得到适宜枯草芽孢杆菌HAINUP40生长的最佳液体培养基基础上,探讨枯草芽孢杆菌HAINUP40对2种模拟废水及养殖废水的水质净化作用。生长曲线测定结果显示,枯草芽孢杆菌HAINUP40在不同培养基中的生长速度不同,由快到慢依次为普通淡水培养基细菌基础培养基2216E培养基普通海水培养基;氨氮降解筛选培养基试验表明,枯草芽孢杆菌HAINUP40对氨氮的降解效果显著,在试验的第4d时氨氮去除率达到最高值(57.58%);8.64×105cfu/mL、8.64×10~6 cfu/mL、8.64×10~7 cfu/mL 3种密度的枯草芽孢杆菌HAINUP40对模拟废水的净化试验结果显示,枯草芽孢杆菌HAINUP40均可显著降低模拟废水中的化学需氧量和pH值,在第24h,试验组化学需氧量去除率均超69%,而且pH均降至6.7~6.9(对照组为8.0);8.64×106 cfu/mL枯草芽孢杆菌HAINUP40对高含量氨氮和化学需氧量模拟废水的净化效果试验表明,该菌株在第7d时对化学需氧量的去除率达到90.37%。8.64×10~6cfu/mL枯草芽孢杆菌HAINUP40对养殖废水的净化效果试验表明,该菌株在第12h时对亚硝酸盐的去除率达到94.12%,在72h时对化学需氧量的去除率达到72.13%。试验结果显示,枯草芽孢杆菌HAINUP40可显著降低水体中的亚硝酸盐、氨氮和化学需氧量,具有较好水质净化效果。本试验为枯草芽孢杆菌HAINUP40在罗非鱼生产中作为潜在的水质改良剂提供了数据资料和科学依据。     

刺参(Apostichopus japonicus)大水面养殖池塘环境中优势益生菌筛选及其特性分析

2014年12月-2015年12月,在大连地区刺参(Apostichopus japonicus)大水面养殖池塘进行了春、夏、秋、冬四季有益菌分离筛选,从其水体和底泥中共分离得到66株细菌.以刺参“腐皮综合征”主要病原菌——灿烂弧菌(Vibrio splendidus)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)为指示菌进行拮抗作用实验,利用选择培养基对菌株产淀粉酶和蛋白酶的能力进行测定,最后通过安全性实验得到潜在益生菌株YQ-2.结果显示,该菌株对灿烂弧菌和假交替单胞菌有较强的抑制作用,抑菌圈分别达到22 mm和24 mm;对淀粉和蛋白选择培养基水解圈的直径达到22 mm和36mm.安全性实验显示,该菌株无论是在108 CFU/ml浸浴还是投喂108 CFU/g的粉末饲料感染,30 d内供试刺参没有发病和死亡现象,健康程度好,且相对于对照组的体重明显增长,108 CFU/g粉末饲料投喂组的相对增长率达到39.31％.此外,本研究对YQ-2菌株的生理生化指标、16S rDNA序列进行了分析,其同源性与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis strain KLP2015相似度达99％,故将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌.该株枯草芽孢杆菌在大水面刺参池塘四季水体中数量为140-280 CFU/ml,高于其他菌株;同时,该菌株在水体中还具有较高的优势度,优势度分别为4.2％、3.5％、2.6％、4.6％,冬、春季节的优势度明显高于夏、秋季节;它属于土著分离菌株,对引起刺参腐皮综合征的2株病原菌具有较强的抑制作用,这对刺参大水面生态养殖具有较大的应用潜力.     

饲喂枯草芽孢杆菌对杂交鲟生长和肠道菌群结构的影响

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(Gutcare~?,DSM32315)按0.00%(对照组)、0.10%、0.20%和0.40%的浓度添加到饲料中,投喂杂交鲟(西伯利亚鲟Acipenser baerii♀×施氏鲟A.schrenckii♂)90 d,通过观察其对杂交鲟幼鱼生长性能、血液理化指标和肠道微生物菌群等的影响,来评估枯草芽孢杆菌的应用效果。研究结果显示,投喂率及饵料系数随枯草芽孢杆菌的添加而呈现先降低后升高的趋势,但均显著低于对照组(P0.05),其中0.20%添加组达最低值。饲料中添加枯草芽孢杆菌可以增加血清葡萄糖含量,且0.10%添加组显著高于对照组(P0.05)。肠道微生物物种组成分析显示,在属水平上,各试验组中,鲸杆菌属(Cetobacterium)为优势菌群,随着枯草芽孢杆菌添加量的增加,鲸杆菌属含量下降,并在0.40%添加组比例最低(74.29%);而邻单胞菌属(Plesiomonas)含量升高,当枯草芽孢杆菌添加量达到0.40%时,邻单胞菌属含量最高达23.64%;饲料中添加枯草芽孢杆菌可以降低链球菌属(Streptococcus)、乳酸菌属(Lactobacillus)及乳球菌属(Lactococcus)的丰度。结果表明,在一定范围内枯草芽孢杆菌投喂杂交鲟后,可显著降低饵料系数,增强鱼体对血糖和脂肪的利用和转化能力,同时在一定程度上改善肠道的微生态环境。综上,推荐鲟鱼养殖过程中枯草芽孢杆菌在饲料中的添加剂量为0.10%～0.20%。     

地衣芽孢杆菌对仿刺参生长、消化和免疫功能的影响

为探讨益生菌制剂对仿刺参生长、消化和免疫功能的影响,选用分离自仿刺参肠道的地衣芽孢杆菌作为潜在的益生菌株进行仿刺参投喂试验。选择初始体质量为(7.17±0.86)g的仿刺参为试验对象,设计空白对照组及益生菌处理组进行投喂。益生菌在饲料中的添加密度分别为10⁵、10⁷、10⁹、10¹¹cfu/g,每10d测定相关指标。40d投喂试验结束后,通过注射灿烂弧菌的方式对各组仿刺参进行攻毒试验。试验结果显示,105、1011cfu/g处理组与对照组相比,各指标差异不显著。而投喂含有10⁷ cfu/g和10⁹cfu/g地衣芽孢杆菌饲料时,仿刺参质量增加率、特定生长率、消化酶活性(胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶)及免疫酶活性(酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶、溶菌酶)均显著高于对照组。试验期间,淀粉酶及超氧化物歧化酶活性呈先升后降的趋势,其他指标呈上升趋势。攻毒试验表明,投喂107cfu/g和109cfu/g地衣芽孢杆菌的仿刺参累积死亡率较低,相对免疫保护率较高,仿刺参抵抗灿烂弧菌的能力得到提高。试验结果表明,当饲料中地衣芽孢杆菌密度为10⁷cfu/g和10⁹cfu/g时,仿刺参生长指标、消化酶活性和免疫酶活性均显著提高。     

饲料中添加浒苔对仿刺参幼参生长、消化酶活性和免疫力的影响

在水温17~18℃和盐度30条件下,将初始体质量为(4.09±0.26)g的仿刺参饲养在15个循环水玻璃缸(容积100L)中,投喂在基础饲料中添加0%、3%、6%、9%和12%浒苔的饲料,于投喂后第7、14、28d和42d分别检测仿刺参的生长指标、消化酶(蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶和褐藻酸酶)和体腔液免疫酶(溶菌酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和超氧化物歧化酶)的活性。试验结果表明,投喂试验饲料后第14、28d和42d:(1)饲料中添加6%和9%浒苔组仿刺参的特定生长率显著增加(P0.05),在不同取样时间其他添加组仿刺参的的特定生长率与对照组差异不显著(P0.05);(2)饲料中浒苔添加量为6%和9%试验组仿刺参的4种消化酶比活力显著高于对照组(P0.05),其中6%组仿刺参的消化酶比活力最高;(3)饲料中浒苔添加量为6%时,仿刺参溶菌酶活力显著高于对照组及其他试验组(P0.05);饲料中浒苔添加量为6%和9%时,仿刺参碱性磷酸酶活力和超氧化物歧化酶活力显著高于对照组及其他试验组(P0.05);添加浒苔可以显著提高酸性磷酸酶活力,至第42d,试验组酸性磷酸酶活力高于对照组(P0.05),且浒苔添加量为6%时活力最高。在本试验条件下,饲料中添加浒苔可以提高仿刺参的特定生长率、消化酶活力及免疫力,浒苔的最适添加量为6%~9%。     

微生态制剂对幼刺参生长及消化酶活性的影响

以马尾藻、鼠尾藻、海泥、贻贝粉等原料配制成基础饲料为对照组饵料,在基础饲料的基础上分别添加光合细菌、芽孢杆菌和复合菌(主要成分为光合细菌和芽孢杆菌)制剂为试验组饵料。试验结果表明,试验组特定生长率均大于对照组,在试验的第1阶段:试验组与对照组特定生长率差异显著(P<0.05);在试验的第2阶段:试验组与对照组特定生长率差异都极显著(P<0.01),3组之间差异不显著(P>0.05)。两个阶段成活率试验中试验组都高于对照组,第2阶段成活率高于第1阶段成活率。在两次试验阶段,益生菌对刺参肠道消化酶活性的影响有一定的相似性,试验组刺参消化酶活性都高于对照组。试验表明益生菌可以提高幼刺参的消化酶活性和成活率,并有促生长作用。     

投喂不同海藻饵料对海上网箱幼刺参生长及成活的影响

分别采用鲜孔石莼(Ulva pertusa)、鲜角叉菜(Chondrus ocellatus)、鲜裙带菜(Undaria pinnatifida)磨碎液及其混合液与25%海泥制成四种不同配合饵料,对2.25g±0.02g的幼刺参生长和成活进行了研究。结果表明:实验60d后,投喂鲜孔石莼的幼刺体重增长达到(4.86±0.54)g,特定生长率表现出最大值,为1.36%±0.13%/d,相比对照组(3.42g±0.62g,0.82%±0.34%/d)增长显著(P<0.05),鲜角叉菜次之,体重和特定生长率分别为4.37g±0.31g和1.22%±0.22%/d,两者差异不显著(P>0.05)。幼刺参摄食鲜孔石莼、鲜角叉菜、鲜裙带菜和混合藻液其存活率分别为62.2%±0.2%、58.7%±0.3%、55.3%±0.9%、56.3%±0.7%,与对照组(50.6%±1.3%)之间差异显著(P<0.05)。研究结果显示,投喂鲜孔石莼对海上网箱幼刺参的生长和成活效果最好。因此,在刺参海上网箱养殖阶段添加鲜孔石莼是经济可行的。     

枯草芽孢杆菌的分离鉴定及酶系分布的研究

从池底污泥中分离1株产芽孢杆菌,经菌落形态及主要生理生化特性鉴定为枯草芽孢杆菌。对此菌发酵过程中产酶情况作了研究,结果表明,菌株能够分泌淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶和脂肪酶,具有用于研制微生态制剂的潜力。     

Effects of a probiotic mixture (Bacillus subtilis YB‐1 and Bacillus cereus YB‐2) on disease resistance and non‐specific immunity of sea cucumber,Apostichopus japonicus (Selenka)

The effect of a commercially available compound probiotics product containing Bacillus subtilis YB‐1 (50%) and Bacillus cereus YB‐2 (50%) fed to sea cucumbers, Apostichopus japonicus (Selenka) on challenge infections and non‐specific immune responses was assessed. Sea cucumbers (were randomly allocated into nine aquariums at a density of 30 sea cucumbers per tank and triplicate groups) were fed diets containing 0 (control), 10⁷ and 10¹⁰ cfu (g diet)^?1 of the probiotics mixture for 32 days. The growth factors and immunological parameters were measured. In addition, the effects on resistance against Vibrio alginolyticus infection were also evaluated. The results indicate that all the immunological parameters (phagocytic activity, superoxide anion production, lysozyme activity, catalase activity and phenoloxidase activity) measured and the growth rate of sea cucumbers fed 10¹⁰ cfu of the probiotics mixture were significantly (P < 0.05) improved than control groups at 16 and 32 days. After challenging, the cumulative mortality for the control was 100%, whereas the cumulative mortality for sea cucumbers fed 10¹⁰ cfu of the probiotics mixture was 47% (P < 0.05). Although the total autochthonous intestinal heterotrophic bacterial counts were not affected by dietary treatment (P > 0.05), Bacillus sp. levels were significantly elevated in sea cucumbers fed the probiotics mixture (P < 0.05). These results confirmed that administration of the probiotics mixture in the diet stimulated non‐specific immune responses and enhanced the growth performance of sea cucumbers, and was effective in controlling infections caused by V. alginolyticus.     

中草药复合微生态制剂对吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)生长、肠道菌群及抗病力的影响

通过在饲料中分别添加2×107 CFU/g的芽孢杆菌制剂、中草药芽孢杆菌制剂、复合微生态制剂和中草药复合微生态制剂,研究4种微生态制剂对吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)生长、肠道菌群及抗病力等的影响。结果显示：(1)饲料中添加4种微生态制剂均可显著提高罗非鱼的增重率(P<0.05),对成活率和饲料利用率也有一定程度的提高(P>0.05),而中草药复合微生态制剂对罗非鱼促进生长效果最佳。(2)饲料中添加4种微生态制剂可以显著提高罗非鱼肠道中的细菌总数、芽孢杆菌、乳酸杆菌和双歧杆菌数量(P<0.05),大肠杆菌数量显著低于对照组(P<0.05),说明饲料中添加一定量的4种微生态制均可改善罗非鱼的肠道菌群结构,以中草药复合微生态制剂的改善效果最佳。(3)经人工感染无乳链球菌后,罗非鱼对照组全部死亡,4个实验组只有部分死亡。鉴定发现,吉富罗非鱼的死亡均由感染无乳链球菌所致,试验组罗非鱼的免疫保护率分别为51.42%(B组)、58.62%(C组)、58.62%(D组)和68.93%(E组),以中草药复合微生态制剂组的免疫保护率最高。综上所述,在饲料中添加一定比例的中草药复合微生态制剂可以提高吉富罗非鱼生长指标、改善其肠道菌群结构和增加抗病力。     

高温胁迫对仿刺参抗氧化酶等指标的影响

在15、18、21、24、27、30℃水温下,分别制备仿刺参福建连江群体和辽宁大连群体的体腔和内脏团提取液,测定超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶活力及丙二醛含量。试验结果显示,仿刺参连江群体内脏团提取液超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和乳酸脱氢酶活力最大时的水温比大连群体分别提高了3~9℃;高温(24、27、30℃)胁迫下,连江群体体腔和内脏团提取液超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、乳酸脱氢酶活力均极显著高于大连群体(P0.01),其内脏团提取液谷胱甘肽过氧化物酶活力亦极显著高于大连群体(P0.01),其体腔液谷胱甘肽过氧化物酶活力在24℃和30℃时极显著高于大连群体(P0.01);仿刺参连江群体和大连群体体腔液碱性磷酸酶活性均在15℃时最大,内脏团提取液的碱性磷酸酶活性则均在18℃时最大;连江群体仿刺参体腔和内脏团提取液丙二醛含量在18~30℃下均显著低于大连群体(P0.05,P0.01)。研究表明,福建连江夏季高温驯化的仿刺参子二代群体,在高温胁迫试验中,其体腔和内脏团提取液中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶活力显著高于大连群体,丙二醛含量则显著低于大连群体,这些酶耐热性的提高,有利于仿刺参机体清除因高温胁迫产生多余的自由基,减少机体因高温胁迫造成的损害。