新城疫病毒基质蛋白第23位苯丙氨酸对病毒复制与细胞致病性的作用

副黏病毒科的副流感病毒5型(Parainfluenza virus5,SV5)和腮腺炎病毒(Mumps virus,MuV)的基质蛋白(Matrix protein,M)都编码FPIV-like晚期结构域(Late-domain,L-domain),L-domain中的苯丙氨酸(Phenylalanine,F)对病毒出芽与复制有很重要的作用。新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)M蛋白也包含潜在的L-domain23FPIV26,但23F对NDV的出芽及复制的作用尚不明确。本试验应用反向遗传学技术,以NDV ZJ1株为母本病毒,拯救一株M蛋白F23A突变的重组病毒ZJ1F23A,并在DF1细胞上对ZJ1F23A的复制性能和细胞致病性进行评价。结果显示,ZJ1F23A在DF1上的复制水平显著低于母本病毒ZJ1,ZJ1F23A对DF1的致病性比ZJ1弱。试验结果说明NDV M蛋白23F对病毒复制及病毒的细胞致病性具有重要作用。     

猪源新城疫病毒F和HN基因的表达及其对BHK-21细胞膜的融合作用

为了分析猪源新城疫病毒F和HN基因对BHK-21细胞膜的融合作用,采用RT-PCR方法从猪源新城疫病毒JL01株中扩增获得了F蛋白基因,并根据GenBank上登录的猪源新城疫病毒HN基因序列,合成了HN基因,分别将F和HN基因克隆到pKS载体上。又从大肠杆菌BL21（DE3）中扩增得到T7RNA聚合酶基因,将报告基因EGFP与T7RNA聚合酶基因一起定向克隆到痘苗病毒转移载体pSTK上。再将pKS-F、pKS-HN与pSTK-T7-EGFP共转染BHK-21细胞,转染后16h,用Giemsa染液进行染色,可见明显的细胞融合现象。该研究证明猪源新城疫病毒JL01株的F和HN蛋白共同作用于BHK-21细胞使细胞膜融合。     

鸭源新城疫病毒TH-1株的分离鉴定及遗传进化分析

试验从吉林省通化某地发病死亡鸭子病料中分离到1株具有血凝性的病毒,通过血凝试验、血凝抑制试验、血清中和试验及融合蛋白(F)基因的扩增测序,初步鉴定为新城疫病毒,命名为TH-1株。该病毒鸡胚平均死亡时间(MDT)、1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)及6周龄鸡静脉接种致病指数(IVPI)分别为53.4 h、1.85和2.575,表明该新城疫病毒为强毒。F蛋白多肽裂解位点为112-RRQKRF-117,符合新城疫强毒株裂解位点氨基酸序列,进一步证明该毒株为新城疫强毒株。F基因核苷酸及氨基酸同源性比对发现,TH-1株与中国野鸭源新城疫病毒分离株mallard China HLJ株的同源性最高,核苷酸同源性达到了99.3%,同为新城疫基因Ⅶ型毒株,与目前新城疫流行的主要基因型Ⅶ型相一致,为鸭源新城疫的有效防制提供了理论基础。     

新城疫病毒F基因在大肠杆菌中的高效表达及其免疫原性分析

应用PCR技术,以含有新城疫病毒F48E8株全长融合蛋白(F)基因的真核表达质粒pVAX1-F为模板,扩增出594bp大小的F基因的部分片段.经克隆筛选和测序后,构建成重组原核表达质粒pGEX-6P-1-F.重组质粒转化表达菌BL21,获得重组菌BL21(pGEX-6P-1-F).经IPTG诱导和SDS-PAGE分析表明,F基因在原核表达体系中获得高效表达,表达量占菌体总蛋白的23%.Western blotting结果显示,在相对分子质量46 ku位置有特异性条带.动物实验结果表明,F蛋白免疫鸡产生的针对新城疫病毒F蛋白的血清抗体效价显著高于空白对照组(P＜0.05),说明原核表达系统表达的F蛋白具有良好的免疫原性.     

一株基因Ⅵ型鸭新城疫病毒F基因的克隆及序列分析

以一株鸭新城疫病毒NDV-SS分离株基因组RNA为模板,采用RT-PCR方法扩增其F基因,并进行克隆和序列测定。通过序列分析软件将该毒株F基因氨基酸推导序列与GenBank上已发表的新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)F基因相关代表序列进行同源性及遗传进化关系分析。测序结果表明,NDV-SS株F基因全长1662bp,编码553个氨基酸,其蛋白裂解位点氨基酸序列为112R-R-Q-K-R-F117,符合NDV强毒株特有的序列结构特征。同源性及遗传进化关系分析结果表明,NDV-SS株为基因Ⅵ型毒株,与鸽源新城疫IT-227、Italy-2736分离株具有较高同源性和较近的亲缘关系,推测其可能是由鸽源新城疫病毒变异所产生的。     

新城疫病毒F蛋白在水稻中的表达及检测

旨在研究水稻表达新城疫病毒F蛋白,制备亚单位疫苗。根据GenBank中的新城疫病毒F基因序列以及水稻偏爱性密码子筛选、优化并合成F基因,通过两次载体构建,先使目的基因连在中间载体pMP3上,再连接到pCAMBIA1300植物载体上,通过农杆菌导入水稻愈伤组织中,经过潮霉素抗性筛选,获得表达植株。通过QPCR的方法筛选获得高表达的纯合子株系5株。新城疫抗原试纸条检测和Western blot检测确定F蛋白具有良好的反应原性。本试验为家禽传染病的植物性水稻疫苗研究奠定了基础。     

新城疫与H9N2亚型禽流感嵌合型病毒样颗粒的构建与鉴定

为了构建新城疫与H9N2亚型禽流感嵌合型病毒样颗粒(cVLP),试验以目前流行的基因Ⅶ型新城疫病毒和H9N2亚型禽流感病毒为研究对象,通过昆虫杆状病毒表达系统构建了3种重组杆状病毒,分别为rBV-M、rBV-HN及r BV-FHA,并以适当比例感染悬浮昆虫Sf9细胞,经蔗糖密度梯度纯化后获得嵌合型病毒样颗粒,同时采用新城疫和H9亚型禽流感标准阳性血清对嵌合型病毒样颗粒进行血凝和血凝抑制试验。结果表明:嵌合型病毒样颗粒以新城疫病毒M蛋白作为颗粒骨架,插入了新城疫病毒HN蛋白和经F蛋白胞内域融合的禽流感病毒HA蛋白,在电镜下观察纯化的嵌合型病毒样颗粒具有完整的囊膜结构及纤突,该颗粒具有结合两种阳性血清的能力。说明试验成功构建了包含有新城疫病毒M蛋白、HN蛋白和H9亚型禽流感病毒HA蛋白的嵌合型病毒样颗粒,并且保留了良好的生物学活性。     

表达双基因的重组新城疫病毒载体的构建

为了构建表达双外源基因的重组新城疫病毒载体,试验采用分子生物学方法对重组新城疫病毒进行了研究。通过反向遗传学操作构建并拯救表达双基因的重组新城疫病毒[r Clone30-EGFP(NP/P)-RFP (P/M)];用重组新城疫病毒感染鸡胚成纤维细胞并绘制生长曲线;通过免疫荧光试验检测重组新城疫病毒感染HepG2细胞后荧光蛋白的表达情况。结果表明:试验成功构建并拯救了表达双基因的重组新城疫病毒;重组新城疫病毒的生长动力学与亲本病毒相似,差异不显著(P0. 05);重组新城疫病毒能够在HepG2细胞中稳定表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和红色荧光蛋白(RFP)。说明重组新城疫病毒感染HepG2细胞后可稳定表达双外源基因。     

我国新出现的基因Ⅻ型新城疫病毒(NDV)的基因组特性

为了解我国新出现的基因Ⅻ型新城疫病毒(NDV)的分子特性,分析其基因组遗传演化特征,对2010―2012年我国首次分离到的3株基因Ⅻ型新城疫代表株进行基因组测序和生物信息学分析。结果显示,3株病毒F蛋白裂解位点相同为112 RRQKR/F117,符合强毒株特征。病毒基因组长度均为15 192nt,与早期基因型(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型)毒株相比,其在NP基因5′端非编码区有6个核苷酸插入。3株病毒在F蛋白信号肽、七肽重复区和跨膜区,以及HN蛋白跨膜区、中和抗原表位等功能区有多处氨基酸变异。病毒基因组遗传进化分析结果显示,3株病毒均属于基因Ⅻ型,但与南美地区分离株不同(基因Ⅻa亚型),我国分离株为基因Ⅻb亚型。     

鸽新城疫病毒分离鉴定及动物感染试验

从发病商品肉鸽组织中分离到3株新城疫病毒,对其基因序列和感染力进行测定和分析。用RT-PCR对3株病毒F基因进行了扩增,测序,3株新城疫病毒的F基因同源性比较及进化分析结果表明,3株病毒均属于Ⅵb亚型,且与2011年比利时分离株亲缘关系较近,F蛋白裂解位点符合强毒特征;肉鸽攻毒试验进一步证实了3株新城疫病毒的高致病性,肉鸽感染新城疫病毒后通过呼吸道及消化道途径排毒,具有高度接触传染性。试验结果证明了鸽感染新城疫病毒后的排毒时间及方式,为鸽新城疫的及早发现与防控提供了依据。     

一株鸭源新城疫病毒毒力基因分析及其对鸭的致病性研究

为了解中国鸭源新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)的毒力特点,从2009年广东地区发病鸭群中分离和鉴定出1株新城疫病毒(简称NDV-104),对其生物学特性、致病性和融合蛋白(fusion,F)、血凝素神经氨酸酶(hemagglutinin-neuraminidase,HN)基因进行了研究。结果显示,分离株的MDT、ICPI和IVPI分别为56.4 h、1.95和1.64,结合F蛋白裂解位点(112~117位)的氨基酸序列分析,确定了分离株为新城疫强毒。致病性结果表明,分离病毒对雏鸭具有感染性和致病性。F基因遗传进化结果显示,分离株属于基因Ⅶd亚型。F、HN蛋白的氨基酸同源性结果表明,分离株与2000年以来国内外分离到的基因Ⅶ型NDV同源性较高,分别为96.6%~99.3%和97.0%~99.7%,而其与常用疫苗株B1、V4、Clone30、Mukteswar和LaSota的F、HN蛋白氨基酸序列的同源性较低,且与LaSota株和V4株的同源性最低,分别仅为88.1%和87.6%,说明分离株与经典新城疫病毒毒株存在一定的差异。     

新城疫病毒囊膜糖蛋白生物学特性的研究进展

新城疫是当今全球范围内最严重的禽类传染病之一。其病原新城疫病毒是单股负链RNA病毒,编码NP、P、M、F、HN和L 6种结构蛋白,其中最主要的是位于囊膜上的F和HN两种糖蛋白。F蛋白具有使病毒囊膜与宿主细胞膜融合,致使病毒穿入宿主细胞膜的作用,是决定病毒毒力的关键因子;HN蛋白具有血凝素和神经氨酸酶两种活性,这两种活性对于NDV侵染细胞具有重要的作用。这两种糖蛋白不仅对NDV的毒力及致病性方面起着决定性作用,而且也是诱导产生保护性抗体的蛋白。作者主要对这两种蛋白的结构与功能作一概述。     

表达新城疫病毒融合蛋白基因禽痘病毒重组体的构建

通过RT-PCR扩增新城疫病毒F基因,利用禽痘病毒复合启动子、SV40 PolyA终止信号序列构建F基因表达盒。将F基因表达盒与loxp-GFP-loxP序列串联插入禽痘病毒重组臂,构建了禽痘病毒转移质粒载体。在脂质体介导下转染CEF,获得了带有绿色荧光信号的重组病毒rFPVFGFP。通过二次转染,利用Cre-loxP位点特异性重组将重组病毒基因组的GFP自动去除,结果获得了只含新城疫病毒F基因表达盒的重组禽痘病毒rFPVF。试验结果表明,rFPVF复制稳定,表达的F蛋白具有免疫原性,能够刺激鸡只产生抗新城疫病毒的中和抗体。     

4株新出现的Ⅰ类新城疫病毒F基因的变异分析

为了分析我国新出现的Ⅰ类新城疫病毒的分布和分子特性,对2016年分离到的4株Ⅰ类新城疫病毒进行F基因序列分析和遗传进化分析。结果显示:4株Ⅰ类新城疫病毒F基因编码长度均为1 662nt,共编码553个氨基酸,分离株之间氨基酸相似性为97.9%~100%。4株分离株F蛋白裂解位点的氨基酸组成均为112 ERQERL117,符合新城疫病毒弱毒株的分子特征。F基因高变区(47—420nt)遗传进化分析结果显示这4株病毒为国内新出现的基因型,利用F基因编码区全长序列构建系统进化树显示4株病毒属于基因1c亚型,与北美分离株高度同源,而与国内基因1c亚型分离株(Duck/Guangxi/1261/2015)相似性仅为95.5%~97%。监测数据表明这种新出现的Ⅰ类新城疫病毒具有在国内进一步流行和扩散的风险。     

新城疫病毒ShD-5-04株F基因的克隆与毒力分析

通过RT-PCR特异性扩增出新城疫病毒(NDV)山东分离株(ShD-5-04)的F基因序列,对其进行核苷酸序列测定和分析.结果表明,ShD-5-04株的F基因开放性阅读框为1 662 bp,编码489个氨基酸.与国外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相同序列进行比较,F基因核苷酸序列的同源性在84.1%～88.7%之间,氨基酸同源性在88.1%～93.3%之间;F蛋白裂解位点区(112位～117位)氨基酸组成与强毒株一致,从基因水平上说明NDV ShD-5-04株为新城疫强毒株.     

基因Ⅱ、Ⅶ型二价新城疫病毒样颗粒的制备和鉴定

将基因Ⅶ型新城疫NA-1株F、HN基因的胞外域与基因Ⅱ型新城疫Lasota株F、HN基因的胞内域及跨膜域进行融合,并命名为rNA-1 F/HN。利用昆虫杆状病毒表达系统构建含有新城疫LaSota株M、F、HN等3个结构基因及rNA-1F、rNA-1 HN基因的重组杆状病毒rBV-LaSota M、rBV-LaSota F、rBV-rNA-1 F、rBV-LaSota HN、rBV-rNA-1 HN。将几种重组杆状病毒共感染Sf9细胞96h后收取上清,经超速离心及蔗糖密度离心纯化病毒样粒子(virus-like particles,VLPs),并利用Western blot方法和透射电子显微镜技术检测,结果显示目的蛋白均正确表达且组装成与野生型NDV形态大小相似的VLPs。结果表明:成功制备了新城疫标准疫苗株(LaSota株)及流行强毒株(NA-1株)二价NDV VLPs,为当前新城疫的防控提供新策略。     

一株新城疫病毒鹧鸪分离株分子生物学特性的研究

本研究从一例鹧鸪暴发新城疫的病例中成功分离出一株新城疫病毒(NDV)。运用RT-PCR扩增了该分离株F基因的重要功能片段(约535kb),并进行了序列测定。序列分析表明其在F蛋白裂解位点的氨基酸顺序为112R-R-Q-K-R-F117,与NDV的强毒株特征相符。通过构建NDV的F基因遗传进化树,发现该分离株在分类地位上属于基因Ⅶ型NDV,与同期我国普遍流行的基因Ⅶ型NDV在遗传进化上极为相似,且具有较高的同源性,表明它们可能具有共同的来源。     

新城疫病毒ShD-5-04株F基因和HN基因序列分析

从山东潍坊某非典型新城疫发病鸡群中分离到一株新城疫病毒(暂命名:ShD-5-04),其生物学特性表明该病毒具有新城疫强毒株的一些特征。通过RT-PCR特异性地扩增出F和HN基因序列,并对其进行核苷酸序列测定和分析,结果表明ShD-5-04株的F和HN基因开放性阅读框架(ORF)为1662bp和1716bp,分别编码489个和571个氨基酸,与国外发表的部分新城疫病毒强毒株和弱毒株之间相应序列进行比较,F基因核苷酸序列的同源性在84.1%～88.7%之间,氨基酸同源性在88.1%～93.3%之间;HN基因核苷酸序列的同源性在82.1%～87.4%之间,氨基酸同源性在88.6%～90.9%之间;F蛋白裂解位点区(112-117)氨基酸组成与强毒株一致,说明NDV山东分离株(ShD-5-04)为新城疫强毒株。     

NDV基因Ⅶ型DNA纳米颗粒疫苗初探

本研究利用PCR方法扩增新城疫病毒(NDV)rGM株的F基因,并将其克隆至真核表达载体pCAGGS,构建重组表达质粒pCAGGS-F.采用离子交联法将壳聚糖、MgSO4、pCAGGS-F以及三聚磷酸钠(TPP)混合,制备成新城疫DNA纳米颗粒疫苗.IFA试验检测结果表明,F重组蛋白成功表达.制备的纳米颗粒疫苗通过点眼滴...     

新城疫病毒F基因在大肠埃希菌中的表达及其抗原性分析

构建新城疫病毒融合蛋白F基因的原核表达载体,并将其在宿主菌BL21(DE3)感受细胞中表达.以含有融合蛋白F基因的重组质粒pMD19T-F为模板,设计特异性引物,应用PCR技术扩增获得F基因的F1片段,定向插入原核表达载体pET-28a,构建重组质粒pET-F1,将构建成功的重组质粒pET-F1转化宿主菌BL21(DE3)感受态细胞经IPTG诱导,将其在宿主菌细胞中表达,表达产物用SDS-PAGE和Western blot方法检测.结果显示,成功克隆出了新城疫病毒F1基因片段序列852 bp.构建的pET-F1载体经PCR、双酶切、测序鉴定均无误,转化表达宿主菌后经SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,目的基因被成功表达,并具有良好的反应原性.成功构建了新城疫病毒的融合蛋白F基因原核表达载体,转化宿主细胞后成功表达了融合蛋白F1重组蛋白片段.