poly(I:C)刺激鸡胚胎成纤维细胞产生外泌体的抗新城疫病毒活性

外泌体(exosomes,Ex)是由各种细胞分泌的微小囊泡,可以通过传递RNA、DNA及蛋白质改变受体细胞状态。poly(I:C)是一种dsRNA模拟物,具有一定的抗病毒活性。为研究经poly(I:C)处理后鸡胚胎成纤维细胞(chicken embryo fibroblast,CEF)来源Ex的抗新城疫病毒(NDV)活性,通过超速离心法分离得到CEF来源Ex,并通过透射电镜和免疫印迹试验(Western blot)对其进行鉴定,随后评估其抗NDV活性及活化靶细胞抗病毒能力。结果发现,poly(I:C)刺激使CEF Ex分泌量增加1倍,且poly(I:C)Ex表现出比PBS Ex更强的抗NDV作用。进一步研究表明,poly(I:C)刺激CEF产生的Ex可通过TLR3-NFκB途径产生抗NDV作用。     

梨叶片原生质体制备方法的建立及其基因瞬时转化试验

以‘新梨7号’梨叶片为材料，探究影响原生质体分离的主要因素，制备高产优质的叶肉原生质体，并进行基因瞬时转化和表达。将继代30 d的组培苗嫩叶在最佳酶解液(1.0%纤维素酶，0.1%果胶酶，0.4%离析酶，0.5 mol·L^-1甘露醇，20 mmol·L^-1 KCl,20 mmol·L^-1 MES,10 mmol·L^-1 CaCl2,1.0 g·L^-1 BSA)中酶解12 h，可制备出产量为1.09×10⁶ protopl·mL^-1、活力为90%的原生质体。将1～2μg·mL^-1 pROK2-GFP质粒DNA通过40%PEG-4000介导转化至上述原生质体中并培养12 h，可以观察到GFP绿色荧光信号，转化率可达40%。     

基因Ⅱ、Ⅶ型二价新城疫病毒样颗粒的制备和鉴定

将基因Ⅶ型新城疫NA-1株F、HN基因的胞外域与基因Ⅱ型新城疫Lasota株F、HN基因的胞内域及跨膜域进行融合,并命名为rNA-1 F/HN。利用昆虫杆状病毒表达系统构建含有新城疫LaSota株M、F、HN等3个结构基因及rNA-1F、rNA-1 HN基因的重组杆状病毒rBV-LaSota M、rBV-LaSota F、rBV-rNA-1 F、rBV-LaSota HN、rBV-rNA-1 HN。将几种重组杆状病毒共感染Sf9细胞96h后收取上清,经超速离心及蔗糖密度离心纯化病毒样粒子(virus-like particles,VLPs),并利用Western blot方法和透射电子显微镜技术检测,结果显示目的蛋白均正确表达且组装成与野生型NDV形态大小相似的VLPs。结果表明:成功制备了新城疫标准疫苗株(LaSota株)及流行强毒株(NA-1株)二价NDV VLPs,为当前新城疫的防控提供新策略。     

新城疫病毒mRNA疫苗的构建及鉴定

信使RNA(messenger RNA,mRNA)的核酸疫苗是近年来兴起的一种新型疫苗技术。新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)的血凝素-神经氨酸酶(HN)是NDV的主要保护性抗原，可诱导机体产生中和抗体，是新城疫(Newcastle disease, ND)新型疫苗研发的重要靶点。本研究将NDV HN基因连接到含有T7启动子的载体中，并在其5′UTR和3′UTR分别引入人-β球蛋白的非编码区域以增强转录的mRNA稳定性，经质粒线性化、体外转录、cap加帽处理、mRNA纯化制备NDV HN-mRNA,将其转染至HEK-293T细胞中验证NDV HN-mRNA的表达效果，Western blot和免疫荧光试验结果表明构建mRNA候选疫苗可在HEK-293T细胞中高效表达抗原蛋白，为ND新型疫苗的研发提供新的思路。     

嵌合布鲁菌BCSP31病毒样颗粒的免疫效果评价

新城疫病毒样颗粒已开发成一种高效递送外源蛋白的载体平台。本研究在小鼠模型中开展了嵌合布鲁菌BCSP31病毒样颗粒(BCSP31-cVLPs)免疫原性及其保护效力评价。体内试验数据表明,BCSP31-cVLPs能有效激活脾脏中树突状细胞,进而促进初始型CD3^+CD4^+ T的活化。ELISA法检测小鼠血清结果表明,BCSP31-cVLPs可刺激机体产生针对重组BCSP31蛋白的特异性抗体水平,且呈剂量依赖性。流式细胞术检测结果显示,BCSP31-cVLPs可激活T细胞并使其分化。攻毒结果表明,BCSP31-cVLPs具有与疫苗株M5相当的免疫保护效力。本研究为新型布鲁菌疫苗的研制提供了数据支撑,并扩展了新城疫病毒样颗粒疫苗载体平台的应用。     

梨矮化砧木中矮1号组培快繁技术研究

为建立一种增殖系数高、生根效果好的梨矮化砧木中矮1号的组培快繁技术，本试验以中矮1号组培苗为试材，分别对其快繁的外植体种类、消毒方式、继代培养基配方、生根培养基配方和生根培养条件进行研究筛选。结果表明，一年生枝条水培萌发的叶芽和无花芽混合芽更适合作为中矮1号的外植体，最佳消毒方式为：75%酒精30 s→0.1%升汞3 min→无菌水30 s。最佳继代培养基为：MS+30 g/L蔗糖+1.8 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.2 mg/L GA₃+7 g/L琼脂、pH=6.0,平均增殖系数为5.52;6-BA对继代增殖的影响最大，主要影响增殖系数、苗高、叶片数和节间数，NAA主要影响芽长和节间长度，GA₃对芽长、苗高和节间长度也有一定影响。两步生根法生根培养效果优：先在配方为1/2MS+15 g/L蔗糖+1.0 mg/L IBA+0.4 mg/L IAA+0.6 mg/L NAA+7 g/L琼脂、pH=6.0的培养基上培养7天(前5天为暗培养),后转入无激素培养基培养，平均生根率达72.22%;活性炭(AC)对生根培养的影响最大...     

杜梨嫩枝扦插影响因素探究

为探究杜梨嫩枝扦插的影响因素，筛选出最佳扦插方法，提高其扦插成活率，以杜梨嫩枝为试材，采用单因素试验设计筛选最优插条来源、新梢部段、插条长度和扦插基质，正交试验设计筛选最佳扦插生长调节剂配比。结果表明：连栋温室中采集的杜梨新梢中部段、长10～15 cm的插条更适合杜梨嫩枝扦插；IBA对扦插生根的影响大于NAA和IAA,IBA主要影响生根率和平均根数，NAA和IAA主要影响平均根长；基质湿度和基质配比是影响扦插成活的2个重要因素，其中基质湿度对嫩枝扦插的影响大于基质配比。综上，以长10～15 cm的温室杜梨新梢中部段为插条，在100 mg/L IBA+40 mg/L NAA+10 mg/L IAA中浸泡1 h，再插入河沙∶珍珠岩∶草炭土=1∶2∶2的半干湿基质中，扦插生根率可达70%。