小反刍兽疫病毒N蛋白抗体与H蛋白抗体在羊体内代谢消长规律的研究

为研究小反刍兽疫病毒N蛋白抗体与H蛋白抗体在羊体内的代谢消长规律,试验通过建立小反刍兽疫N蛋白双抗原夹心ELISA抗体检测方法、H蛋白阻断ELISA抗体检测方法与血清中和抗体试验方法,分别检测了羊免疫疫苗后体内N蛋白抗体与H蛋白抗体在每个免疫阶段的代谢消长变化。结果表明:羊免疫小反刍兽疫疫苗后,血清内的N蛋白抗体与H蛋白抗体在6~8周时血清抗体效价较高,对应的羊体内中和抗体效价为1∶512,且效价至少可以持续到10周以上,2种抗体具有一定消长代谢规律的相关性。该研究结果也为以N抗原与H抗原为基础建立相应的抗原捕获ELISA方法、竞争ELISA检测方法、间接ELISA检测方法以及双抗原夹心ELISA检测方法奠定了一定的理论依据。     

大豆抗原蛋白血清抗体间接ELISA检测方法的建立

旨在建立检测血清大豆抗原蛋白抗体的间接ELISA方法。经琼脂糖凝胶层析纯化大豆抗原蛋白,以不同剂量皮下注射免疫小鼠,采用方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释度,并对其他条件进行优化,最终建立检测血清大豆抗原蛋白抗体的间接ELISA方法,利用该方法检测小鼠免疫后血清抗体水平。通过方阵滴定法确定11S蛋白最佳包被浓度为5.0μg/mL,血清稀释倍数为1∶800;7S蛋白抗原最佳包被浓度为2.5μg/mL,血清稀释倍数为1∶1 600;两者的批内、批间系数均小于10%,重复性较好,通过ELISA法确定11S和7S蛋白的最佳免疫次数为2次,免疫剂量为1 000μg/kg。结果表明本试验初步建立大豆抗原蛋白抗体检测间接ELISA方法,具有很强的特异性、敏感性和重复性,可用于大豆抗原蛋白过敏反应的临床检测。     

液相阻断酶联免疫吸附法检测O型口蹄疫免疫抗体

1 原理 滴定好的固定量病毒抗原与被检血清首先在液相中反应,然后将抗原抗体复合物转移到包被好了的含口蹄疫（FMD）型特异性抗体的酶联免疫吸附（ELISA）板中,没有完全被血清抗体阻断的病毒抗原被ELISA板中的抗体捕获,亦与随后加入的豚鼠抗血清中的抗体结合。     

酶联免疫吸附试验(ELISA)与补体结合试验(CFT)诊断牛亚临床型副结核病的比较与评估

本文对ELISA与标准CFT诊断牛亚临床型副结核病进行了比较和评估。在ELISA试验中,对用草分枝杆菌(MycobacteriumPhlei)和高岭土(Kaolin)上清液预吸收过的牛血清对副结核分枝杆菌粗制抗原(Crude pro-toplasmic antigen简称CP抗原)的抗体活性进行了分析。ELISA抗体滴度用ELISA抗体指数(EAI)表示,EAI=(At-An)/(Ap-An)。At、Ap、An分别表示1∶200未知待检血清,1∶400阳性对照血清和1∶200阴性对照血清吸收值。确定EAI≥0．6为ELISA抗     

鸭疫里默氏杆菌抗体检测的全菌体抗原间接ELISA方法的建立

本研究建立了检测鸭疫里默氏杆菌（Rimerrlla anatipestifer,RA）抗体的全菌体抗原间接ELISA方法,最佳血清稀释倍数为1：100。以RA1的甲醛灭活全菌体为包被抗原,棋盘滴定法试验确定其最适抗原包被浓度为5×10^8CFU／mL。与全菌体裂解抗原和重组P25蛋白为包被抗原的间接ELISA方法相比较,三者均可检测不同血清型RA标准阳性血清,结果符合性良好。用该方法检测雏鸭接种鸭疫里默氏杆菌蜂胶灭活疫苗后血清抗体水平的变化,发现免疫后10天抗体水平开始上升,二免后10天抗体水平达到峰值。     

旋毛虫感染小鼠对p46 000重组抗原的抗体应答

分别以旋毛虫肌幼虫ES抗原和p46000重组蛋白作为抗原，对小鼠人工感染旋毛虫后的抗体应答进行了ELISA检测。结果表明，以肌幼虫200条／只经口感染小鼠后，肌幼虫ES抗原在感染后9d可检出抗体，并于感染后35～42d达到最高水平；应用重组抗原检测时，感染后10d可检出抗体，抗体水平略低于用ES抗原，但是其消长规律基本一致．而且与阴性血清相比差异明显；抗体在117d后仍维持于较高水平。     

猪口蹄疫疫苗临床免疫效果评估

为了解2款口蹄疫疫苗免疫效果的差别,采用蔗糖密度梯度离心法测定疫苗抗原含量,并采用ELISA方法对猪群免疫前后进行相应抗体检测。结果表明,疫苗X的抗原含量显著高于疫苗Y。免疫疫苗X的母猪群,抗体阳性率及离散度变化均优于疫苗Y;仔猪免疫疫苗X后,抗体的阳性率快速升高并达到较高的效价,但是仔猪免疫疫苗Y后,抗体的阳性率出现明显下降。说明口蹄疫疫苗免疫效果与抗原含量呈正相关。     

葡萄球菌GST-mTSST-1融合蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立

以纯化的金黄色葡萄球菌无毒诱变超抗原GST-mTSST-1融合蛋白作为检测抗原，通过优化ELISA反应条件，初步建立了检测血清特异性GST-mTSST-1抗体的间接ELISA方法，监测了小鼠血清中特异性GST-mTSST-1抗体水平的动态变化规律。方阵试验确定的GST-mTSST-1抗原的最适包被浓度为5．0μg／mL，血清最佳稀释倍数为1：100，ELISA阳性反应的临界值为D490nm≥0．219，批内和批间重复试验的变异系数均小于10％。应用该方法对试验小鼠血清进行检测，结果表明，建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性、特异性和较好的重复性，适用于检测特异性GST-mTSST-1血清抗体。     

羊伪结核棒状杆菌的分离鉴定及ELISA检测方法的建立

从疑似山羊干酪性淋巴结炎羊的肩前淋巴结脓肿内分离到2株菌,经鉴定均为羊伪结核棒状杆菌。利用羊伪结核棒状杆菌标准菌株(ATCC19410株)制成外毒素作为检测抗原,通过酶标抗体、阳性血清、外毒素抗原最适浓度的选择试验,确定适当的抗原、抗体和酶标抗体稀释浓度,建立了间接ELISA方法用于检测抗体。用建立的ELISA方法检测100份待检羊血清,其中阳性血清4份,阳性检出率为4％。     

圆支清疫苗中猪圆环病毒2型对猪肺炎支原体的免疫增强作用

用相同量猪肺炎支原体(Mhyo)和不同量猪圆环病毒2型(PCV2)混合后的4组疫苗分别免疫BALB/c小鼠、新西兰大耳白兔和健康仔猪,测定小鼠、兔和仔猪血清中PCV2和Mhyo抗体水平,并在仔猪二免后进行Mhyo济南系强毒攻击。结果:小鼠和兔免疫疫苗后产生的Mhyo抗体水平随着疫苗中PCV2抗原含量的增加而提高。仔猪免疫疫苗后,ELISA与IHA检测结果都显示Myho抗体水平随着疫苗中PCV2抗原含量的增加而提高;Mhyo攻毒后肺部病变程度也与疫苗中PCV2抗原浓度呈负相关。以上结果说明PCV2、Mhyo二联疫苗中PCV2全病毒抗原对Mhyo免疫有增强作用,且随着PCV2全病毒抗原含量的增加,Mhyo的免疫保护效果也随之增强,这个结果提示了PCV2抗原对Mhyo抗原的免疫效果有促进作用。     

猪流行性腹泻病毒N蛋白阻断ELISA抗体检测方法的建立及初步应用

旨在建立一种猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白阻断ELISA抗体检测方法.本研究将纯化的N蛋白作为包被抗原,通过棋盘滴定法优化ELISA反应条件,建立了检测PEDV抗体的阻断ELISA方法,并对其进行特异性、敏感性和重复性试验.对140份临床血清样品进行检测,并将检测结果与市售IDvet PEDV间接ELISA抗体检测...     

A preliminary study on the use of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detection of Trichinella spiralis infections in dogs

An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was developed to detect Trichinella spiralis infections in dogs using rabbit anti-canine IgG-horseradish peroxidase prepared according to the improved periodate method and an antigen purified from T. spiralis larvae by Sephadex G-200 chromatography. Sixty-six canine sera were tested for trichinosis by the ELISA and it showed a detection rate which was significantly higher than that by trichinoscopy. This antigen of T. spiralis appeared not to cross-react with the sera of dogs infected with Ancylostoma caninum or Taenia spp. A comparison of ortho-phenylenediamine and 5-amino-2-hydroxybenzoic acid as substrates in the ELISA did not reveal a significant difference. Pieces of filter paper saturated with a defined quantity of whole blood can be substituted for serum as a source material for the test. The relationship between worm burden and the absorbance value in ELISA is discussed.     

白介素-15真核表达质粒对猪瘟免疫增强效果的研究

将克隆至pcDNA3．1载体的含pIL-15基因真核表达质粒大量提取,联合猪瘟疫苗免疫小猪,并通过ELISA和猪脾脏淋巴细胞MTT试验测定pIL-15的免疫佐剂效果。ELISA结果表明,pcDNA-IL-15质粒免疫后,能有效提高猪瘟抗体水平;猪脾脏淋巴细胞增殖试验结果表明,联合免疫后,猪淋巴细胞免疫水平能得到明显提高。     

Serodiagnosis of canine herpesvirus infection--development of an enzyme-linked immunosorbent assay and its comparison with two improved methods of serum neutralization test

An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the diagnosis of canine herpesvirus (CHV) infection using antigen prepared by solubilizing infected cells was developed. The ELISA and two improved methods of serum neutralization test, the microplate serum neutralization test (MSNT) with complement and the 50% plaque reduction (PR) assay with complement, were compared for the results of antibody detection from a total of 557 field canine sera. Of 529 sample sera that were negative in the MSNT with complement, 119 were ELISA positive, and this result together with time course of serum antibody detection in a dog experimentally infected with CHV strongly suggested that the MSNT with complement is less sensitive for the detection of antibody in CHV infected dogs, especially those in early stages of infection. A correlation was found between the titers measured by the ELISA and 50% PR assay with complement, however, for field use, the ELISA is recommended as a highly sensitive test method of serodiagnosis of CHV infection adequate for dealing with a large number of samples with less demand on time and effort.     

猪乙型脑炎病毒囊膜E蛋白间接ELISA诊断方法的建立与初步应用

本研究利用纯化的原核表达乙型脑炎囊膜E蛋白作为包被抗原,建立了乙型脑炎间接ELISA诊断方法。对检测的各种条件进行了优化,优化反应条件后确定的抗原最适包被浓度为2μg/mL,抗原最佳包被条件为37℃包被2 h,血清的最适稀释度为1∶160,酶标抗体最适稀释度为1∶5000,最佳封闭条件为1%BSA,阴阳性临界值判定标准为D492 nm=0.254。该方法不与猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒阳性血清反应,其D492 nm0.254,说明该方法具有良好的特异性。采用该方法对150份疑似乙型脑炎血清样品进行检测,结果显示,与某猪乙型脑炎试剂盒相比符合率为90.77%,表明建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性和特异性,因此,本研究成功建立了能特异性检测抗乙型脑炎血清抗体的ELISA检测方法。     

猪链球菌自溶素的原核表达及其抗体间接ELISA检测方法的建立

【目的】 建立快速、准确检测猪链球菌自溶素（atl）抗体的间接ELISA方法。【方法】 根据GenBank登录的猪链球菌atl基因序列设计1对引物,采用PCR方法从猪源链球菌中获得atl基因序列;构建pET-32a-atl和pGEX-4T-1-atl重组质粒,并将重组质粒转化大肠杆菌BL21感受态细胞中进行诱导表达;以表达纯化后的atl-His融合蛋白为免疫原,免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体;以兔多克隆抗体为一抗,用Western blotting方法检测atl-GST融合蛋白的反应原性;以纯化后的atl-GST融合蛋白为包被抗原,猪链球菌感染阳性血清作为标准血清,建立猪链球菌自溶素抗体的间接ELISA检测方法。利用本试验建立的ELISA方法与商用猪链球菌2型ELISA抗体检测试剂盒同时对184份血清样品进行检测并用本试验建立的方法进行临床样品检测。【结果】 从猪链球菌中成功扩增出atl基因;构建的重组质粒,经诱导表达和纯化,获得大小为40 ku的atl-His和48 ku的atl-GST融合蛋白;经Western blotting验证,兔抗atl-His抗血清与atl-GST融合蛋白具有良好的反应原性;间接ELISA结果显示,该检测方法的阴阳临界值为0.318,阳性血清稀释至1：1 280检测仍为阳性;批内批间变异系数均<10%,表明该方法具有良好的重复性及敏感性。本试验所建立的ELISA方法检测出96份阳性样品,商用猪链球菌2型ELISA抗体检测试剂盒检测出66份阳性样品,符合率为71.7%。应用建立的方法检测458份不同饲养阶段的猪血清样品,其中检出277份阳性样品,阳性率为60.4%。【结论】 本试验成功建立了检测猪链球菌自溶素抗体的间接ELISA方法并进行了初步应用,为猪链球菌病血清流行病学调查奠定了基础。     

猪圆环病毒2型ORF2基因截断表达及ELISA抗体检测方法的初步建立

为建立以重组PCV2Cap蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法,构建了猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2基因原核表达质粒pET28a-ORF2。SDS-PAGE显示,在0.1mmol/L IPTG和37℃条件下诱导4h,重组Cap蛋白高效表达。Western blotting证实该蛋白能够被PCV2阳性血清特异性识别。以纯化的蛋白为抗原建立了检测PCV2抗体的间接ELISA方法。结果表明,抗原最适包被质量浓度为2mg/L;血清最佳稀释度为1∶100;酶标二抗最适浓度为1∶2 000,该方法的敏感性为86.96%,特异性为100%。用该方法对河南省152份猪血清样品进行检测,与间接免疫荧光（IFA）的符合率为85.53%（130/152）,与商品化的韩国金诺PCV2ELISA试剂盒的符合率为88.16%（134/152）。本试验成功建立了PCV2血清抗体间接ELISA方法,具有较高的敏感性和特异性,可用于大规模的血清学检测。     

基于非洲猪瘟病毒截短p72蛋白的间接ELISA抗体检测方法的建立

【目的】建立非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）ELISA抗体检测方法。【方法】以重组截短p72（p72s）蛋白作为检测抗原,通过方阵滴定法,确立ELISA的抗原、待检血清和酶标抗体的最佳工作浓度,优化抗原包被、酶标板封闭、血清/酶标抗体反应及底物显色等工作条件;应用受试者工作特征（receiver operating characteristic,ROC）曲线阈值评价标准,确定方法的阴阳性临界值;检测方法的特异性、敏感性、批内与批间重复性;最后分别用建立的ELISA方法和商品试剂盒检测124份血清,比较两者的阳性检出率,并通过Western blotting验证ELISA的检测结果。【结果】ELISA方法的抗原最佳包被浓度为0.5 μg/mL,待检血清与酶标抗体的最适稀释度分别为1∶100和1∶5 000;反应条件为：抗原于37 ℃孵育1 h后经4 ℃包被酶标板过夜、于37 ℃封闭1 h或室温封闭2 h、待检血清和酶标抗体分别于37 ℃反应60和45 min及加入底物后于室温避光显色20 min;阴阳性血清的判定标准为：当待检血清的D_{450 nm}值≥0.365时,判定为阳性;当D_{450 nm}值＜0.365时,判定为阴性。该方法只与ASFV阳性血清发生特异性结合,与猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等病毒抗血清均无交叉反应;能检测到ASFV抗血清中的总蛋白量为0.091~0.153 mg/mL,低于商品试剂盒的最低检测量（0.110~0.554 mg/mL）;批内和批间重复性试验的平均变异系数分别为4.70%与5.125%。对临床血清样本检测时,建立方法和商品试剂盒的阳性检出率分别为75.81%（94/124）和32.26%（40/124）。进一步验证表明,Western blotting与ELISA的检测结果完全一致。【结论】建立了基于ASFV-p72s蛋白的ELISA抗体检测方法,该方法特异、敏感和重复性稳定,能够用于ASF临床诊断与流行病学调查,具有极大的开发应用潜力。     

非洲猪瘟病毒p72蛋白阻断ELISA检测方法的建立

本研究旨在建立一种非洲猪瘟病毒(ASFV)p72蛋白阻断ELISA抗体检测方法。以纯化的重组p72蛋白作为包被抗原,HRP标记的6E5抗体作为阻断抗体,通过对反应条件进行优化,建立了基于ASFV p72蛋白的阻断ELISA方法。用建立的阻断ELISA方法检测119份临床阴性血清,计算血清阻断率确定临界值,确定了该方法的判定标准：当阻断率PI≥50%时判定为ASFV抗体阳性;PI≤40%时判定为ASFV抗体阴性;当阻断率介于两者之间时,判定为可疑。该方法与猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、A型塞内卡病毒、猪口蹄疫病毒、猪大肠杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、副猪格拉瑟菌和猪胸膜肺炎放线杆菌的抗体阳性血清无交叉反应,批间、批内试验的变异系数均小于15%。用该方法与商品化ASFV抗体检测试剂盒同时检测447份猪临床血清样品,两种方法的相对敏感性和相对特异性分别为95.3%和94.5%,符合率为94.9%。本研究建立的阻断ELISA方法具有较高的敏感性和良好的特异性,可用于ASFV感染诊断和流行病学调查。     

Serological differentiation of five bluetongue virus serotypes in indirect ELISA.

The serological reactivity in indirect ELISA of five different bluetongue virus (BTV) serotypes (4, 10, 15, 16 & 20) was compared using polyclonal antisera raised against virus particles and an outer structural protein, VP2. Rabbit and sheep antisera against BTV-10 produced higher ELISA values with their homologous antigens than with heterologous serotypes. A hyperimmune rabbit serum specific for virus particles was able to distinguish heterologous serotypes from each other, but a sheep serum from an infected animal was not. An antiserum directed against VP2, the protein responsible for serotype specificity in neutralization tests, was not serotype-specific in ELISA and cross-reacted with other serotypes. The discriminatory ability of a BTV-4 antiserum was improved by cross-absorption with heterologous antigens. This greatly reduced the ELISA signals with heterologous serotypes and produced an antiserum that was effectively serotype-specific.