CRISPR/Cas9系统及其在家蚕基因组编辑中的应用

CRISPR/Cas9系统源于细菌获得性免疫系统,是一项可对多个物种的基因组进行高效率编辑的技术,已被广泛用于RNA靶向的基因组定向编辑。本文简要介绍了CRISPR/Cas9系统的基本作用原理和技术改进的进展,重点介绍了CRISPR/Cas9系统在家蚕功能基因研究和定向遗传改造研究中的应用及成果,并展望了该项技术在家蚕基因组编辑中应用的前景和主要的发展方向。     

新型CRISPR/Cas基因编辑系统的研究与应用进展

CRISPR/Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated endonuclease Cas)基因编辑系统在生物体基因功能研究领域发挥着重要作用。CRISPR/Cas9作为典型的CRISPR/Cas基因编辑系统,自建立以来已在多个物种的基因组编辑中得以应用。近年来,Cpf1(也称为Cas12a)、Cas12b(也称为C2c1)、Cas13a(也称为C2c2)等新型Cas蛋白不断被发现和鉴定,进一步拓展了CRISPR/Cas系统的靶向范围,促进了CRISPR/Cas系统的应用。本文阐述新型CRISPR/Cas基因编辑系统与CRISPR/Cas9系统的区别以及利用新型CRISPR/Cas基因编辑系统进行生物体基因组编辑的研究进展,以期较为详细地了解CRISPR/Cpf1和CRISPR/Cas12b等新型CRISPR/Cas系统的特征、作用机制及应用优势,为更加高效地利用CRISPR/Cas系统对家蚕基因组进行编辑提供借鉴。     

家禽疱疹病毒CRISPR/Cas9基因编辑最新研究进展

基于CRISPR/Cas9系统的基因编辑是最新一代的基因组编辑技术，在向导RNA （gRNA）的介导下几乎可以靶向编辑任何一种基因，实现基因组的定点突变、敲除或插入。近年来将CRISPR/Cas9基因编辑技术应用于大基因组DNA病毒的研究，尤其是用于疱疹病毒的基因编辑已成为病毒学研究领域的最新国际热点。自2016年首次报道利用CRISPR/Cas9系统改造家禽疱疹病毒如马立克病病毒（MDV）基因组以来，短短5年时间已全面应用于家禽疱疹病毒的蛋白编码基因和非编码RNA基因的编辑、基因缺失疫苗和重组疫苗研发、抗病毒治疗以及抗病育种等领域。本文详细综述了当前CRISPR/Cas9基因编辑技术在家禽疱疹病毒中的应用进展和最新成果，并对其面临的问题和前景进行了展望，以期为后续研究提供重要参考。     

CRISPR/Cas9介导的基因组编辑技术及应用研究进展

成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白系统(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR/CRISPR-associated nuclease system,CRISPR/Cas)是广泛存在于细菌和古细菌的适应性免疫系统,其中由Ⅱ型CRISPR/Cas系统改造而来的第三代基因组编辑技术——CRISPR/Cas9系统已广泛应用于生命科学研究的多个领域。本文主要从CRISPR/Cas9系统的发现、作用原理、应用进展及与其他新兴的基因组编辑技术的对比等四个方面进行阐述,重点介绍其最新研究进展,并展望了CRISPR/Cas9系统的应用前景。     

CRISPR/Cas9基因组编辑技术及其在草类植物中的应用

CRISPR/Cas9系统作为新一代基因组编辑技术,一经问世就受到广泛关注。CRISPR/Cas9系统具有对特定基因位点进行精确修饰(包括敲除、插入、替换等)的强大功能,同时具有操作简单、效率高、适应性广等技术优势,目前已在微生物、植物、动物以及人类基因治疗等整个生命科学领域得到应用。本文简要介绍了CRISPR/Cas9技术的发展历程、作用机理、技术优势、功能及应用领域,总结该技术在植物领域的基因组定向编辑中的研究进展。并提出了这项技术在草类植物基因功能分析、基因代谢调控途径与遗传改良等方面的应用前景,为相关领域的研究工作奠定了基础。     

CRISPR/Cas9系统:基因组定点编辑技术及其在植物基因功能研究中的应用

CRISPR/Cas系统是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御系统,可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。相比锌指核酸酶(ZFNs)和TALE核酸酶(TALENs),基于RNA指导的Ⅱ型CRISPR/Cas9系统为基因组定点编辑开辟了一条新的道路,在基因功能研究中具有效率高、成本低、易于操作等显著优点。本文从CRISPR/Cas9系统的基本结构、作用机制及其在植物基因功能研究和作物遗传育种中的应用等方面进行了简述,最后对该系统的发展前景进行了展望。     

利用RGR核酶结构拓展家蚕CRISPR基因组编辑系统的应用研究

针对目前家蚕基因组编辑平台在基因组特定位点的靶点选择、多靶点同时编辑等方面的技术瓶颈,利用家蚕卵巢培养细胞系(Bm N)验证含有双核酶结构的RGR(Ribozyme-gRNA-Ribozyme)在CRISPR/Cas9基因组编辑系统中的应用效果,用以拓展现有CRISPR/Cas9系统的靶点范围。研究结果显示,采用Cas9系统和Cpf1系统,RGR结构在Bm N细胞中具有良好的定点编辑效果,可成功实现对内源、外源靶基因序列的剪切,且对内外源基因具有高效编辑作用,表明RGR结构可应用于家蚕CRISPR/Cas9和CRISPR/Cpf1基因组编辑系统。利用RGR结构的自剪切功能不仅可以拓展家蚕基因组靶基因的范围,还为进一步实现多靶点编辑打下了基础。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术原理及其在牧草中的应用

CRISPR/Cas9系统是一种新型RNA靶向的基因编辑系统。在近几年的研究中, CRISPR/Cas9基因编辑技术的发展十分迅猛, 因其具有经济、高效、简便的特点而广泛应用于育种、医疗、工业等领域。介绍了2种新型基因编辑技术, 阐述了CRISPR/Cas9的结构、功能以及CRISPR/Cas9基因编辑技术原理, 综述了该技术在牧草中的应用研究进展, 以期为利用CRISPR/Cas9系统研究牧草基因功能及改良牧草性状提供思路。     

CRISPR/Cas系统作用机制及其在寄生虫学研究中的应用

CRISPR/Cas系统是一种存在于细菌和古细菌的免疫系统,该系统包括能靶向入侵宿主的病毒或外源DNA核酸片段的RNA和切割该片段的Cas9核酸酶。与其他基因编辑技术相比,该系统更易操作,效率更高,成本更低,被广泛应用于各种基因工程领域。作者综述了CRISPR/Cas系统的作用机制及其在寄生虫方面的应用。     

CRISPR/Cas9技术及其在猪基因编辑中的应用

CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeat/CRISPR-associated protein 9）是一种新型基因编辑系统,是由细菌和古细菌对抗入侵病毒及外源DNA的适应性免疫防御系统演变而来的。该系统具有简易、精准、经济和高效的优点,目前已广泛应用于基因编辑及其相关研究中。本文总结了近几年CRISPR/Cas9技术在猪基因组编辑中的研究进展,并展望了其应用前景。     

CRISPR技术在病毒学研究中的应用

近年来,CRISPR/Cas系统凭借其操作简单、靶向精准、效率高等优点,在生物学领域的应用潜力备受关注。通过总结CRISPR技术在抗病毒药物潜在靶点筛选、疫苗开发、病毒核酸快速检测、病毒性疾病临床治疗等领域的应用,阐明了CRISPR/Cas系统目前面临的挑战及相应的解决措施。作为一种基因编辑技术,CRISPR/Cas系统可以快捷地筛选出多种病毒的潜在药物靶点;可以改造病毒基因组,为研发基因缺失活疫苗做储备;可以快速准确诊断病毒性疾病,也可以为乙肝、艾滋病等病毒性疾病的治疗提供新方向。CRISPR/Cas系统仍存在致癌风险、脱靶效应以及递送系统的安全准确性不足等问题。随着CRISPR技术的不断完善,该技术必将会给病毒性疾病的检测诊断与预防控制带来重大变革。     

CRISPR/Cas9系统在寄生虫基因组编辑中的应用研究进展

基因编辑是一种依赖于核酸内切酶对目标基因进行定向改造的现代生物学技术,可实现特定片段的加入、删除,以及特定碱基的插入、缺失、替换等。CRISPR/Cas9系统(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/associated nuclease 9)是在细菌和古细菌中发现的一种用来抵御外源质粒和噬菌体入侵的获得性免疫系统,经改造后已成为一种新型的基因组编辑工具,因其具有操作简单、成本低、切割效率高等优点被广泛应用于多种动物、植物及微生物等的基因组编辑。应用CRISPR/Cas9系统在进行基因编辑的基础上可分析和验证基因功能、研究遗传育种及筛选药物靶点和疫苗分子等,以达到减弱病原微生物致病性、增强动植物抗病性、治疗遗传性疾病、病毒性感染及肿瘤等目的。寄生虫因其生活史复杂,与细菌和病毒相比基因组较大、结构较复杂,缺乏有效的研究工具等原因,使得相关研究进展缓慢,而CRISPR/Cas9基因编辑技术的出现为基因功能研究提供了新的技术手段。笔者对CRISPR/Cas9系统的发现及其在寄生虫基因组编辑中的应用研究进展进行综述,并对该系统的应用现状和发展进行总结和展望。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在绵羊中的应用研究进展

随着基因编辑技术的迅速发展,研究者利用基因编辑技术在越来越多的领域中取得了许多突破性的进展。目前,众多的基因编辑工具中CRISPR/Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9）系统应用最为广泛。CRISPR/Cas9及其衍生出的碱基编辑器（base editor,BE）和先导编辑器（prime editor,PE）系统使研究者可以在目标基因组中简单、高效地完成碱基的删除、插入和替换等修饰。CRISPR/Cas9相关基因编辑技术在生产具有特定遗传特征的动物方面有巨大的潜在价值。绵羊作为具有许多重要经济性状的家畜,是理想的基因工程研究大动物模型。CRISPR/Cas9相关基因编辑技术已经用于绵羊基因组工程研究,如生产具有优良特性的品种,利用乳腺生产疾病治疗药物,构建用于人类疾病和再生医学研究的动物模型。作者从CRISPR/Cas9基因编辑技术的原理出发,着重阐述了利用CRISPR/Cas9系统进行基因编辑的具体流程,并概述了CRISPR/Cas9系统在绵羊研究和生产中的应用情况。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在家禽中应用的研究进展

基因组编辑技术的快速发展促进了对特定基因功能探索及模式动物建立的研究。在家禽动物模型中，CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）技术是最新和最先进的基因编辑工具，研究人员可以通过修饰和改变禽类基因组中关于转录调节、基因靶向、表观遗传修饰、基因治疗和药物输送等基因功能，进而获得满足需求的优良性状。然而，CRISPR/Cas9系统（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Associated Nuclease 9）在禽类基因组的基因编辑和修饰中的适用性仍处于萌芽阶段。到目前为止，在使用CRISPR/Cas9技术方面只在鸡和鹌鹑2个禽类上取得了实质性进展，在鸡的研究中使用较多。最近在通过禽类生殖细胞系对禽类基因组进行修饰方面取得了重大进展。在家禽养殖业中，育种者和养殖者可以利用CRSPR/Cas9介导的方法来增强特定家禽种群必需基因的变异，以获得原本家禽生产中没有的遗传特征。作为编辑基因工具，CRISPR/Cas9可以在家禽基因...     

CRISPR/Cas系统及其在结核分枝杆菌研究中的应用

簇状规则间隔的短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）系统是一种针对入侵核酸的可遗传性原核适应性免疫系统。CRISPR/Cas系统可以产生高度特异性的基因双链断裂,并通过非同源末端连接（NHEJ）或者同源重组（HR）进行修复,如今已经成为许多生物方便有效的基因组编辑工具。结核分枝杆菌因其基因操作的复杂性,其基因组研究存在诸多困难,因此,CRISPR/Cas系统的出现对结核分枝杆菌的研究具有里程碑式意义。本文围绕CRISPR/Cas系统在结核分枝杆菌中的应用,综述了国内外最新的研究进展,为结核分枝杆菌研究方法的选择提供参考。     

CRISPR/Cas9系统在家禽中应用研究进展

CRISPR/Cas系统是一种在细菌和古细菌中发现的获得性免疫系统,由规律成簇间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）和CRISPR相关蛋白（CRISPR-associated proteins,Cas）组成。在此基础上改造获得的CRISPR/Cas9基因定点编辑技术可通过设计小的单链引导RNA（single guide RNA,sgRNA）对目标基因进行定向编辑。家禽作为农业经济动物,能够快速高效地生产蛋和肉产品,是世界范围内重要的蛋白质来源,也是极具价值的脊椎动物发育生物学模型。但是受限于卵生动物特点,家禽的受精卵与蛋黄表面紧密结合,未受精的卵子非常难取出,对家禽单细胞阶段受精卵进行靶向遗传修饰的可行性较低,因而家禽功能基因及转基因研究进展较为缓慢。CRISPR/Cas9基因定点编辑技术相较于其他基因编辑系统操作简单,靶向效率高,极大地推动了家禽功能基因的研究进展,是目前筛选和验证家禽功能基因的最有效的工具之一。文章综述了近年来CRISPR/Cas9在家禽细胞、生长发育和性腺分化、家禽疾病、家禽胚胎编辑和转基因家禽制备上的研究进展,以期为CRISPR/Cas9在家禽上的深入研究和应用提供参考。     

基于CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术研究进展

CRISPR/Cas9是最近发现的一种新型的基因组定点编辑技术。该系统为细菌与古细菌中抵御外源病毒和质粒DNA入侵的获得性免疫机制系统,与TALEN和ZFN技术设计相比更加简单、更容易操作,目前,该技术已成功应用于人类细胞、细菌、斑马鱼、猪、小鼠、食蟹猴以及多种植物的基因组精确修饰,是最具有临床与应用前景的基因治疗技术之一。     

利用CRISPR/Cas9技术对鸡AMHR2基因进行精确编辑

为了在鸡基因组上对AMHR2基因进行精确编辑,该研究利用crispr.mit.edu:807网站设计并通过PCR退火拟合获得成对的AMHR2基因靶位点,将靶位点分别整合进pX330-U6-Chimeric_dBsa I-CBh-hSpCas9载体骨架,构建靶向AMHR2基因的成对CRISPR/Cas9敲除载体。将包含成对靶位点的DNA序列整合进pB-CMV-DsRed-CAG-Chimeric.200 bp repeat.Puro-T2A-GFP载体骨架,构建与敲除载体对应的双荧光报告载体。载体测序鉴定正确后分别共转染HEK293T细胞与鸡DF-1细胞,通过细胞荧光粗略判断CRISPR/Cas9系统是否工作。随后,利用Puromycin对基因编辑阳性的DF-1细胞进行药物筛选富集,提取细胞基因组进行TA克隆,进一步检测CRISPR/Cas9系统的工作效率。结果表明靶向鸡AMHR2基因的CRISPR/Cas9敲除系统构建成功,且成对靶位点敲除系统的工作效率高于单一靶位点敲除系统,CRISPR/Cas9敲除系统在DF-1细胞基因组上对AMHR2基因的敲除效率约为60.0%,并在鸡DF-1细胞基因组上实现了AMHR2基因的精确编辑。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在重要猪病毒病防控中的研究与应用

规律成簇的间隔短回文重复序列系统（clustered regularly interspaced short palindromic repeat，CRISPR）是一种广泛存在于古细菌和细菌中，由RNA介导在Cas蛋白协助下发挥作用的获得性免疫系统，目前，已发现的CRISPR系统中以CRISPR/Cas9应用最为广泛，本文主要对CRISPR/Cas9系统的基本原理和研究进展进行概述，着重介绍其在重要猪病毒病防控中的应用，包括改造宿主和改造病毒两方面，该技术为研究病毒致病机制、新型疫苗研发以及抗病育种研究等提供了强有力的工具，对疫病的控制有着深远的影响。