HN蛋白糖基化位点缺失的新城疫病毒的生物学特性研究

从黑龙江某鸡场中分离到1株新城疫病毒(NDV),命名为ck/CH/LHLJ170302株。全基因组序列测定和遗传进化分析表明,ck/CH/LHLJ170302株属于NDV class II类中的基因II型,与LaSota疫苗株的亲缘关系较近。分析基因分子特征发现,与LaSota株相比,ck/CH/LHLJ170302株编码的HN蛋白缺失了433位的糖基化修饰位点,而其他基因之间没有明显差异。进一步比较分析了ck/CH/LHLJ170302株与LaSota株在生长特性、致病性、抗原相关性方面的差异。结果发现,接种SPF鸡胚后,ck/CH/LHLJ170302株在24 h、48 h和72 h的病毒滴度均显著高于LaSota疫苗株(P0.05),表明ck/CH/LHLJ170302株的增殖速度要快于LaSota株。毒力指标测定结果显示,ck/CH/LHLJ170302株引起鸡胚死亡平均时间(MDT)较LaSota株提前了近20 h,1日龄SPF雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)略低于LaSota株。此外,ck/CH/LHLJ170302株与LaSota株的抗原相关性分析结果表明,ck/CH/LHLJ170302与LaSota株没有明显的抗原性差异。本研究结果为我国NDV的遗传变异的研究提供了参考数据。     

鸡传染性支气管炎病毒CK/CH/LHLJ/04V的分离鉴定及致弱的初步研究

从黑龙江省某鸡场发病鸡群的肾脏中分离到一株病毒,通过病毒致SPF鸡胚病变特征、对鸡外周血红细胞凝集特性、病毒粒子形态学特征以及RT-PCR鉴定等方面的研究,表明该病毒为鸡传染性支气管炎病毒,并命名为CK/CH/LHLJ/04V。通过对该病毒基因型分析以及对SPF鸡致病性试验发现该病毒为我国近年来流行的一类重要IBV的代表。将该毒株在SPF鸡胚连续传代110代(P110),取不同代次毒进行动物实验。结果显示,该毒株对SPF雏鸡的致病力随鸡胚传代次数的增加而逐渐降低。P110代毒以105.0 EID50/0.1 mL的剂量通过点眼滴鼻接种15日龄SPF雏鸡,鸡群发病率和死亡率均为0。不同代次毒接种SPF鸡对同源毒株P3代强毒的攻击均具有100%保护性。实验表明,IBV毒株CK/CH/LHLJ/04V P110对SPF雏鸡已无致病性,但仍具有良好的免疫原性,可作为研制IB弱毒疫苗的候选毒株。     

几种中国鸡传染性支气管炎致弱毒株对流行毒株CK/CH/LDL/97 Ⅰ保护作用的评价

选择2株鸡传染性支气管炎异种致弱毒株CK/CH/LHLJ/04 V F110、tl/CH/LDT3/03 F120和1株同种毒株CK/CH/LDL97ⅠF115,研究其对中国流行强毒株CK/CH/LDL97 Ⅰ的保护效果.首先对不同毒株及参考毒株的S1基因进行比较和系统进化树分析,研究了CK/CH/LDL97 Ⅰ与其他病毒的基因型关系.结果显示,CK/CH/LDL97 Ⅰ属于有别于其他IBV毒株的一个独立的基因群.在此基础上,通过血清抗体检测、攻毒后发病率、死亡率、临床症状,病理变化观察以及气管和肾脏中病毒分离等方面研究了同种致弱毒株和异种致弱毒株对CK/CH/LDL97 Ⅰ的免疫效力.结果显示,同种致弱毒株对CK/CH/LDL97 Ⅰ强毒的攻击可提供100%的临床和病毒分泌的保护性.异种毒株tl/CH/LDT3/03 F120可提供100%的临床保护,但呼吸道病毒检出率达50%,表明对呼吸系统的保护效果不好.异种毒株CK/CH/LHLJ/04 V F110免疫组临床发病率为50%,气管样品病毒检出率为100%,可见临床和对病毒分泌的保护效果均较差.     

3株禽副黏病毒4型国内分离株的基因组序列及生物学特性分析

为了解我国近年来新出现的禽副黏病毒4型（APMV-4）的生物学特性,对2020年分离鉴定的3株鸭源APMV-4进行致病性分析和基因组测定。结果显示：3株APMV-4分离株F蛋白裂解位点均为116DIPQR↓F121,1日龄雏鸡脑内接种致病指数（ICPI）为0~0.23,对鸡表现为低致病力。3株分离毒株基因组长度均为15 054 nt,基因组结构顺序均为3''-N-P-M-F-HN-L-5'',符合典型的副黏病毒基因组“六碱基原则”;病毒3''端具有55 nt的前导序列,5''端存在17 nt的尾随序列,各基因间有9~42 nt的基因间隔序列;3株分离毒株与APMV-4代表株同源性最高（97.2%~97.5%）,与其余禽副黏病毒同源性为37.1%~47.3%,与中国香港、韩国分离株高度同源。结果表明,我国新出现的鸭源APMV-4为弱毒株,基因组序列同源性较高,关键氨基酸位点未发生变异。本研究为进一步了解APMV-4 和科学防控APMV-4感染提供了参考。     

我国新出现的禽副黏病毒14型基因组特性

为了解我国新出现的禽副黏病毒14型（APMV-14）的基因组特性,对2022年从我国家禽中新分离到的2株APMV-14毒株进行了基因组测序和序列分析。结果显示：两株毒株基因组长度均为15 444 nt,结构均为3''-N-P-M-F-HN-L-5'',3''前导序列和5''尾随序列长度分别为55和277 nt,各基因间隔序列长度不等（2~36 nt）;2株毒株F蛋白裂解位点均为99REGR↓L103,具有低致病性禽副黏病毒分子特征;2株毒株HN蛋白长度均为607 aa,明显长于2011年日本分离株APMV14/duck/Japan/11OG0352/2011（580 aa）。同源性分析显示,我国分离的2株不同宿主来源的APMV-14毒株基因组核苷酸同源性为99.5%,与APMV-14代表株11OG0352同源性最高（91.0%）,与其余禽副黏病毒同源性仅为45.0%~52.3%;遗传进化分析显示,2株APMV-14毒株与日本APMV-14分离株（11OG0352）位于同一分支。综上所述,本研究中的2株来源于不同宿主（鸡和鸭）的APMV-14毒株基因组序列高度同源,说明APMV-14已具备水禽—陆禽的跨种传播能力。本研究为APMV-14生物学特性等相关研究奠定了基础。     

1株QX型鸡传染性支气管炎病毒的S1基因序列分析及致病性研究

为跟踪鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的流行及致病特性,2020年从安徽某蛋鸡场采集的发病鸡气管和肾脏组织中分离到1株病毒,对其进行生物学特性鉴定及致病性分析,确定该毒株为IBV,并命名为CK/CH/LAH/20-6。分离毒株可引起鸡胚发育受阻,呈现侏儒胚、蜷缩胚等特征性病变;S1基因检测及遗传演化分析表明,S1基因大小为1 620 bp,属于QX型毒株,与华南地区CK/CH/SHD/GM17-1分离株S1基因同源性高达99.9%;14日龄SPF雏鸡致病性试验结果表明,分离毒株可致雏鸡100%(20/20)发病,20%(4/20)死亡,同时可致气管和肾脏出现不同程度的病理损伤;排毒检测结果表明,攻毒鸡第3天气管及泄殖腔排毒检测率分别为95%(19/20)和85%(17/20),第21天排毒检测率仍达81.25%(13/16)和75%(12/16)。本研究为鸡传染性支气管炎的防控提供了新的流行病学数据,丰富了IBV的生物信息数据库。     

两株不同宿主来源的基因VII型新城疫病毒的生物学特性比较及全基因组序列分析

为研究不同宿主来源的新城疫病毒(NDV)的生物特性及分子特征,本研究比较了两株(Ch/CH/SD/2008/128和Du/CH/SD/2009/134)同属ClassⅡ基因VII型的NDV分离株的生物学特性,并采用RT-PCR方法扩增及测定两株病毒的全基因组序列。结果显示,两株病毒对雏鸡具有相同的高致病性,但鸡源分离株Ch/CH/SD/2008/128对雏鸭致死率高达70%,而鸭源分离株Du/CH/SD/2009/134对雏鸭致死率仅为20%。全基因组序列比较分析显示:两株病毒的基因组长度均为15 192 nt,裂解位点为112RRQKQF117,属于典型的强毒特征,并且两者之间同源性超过96%。Ch/CH/SD/2008/128的F和HN蛋白中某些氨基酸位点与其他VII型病毒存在差异,这可能是导致该病毒对鸭具有高致病性的原因。结果表明两株不同宿主来源的ClassⅡ基因VII型NDV在遗传信息方面差异不大,但对鸭的致病力具有明显差异。     

禽2型副黏病毒分离株Suiling/53的致病性研究

为评估从暗胸朱雀中分离的一株禽2型副黏病毒APMV-2/Procarduelis nipalensis/China/Suiling/53/2013(Suiling/53)的致病性,本研究分别对该病毒的鸡胚平均致死指数(MDT)、脑内致病指数(ICPI)及对4周龄SPF鸡和4周龄BALB/c小鼠的感染能力进行测定。结果显示该病毒株的MDT为120 h;ICPI为0;将含有病毒的尿囊液点眼滴鼻接种4周龄SPF鸡后未出现明显临床症状或死亡,而分别从感染后2 d的气管组织、小肠、脑及感染4 d后的肺脏、气管、心脏中分离出该病毒;在BALB/c小鼠感染试验中,未出现明显临床症状,并且未从采集的组织中分离到该病毒。本研究结果表明病毒株Suiling/53对SPF鸡呈低致病力,而对BALB/c小鼠可能无感染性。     

几种中国鸡传染性支气管炎致弱毒株对流行毒株CK／CH／LDL／97I保护作用的评价

选择2株鸡传染性支气管炎异种致弱毒株CK／CH/LHLJ／04V F110、tl／CH／LDT3／03F120和1株同种毒株CK／CH／LDL97 I F115,研究其对中国流行强毒株CK／CH／LDL97I的保护效果。首先对不同毒株及参考毒株的S1基因进行比较和系统进化树分析,研究了CK／CH／LDL97I与其他病毒的基因型关系。结果显示,CK／CH／LDL97I属于有别于其他IBV毒株的一个独立的基因群。在此基础上,通过血清抗体检测、攻毒后发病率、死亡率、临床症状、病理变化观察以及气管和肾脏中病毒分离等方面研究了同种致弱毒株和异种致弱毒株对CK／CH／LDL97I的免疫效力。结果显示,同种致弱毒株对CK／CH／LDL97I强毒的攻击可提供100％的临床和病毒分泌的保护性。异种毒株tl／CH／LDT3／03F120可提供100％的临床保护,但呼吸道病毒检出率达50％,表明对呼吸系统的保护效果不好。异种毒株CK／CH／LHLJ／04VF110免疫组临床发病率为50％,气管样品病毒检出率为100％,可见临床和对病毒分泌的保护效果均较差。     

一株新城疫病毒野鸟分离株的生物学特性研究

野鸟是新城疫病毒(NDV)重要的自然宿主,在NDV的传播和进化中起着重要作用。Mallard/CH/HLJ127/06是2006年分离自黑龙江省野鸟的一株NDV。本研究对其进行了全基因组序列测定、遗传进化分析、抗原相关性分析;并测定了病毒株毒力指标及致病性特点。结果显示Mallard/CH/HLJ127/06属于class II中的基因VII型病毒株。F蛋白裂解位点为~(112)RRQKRF~(117)。抗原相关性分析表明Mallard/CH/HLJ127/06与基因VII型代表性病毒株之间没有显著的抗原性差异。致病指数MDT (最小致死剂量病毒致死鸡胚的平均时间)值为68 h,ICPI (脑内接种致病指数)值为1.975。致病性试验结果显示,SPF鸡感染Mallard/CH/HLJ127/06后表现明显的临床症状,在感染鸡的脑、气管、肺脏、腺胃、盲肠扁桃体、肾脏和肝脏中均能够检测到病毒的RNA。本研究为进一步研究野鸟在NDV流行病学中的作用及对我国新城疫的防控提供了依据。     

两株H5N1亚型禽流感病毒的基因分析及其在不同宿主中致病性的比较

为了解两株高致病性禽流感病毒(HPAIV)的分子特征及其对不同宿主的致病性,本研究对DK/HuN/4/08和CK/GX/2/09进行全基因组序列的测定,分析结果表明:两个病毒分离株HA基因的裂解位点均具有HPAIV特有的基序(341RRR(R)KR345/346),并且均属于Clade2.3.2分支,基因组同源性在97.4%～98.3%之间。致病性试验显示,两个病毒分离株均能够以106EID50感染量在3 d内引起鸡全部死亡,并且各脏器均检测到高滴度的病毒含量;两者在SPF鸭中呈现不同的致病性,CK/GX/2/09在4 d内可以使感染鸭100%死亡,而DK/HuN/4/08只引起25%的死亡率;同样在小鼠试验中,两者致病力差异与在鸭体中的反应一致,其MLD50分别为1.63 log10EID50和6.2 log10EID50。本研究表明,这两株遗传背景相似的HPAIV在鸡、鸭和小鼠中的致病性不同,为进一步利用反向遗传技术研究这两株病毒对水禽和哺乳动物致病力差异的分子机制奠定了基础。     

鸭源基因Ⅸ型禽1型副黏病毒实时荧光定量RT-PCR方法的建立与应用

我国水禽中流行的禽1型副黏病毒(APMV-1)除基因Ⅶ外,基因Ⅸ型APMV-1日渐增多,且呈现基因型多样性。本研究基于鸭源基因Ⅸ型APMV-1的F基因特异性序列,建立了一种可快速检测基因Ⅸ型APMV-1的实时荧光定量RT-PCR方法。该方法仅能特异性检出基因Ⅸ型APMV-1,其检测敏感性高达100拷贝/μL,重复试验批间变异系数小于5%;应用该方法对人工感染鸭组织和采集的临床样品分别进行检测,其结果与常规RT-PCR检测、病毒分离结果的符合率分别为100.0%,96.1%和90.1%,81.8%。以上结果表明,本研究建立的基因Ⅸ型APMV-1实时荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、重复性好,为该病临床样品检测提供了快速有效的手段,适于鸭源基因Ⅸ型APMV-1感染的病原学监测。     

鸡致病性E.coli地方株血清型的鉴定、毒力基因及致病性检测

为了研究河北秦皇岛地区鸡致病性大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)地方流行株的优势血清型、毒力基因和致病性,本研究采用常规鉴定方法和16SrRNA PCR方法,从采集自河北秦皇岛地区不同养鸡场的83份病鸡组织中分离鉴定出56株E.coli。人工感染1日龄雏鸡试验表明,46株分离株为致病性E.coli。采用玻片凝集试验、PCR方法分别测定致病性E.coli分离株的血清型分布和16种毒力基因携带情况。结果显示,定型的42株致病性E.coli分离株包括11种血清型,以O7 8、O89、O142及O1为优势血清型;46株致病性E.coli分离株中以irp2、fuyA、ompT、Iss a、iutA、iroN和hlyF毒力基因检出率较高,在89.1%~100.0%,其他毒力基因检出率为22.0%~72.0%。选择优势血清型代表株QH1(O78)、QH1(O89)、QH1(O142)和QH1(O1)人工感染1日龄雏鸡,计算半数致死量(LD50),确定其致病性。结果表明,QH1(O78)株致病性最强,对1日龄雏鸡的LD50为3.16×106 CFU/mL;对14,49日龄雏鸡的LD50分别为1.07×107,5×108 CFU/mL。本研究为河北秦皇岛地区鸡致病性E.coli地方流行株防控提供试验依据。     

应用新城疫病毒强弱毒株RT-PCR鉴别诊断技术检测多种禽类副黏病毒

应用已建立的新城疫病毒(NDV)强、弱毒株RT-PCR快速鉴别诊断技术，对来自广西各地疑为禽副黏病毒血清1型(APMV-1)感染的144份不同禽类的病料进行了检测，并用常规方法对RT-PCR检测为阳性的部分病料进行了病毒的分离和鉴定。结果，从鸡、鸽、鹅、鸭、鹌鹑、珍珠鸡、孔雀、鸵鸟和画眉鸟9种禽的病料样品中检测到A19MV-1，阳性检出率为64．58％(93／144)；从7种禽病料中分离到29株APMV-1地方野毒株。部分分离株用NDV强、弱毒株快速鉴别技术鉴定属中、强毒株。     

一株低致病性H5N6亚型禽流感病毒（AIV）的生物学特性分析

2019年11月本实验室从家禽监测样品中分离鉴定到一株低致病性H5N6亚型禽流感病毒(AIV),命名为A/chicken/Hebei/S1/2019(H5N6)(简称CK/HeB/S1/19)。为进一步了解其生物学特点,本实验对其全基因组测序并进行遗传演化分析,结果显示,该病毒属于2.3.4.4h分支,碱性裂解位点为PLRESR↓GLF,属于低致病性AIV(LPAIV)。对其各基因节段分别经BLAST比对后发现,其外部基因来源于H5N6亚型AIV,内部基因完全来源于H9N2亚型AIV,推测该分离株为一株重组病毒。将CK/HeB/S1/19病毒株接种SPF鸡及BALB/c小鼠研究其致病性,结果显示,该病毒虽然能够感染鸡,但不能在鸡体内有效复制,而该病毒未经适应就可在3只小鼠的鼻甲和肺中进行复制,对小鼠呈低致病性。本研究为H5亚型AIV的检测和其感染的综合防控提供了参考依据。     

禽Ⅰ型副黏病毒各种禽源分离株对4种禽类的致病性

选取从临床感染禽Ⅰ型副黏病毒（APMV-1）的鸡、鹅、鸽、鹌鹑、珍珠鸡、孔雀、画眉鸟等7种禽类病例分离到的9个代表性毒株，分别对鸡、鹌鹑、鹅和鸽进行了人工感染试验。结果，除鸽源毒株gxp22对鸡和鹅无致病力外，其他8个分离毒株对鸡、鹌鹑和鹅都有较强的致病力，死亡率为60％～100％，试验鸡表现的症状和病理变化特征最明显，鹅的比较明显，鹌鹑的则最不明显；3个鸽源分离株对鸽的致病力都很强，死亡率均为100％。所有毒株对4种禽类的致病性与其临床特征相符。研究结果表明，试验所用的9个分离株除鸽源分离株gxp22外，均为泛嗜性的新城疫强毒株。     

1株H5N6亚型禽流感病毒的分离、鉴定与致病性研究

本文选取2015年从广东野生鸟类样品中分离的1株H5N6亚型禽流感(avian influenza virus,AIV)代表毒株(A/Pallas's Sandgrouse/Guangdong/ZH283/2015),并开展对SPF鸡的致病性研究。对SPF鸡的致病性试验结果显示,该分离株对SPF鸡高度致死并引起组织器官感染,在肺脏、气管和法氏囊等9个脏器中均能检测到较高的病毒滴度,被检的9个脏器中的病毒滴度都达到7.83 log_(10)EID_(50)/g以上,肺的滴度较高,达10.08 log_(10)EID_(50)/g;感染组和同居组的SPF鸡均可经咽喉和泄殖腔排毒。     

1株H5N1禽流感病毒云南分离株的生物学特性分析

为了解2014年分离自云南省通海县的1株H5N1亚型禽流感病毒的生物学特性,对病原A/chicken/Yunnan/1/2014(yn2014)进行了一系列分析,包括全基因组序列测定,遗传演化分析,抗原性分析,以及对SPF鸡、鸭和BALB/c小鼠的致病性试验。交叉血凝抑制试验和免疫保护试验对yn2014分离株进行抗原分析显示,yn2014与Re-5疫苗株之间抗原性差异显著。全基因组序列测定和遗传进化分析表明,yn2014病毒HA基因与韩国、日本、中国流行毒株核苷酸高度同源,同属于2.3.4.6分支;HA含有多个连续碱性氨基酸,具有高致病性禽流感病毒的分子特征。yn2014病毒人工静脉接种SPF鸡和鼻腔感染SPF鸭试验,结果显示,yn2014病毒对鸡、鸭的致死率分别为100%和50%。用10~6EID50病毒鼻腔感染6周龄BALB/c小鼠,结果显示,yn2014病毒对BALB/c小鼠的致病性较低,仅在鼻窦中复制,且不能在小鼠之间传播。本研究为该分支禽流感病毒的防控提供了较好的参考价值。     

鹅副黏病毒的分离与鉴定

从鹅体内分离到一株副黏病毒（DG01株），该病毒具有血凝活性且血凝活性能被新城疫标准阳性血清和鹅副黏病毒阳性血清所抑制，能使SPF鸡胚、非免疫鸭胚和鹅胚100％死亡。电镜观察见病毒颗粒呈多形性，多为圆形有囊膜，直径在200nm左右；ELD50为10^8.6／ml，MDT为56h，ICPI为1．94。对DG01株通过RT-PCR方法，扩增出F基因，鉴定为基因Ⅶ强毒株，测序结果与CH2000同源率为91．8％，因此确定DG01株属于禽副黏病毒Ⅰ型（APMV-1）的基因变异强毒株。动物接种试验表明DC01株对鸭无致病性，对鹅、鸡、鸽具有100％的发病率和致死率。     

鸡传染性支气管炎病毒CK/CH/LDL05Ⅱ的分离鉴定及生物学特性

采取2005年大连某鸡场发病鸡群萎缩的输卵管进行处理,经鸡胚尿囊腔接种SPF鸡胚,分离到1株病毒。通过致SPF鸡胚病变特征、病毒对鸡外周血红细胞凝集特性、病毒粒子形态学特征、对SPF鸡致病性及死亡率等方面的研究,发现病毒经鸡胚传毒至第3代可致鸡胚生长发育障碍(侏儒胚)、胚体严重卷曲且大腿及尾部有点状出血;病毒囊液不凝集鸡的外周血红细胞;在电镜下呈球形,病毒囊膜表面有疏松排列的棒状纤突,具有冠状病毒粒子的形态特征;以105.5×EID50/0.1mL的病毒接种15日龄的SPF雏鸡,鸡群发病率为22/22(100%),死亡率为12/22(54.5%)。根据以上结果确定该病毒为冠状病毒,命名为CK/CH/LDL05Ⅱ。在此基础上,用RT-PCR对CK/CH/LDL05Ⅱ的核蛋白基因进行了克隆、测序和分析。与GenBank中26株IBV参考毒株核蛋白基因序列进行比较分析,发现该毒株与我国2004年分离IBV毒株CK/CH/LDL/04Ⅱ的N基因推导氨基酸同源性最高(97.5%),表明两者具有较近的亲缘关系。这一结果不但从分子水平证实毒株CK/CH/LDL05Ⅱ是鸡传染性支气管炎病毒,而且表明该血清型的毒株最近连续2年...