猪圆环病毒2型ZJ/C株增殖条件的优化

为了在PK15细胞上获得更高滴度的猪圆环病毒2型(PCV2)ZJ/C株,本实验优化了细胞接种密度、接毒方法、接毒量与收获时间和冻融次数等条件。结果表明接种密度在2.5×10~5个/m L,同步接毒加D-氨基葡萄糖处理,接毒量为2%,接毒后90h收获,-20℃冻融2次,PCV2-ZJ/C株增殖效果最好。该结果为猪圆环病毒2型灭活疫苗(ZJ/C株)的生产提供了依据。     

PK-15细胞微载体悬浮培养及PCV2增殖工艺研究

研究表明,PCV2仅在PK15等少数哺乳动物细胞上增殖,但由于PCV2毒力弱,且不产生细胞病变,获得高滴度病毒难度较大~([1])。因此,PCV2的培养滴度高低已成为制约现有疫苗质量的关键瓶颈之一。为建立在生物反应器内微载体逐级放大培养PK-15细胞和增殖PCV2技术,本研究以德国Sartorius14 L生物反应器微载体悬浮培养PK-15细胞,对PK-15细胞初始接种密度、搅拌转速、微载体浓度、PCV2接毒时间、接毒剂量、收毒时间等工艺参数进行了摸索和优化~([2-3])。结果表明:3 g/L的微载体和60 r/min的搅拌转速下,采用0.5×10~6cells/mL的初始接种密度操作工艺可获得最佳PK-15细胞生长效能。细胞生长后6 h接毒,采用感染复数(MOI)为0.5的接毒比例,细胞接毒后在微载体上生长96 h可获得最高的PCV2增殖滴度10~(8.5)TCID_(50)/mL,利用该工艺,经过消化转移将PK-15细胞从14 L反应器放大至42 L反应器,微载体上细胞贴附均匀、生长旺盛,42 L反应器中培养72 h细胞密度可达39.0×10~5 cells/mL,病毒滴度10~(8.3)TCID_(50)/mL,应用生物反应器培养PCV2滴度较常规转瓶培养工艺提高了近10倍。进一步表明PCV2悬浮培养放大与接毒工艺稳定,为下一步实现工业级规模化生产奠定基础。     

猪肾原代细胞(带毒与不带毒)的传代及其繁殖猪瘟病毒能力的试验

本实验是摸索猪肾原代细胞(带毒与不带毒)的传代方法,先用无 Ca~(++)、Mg~(++)平衡盐溶液浸洗细胞单层表面,再用胰蛋白酶、EDTA 混合消化液消化分散的程序,获得较好的效果。在此基础上,对不同培养时间的猪肾细胞(带毒与不带毒)经传代后繁殖猪瘟病毒的能力作了比较。结果表明:生产猪瘟病毒的猪肾细胞经过四次收获、传代后,不论是否补加病毒,其产毒能力均较差。而只经过两次收获、传代后的细胞,补加了病毒后其产毒能力较前者有明显的提高。不带毒的猪肾细胞也以培养时间较短的,传代后产毒能力为好。若能应用于实际生产中,可以将刚形成单层的原代猪肾细胞传一代后再接毒,以减少杀猪和增加细胞与病毒的产量来达到减少成本、降低原材料消耗和提高产量的目的。     

猪细小病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法检测不同接毒条件对病毒增殖效果的影响

为提高细小病毒(PPV)细胞培养的滴度,本试验通过对猪细小病毒(PPV)感染ST细胞接毒工艺各步骤的比较研究,从不同接毒方式、细胞接种量、病毒感作时间以及接种浓度等方面进行分析,利用猪细小病毒SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法对病毒滴度进行检测。结果表明:ST细胞覆盖率接近单层时接毒,采用分步法接毒,以103倍稀释病毒接种,接种病毒后感作2h,将接毒后细胞维持液中血清浓度设为2%这5个方面的接毒工艺可提高PPV细胞培养的病毒滴度。     

不同接毒方法对猪圆环病毒2型增殖的影响

本试验对比了不同的接毒方法,观察猪圆环病毒2型的繁殖情况.试验分为同步接毒(A组、B组)和异步接毒(C组、D组):同步接毒A组为在消化分装好的细胞悬液中同步接入5%(V/V)的PCV2种毒,B组为在消化分装好的细胞悬液中同步接入3%(V/V)的PCV2种毒,24 h后再接种2%种毒;异步接毒C组为在生长良好、 培养24 h的单层细胞中接种5%(V/V)的PCV2种毒,D组为在生长良好、培养48 h的PK15单层细胞中接种5%(V/V)的PCV2种毒.四组均在接种后培养72 h收获,进行病毒含量检测.试验结果显示:A组的病毒含量为107.0~7.25TCID50/mL,B组病毒含量为106.75~7.0TCID50/mL,C组的病毒含量为106.4~6.5TCID50/mL,D组的病毒含量为106.25~6.5TCID50/mL.试验结果表明,采用同步接毒法的病毒含量明显高于异步接毒法,在细胞悬液中同步一次性接入5%种毒,病毒的增殖量最高.     

适合猪圆环病毒2生长的PK15均质细胞株的构建

<正>为筛选出PCV2培养滴度最高的PK15细胞克隆株,采用稀释法从PK15混合细胞中分离单细胞克隆株,获得的细胞克隆用于接毒试验,即用同步接种法将猪圆环病毒2(PCV2)病毒细胞混合液以1∶100的比例接种单克隆细胞,接毒后经PCR与定量PCR检测得出A10细胞克隆培养PCV2,获得的病毒含量最高。将A10细胞进行第     

猪细小病毒SYBRGreenI实时荧光定量PCR方法检测不同接毒条件对病毒增殖效果的影响

为提高细小病毒（PPV）细胞培养的滴度,本试验通过对猪细小病毒（PPV）感染ST细胞接毒工艺各步骤的比较研究．从不同接毒方式、细胞接种量、病毒感作时间以及接种浓度等方面进行分析,利用猪细小病毒SYBRGreenI实时荧光定量PCR方法对病毒滴度进行检测。结果表明：ST细胞覆盖率接近单层时接毒,采用分步法接毒,以10^3倍稀释病毒接种,接种病毒后感作2h,将接毒后细胞维持液中血清浓度设为2％这5个方面的接毒工艺可提高PPV细胞培养的病毒滴度。     

猪圆环病毒2型SH毒株免疫原性

用D-氨基葡萄糖处理PK-15细胞,将PCV2-SH分离株增殖传代至第50代,测定病毒滴度TCID50均为10-6.25/mL.将第20代和第50代病毒液分别灭活乳化制成灭活疫苗,进行猪体免疫保护试验.结果显示,这2个不同代次的病毒制成的疫苗都能刺激机体产生较高水平的ELISA抗体,攻毒后2个免疫组的猪均没有明显的临床症状,相对日增重相似,同时病理变化和病毒血症程度明显减轻.结果表明,PCV2-SH株具有稳定的免疫原性,并可以提供有效的免疫保护作用.     

猪圆环病毒2型在转管微载体培养PK-15细胞中增殖动态

为提高猪圆环病毒2型(PCV2)的增殖规模及单位体积内的病毒滴度,本研究利用转管微型反应器,采用荧光定量PCR检测方法,对PCV2在PK-15细胞中复制特性和增殖动态进行了系统研究。结果显示,转管(内置0.6 g纸片载体)中接种约2.98×107个DF-1细胞,培养7 d细胞增至1.93×108~2.0×108个,并确定培养7 d时为最佳接毒时间;病毒的最佳接种剂量为120.8 MOI,最佳收毒时间为接毒后的100 h,可达5.53E+06以上。细胞数增长与糖耗间呈明显平行关系,在细胞生长期内(168 h)平均每个细胞耗糖量为3.09×10-8g/24 h,可以根据糖耗量的多少推测细胞生长状态和数量。相同培养液中利用转管微型反应器培养PK-15细胞生产PCV2最终获得的病毒液毒价比转瓶培养毒价提高1.65倍。本实验为PCV2在生物反应器中大规模培养提供了参考依据。     

猪圆环病毒2型SD/2008株的分离鉴定及培养特性

应用PK15细胞从山东省某猪场分离到1株病毒,通过免疫过氧化物酶单层试验和全基因组序列分析,证明该分离株为猪圆环病毒2型(PCV-2,命名为SD/2008株),基因组全长1767bp,为PCV-2b基因型;感染PK15细胞后96h病毒含量最高,培养液含病毒基因组1.72×108copies/μL,连续培养120h不出现细胞病变;连传5代,病毒滴度稳定,维持在106TCID50/0.1mL左右;传代PK15细胞时同步接种病毒后18h,用300mmol/L的D-氨基葡萄糖处理细胞,病毒滴度可以提高5.62倍。     

同步接毒法生产鸡传染性法氏囊病细胞苗的试验

鸡传染性法氏囊病细胞苗生产过程中,在制备鸡胚成纤维细胞(CEF)的同时接入种毒(称同步接毒法),与细胞形成致密单层后再接入种毒(称异步接毒法)两种方法相比较,同步接毒法比异步接毒法的病毒含量略高,且缩短了培养时间,简化了生产工艺。     

猪圆环病毒悬浮培养工艺研究

为了降低疫苗生产成本,本研究通过优化悬浮细胞培养和猪圆环病毒2型的增殖工艺,提高了病毒液的滴度和产量,从而提升疫苗效果。研究发现,悬浮细胞最佳的传代密度和培养时间分别为1.0×106 CFU/mL和72 h,在猪圆环病毒2型的增殖工艺优化中确定的最佳接毒剂量为5%,病毒液滴度最高的收毒时间为72 h。     

猪流行性腹泻病毒在微载体培养Vero细胞上的增殖试验

为了探索猪流行性腹泻病毒(PEDV)在微载体培养Vero细胞上的增殖效果,采用2 L生物反应器进行微载体培养Vero细胞和PEDV繁殖,并摸索细胞生长和病毒繁殖的最佳条件,检测病毒滴度,与方瓶培养的病毒滴度进行比较。结果显示:当微载体为5 g,种子细胞数约3.05×107个,采用灌注式培养,Vero细胞经72 h长满单层,细胞数约为3.02×109个,此时用滴度为104.45TCID50/m L的PEDV 1 m L感染Vero细胞,培养96 h,微载体上80%细胞脱落时收毒,培养的PEDV具有较高的病毒滴度。相同病毒在微载体系统与方瓶上进行同步传代,经检测病毒滴度均有提高,但在微载体系统上培养的PEDV最高滴度可达到106.05TCID50/m L,明显高于方瓶培养。本试验为研究PEDV能更好适应Vero细胞,提高PEDV产量提供技术支持。     

猪传染性胃肠炎病毒TH-98株在不同细胞增殖特性的研究

对猪传染性胃肠炎病毒TH-98分离株进行了在ST，PKl5及IBRS2三种细胞增殖特性的研究，以及不同培养条件对其繁殖滴度的影响。结果表明，在静置培养每件下，用含15％FBS的生长液进行细胞传代，对ST，PKl5及IBRS2三种细胞生长以及接毒后对CPE判定都起到良好效果。但在旋转条件下培养细胞，用l0％的FBS生长液即可使三种细胞生长良好，用ST细胞增殖病毒的滴度明显高于其他两种细胞。旋转培养条件下增殖病毒始终比静置培养繁殖病毒的滴度高，在维持液中加入胰酶未见有病毒滴度的明显提高。     

热应激对嵌合猪圆环病毒1-2在PK-15细胞中增殖的影响

为提高表达猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因的重组猪圆环病毒1型(PCV1)疫苗株(嵌合猪圆环病毒1-2,PCV1-2)在细胞内的增殖水平,本研究采用PK-15细胞,应用活细胞计数、间接免疫荧光及Taq Man荧光定量PCR等方法测定不同热应激温度和持续时间处理后细胞生长和病毒增殖的情况。结果显示,PK-15细胞可耐受41℃和43℃的培养环境,并且与常规培养方法相比43℃条件下热应激处理12 h可显著促进PCV1-2在细胞内的增殖,其病毒效价可达10~(6.0)TCID(_50)/m L以上。另外,热应激处理后病毒核酸拷贝数的动态变化表明,热应激对PCV1-2复制的影响主要在接毒后24 h至48 h内显现。本研究确定了促进PCV1-2增殖的热应激条件,为提高PCV1-2疫苗产量提供了方法。     

猪视网膜上皮细胞的分离培养与鉴定

旨在建立猪视网膜上皮细胞(PRECs)的分离纯化及传代培养方法。采用组织块贴壁法和消化法分离猪视网膜细胞(PRCs),经差速消化法纯化细胞，筛选确定最优培养条件并鉴定细胞生物学特性。结果：消化法分离的细胞约1周长成单层，组织块贴壁法约2周长满单层，但活力更高；PRCs主要形态为长梭形和大理石样，呈现为2种形态细胞混合生长；差速消化法纯化细胞后，经间接免疫荧光鉴定细胞角蛋白(CK18和CK19),确定该细胞为上皮细胞；细胞接种猪圆环病毒2型(PCV2)可产生明显病变。综上，本试验成功分离获得PRECs,含胎牛血清浓度为12%的α-MEM为最优培养基，该细胞支持PCV2增殖并产生明显的细胞病变，为进一步建立稳定传代的猪视网膜上皮细胞系及研究PCV2感染及致病机理提供基础。     

带毒传代工艺在狂犬病细胞苗生产中的应用

狂犬病细胞苗的传统生产方法是取长成“ ”的BHK21细胞单层，弃去生长液(血清含量100mL／K)，按1．5万mL细胞培养瓶每瓶40mL的量接毒旋转，使毒液浸润整个细胞面，37℃旋转吸附40～60min，加入2000mL维持液(含血清30mL／L)，37℃旋转培养48h后，调pH至7．2～7．4，继续培养至96～120h，冻毒，收获细胞培养物。传统方法的生产成本高，劳动强度大，种毒使用量大。2004年笔者采用带毒传代工艺生产狂犬病细胞苗，效果较为满意。     

犬Ⅰ型腺病毒TN株的分离鉴定

应用MDCK细胞采用单层吸附接毒和带毒传代的方法，从新疆阿克苏送检的犬粪便中分离出1株犬腺病毒，并对其进行了形态学、理化学、血清学、动物感染试验、分子生物学鉴定。结果证明所分离的TN株为1株CAV－I病毒的强毒株。     

猪圆环病毒2型的分离与鉴定

利用PCR方法，从疑似断奶猪多系统衰竭综合征(PMWS)的自然病例的淋巴结和脾脏中扩增出了预期长度的猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus type 2，PCV2)的DNA片段，并用限制性内切酶对PCR产物进行了酶切鉴定。将经PCR扩增和酶切鉴定为PCV2阳性的组织样品匀浆液接种到无PCV污染的PK15细胞中传代，经间接免疫荧光检查，在接毒细胞内观察到了特异性免疫荧光；用接毒细胞制备超薄切片，在电镜下观察到了直径大约为17nm的圆形病毒样粒子和大量不同形态的胞浆内包涵体。由此表明分离出的病毒为猪圆环病毒2型。     

鸡痘鹌鹑化弱毒活疫苗生产工艺改进试验

优化鸡胚成纤维细胞(CEF)培养鸡痘鹌鹑化弱毒细胞苗的生产工艺中,采用同步接毒法即在制备鸡胚成纤维细胞时同时接毒和异步接毒法即鸡胚成纤维细胞形成单层以后接毒,两种方法进行对比。结果以同步接毒法可以降低生产成本,缩短细胞培养的时间,简化工艺。