同步接毒法生产鸡传染性法氏囊病细胞苗的试验

鸡传染性法氏囊病细胞苗生产过程中,在制备鸡胚成纤维细胞(CEF)的同时接入种毒(称同步接毒法),与细胞形成致密单层后再接入种毒(称异步接毒法)两种方法相比较,同步接毒法比异步接毒法的病毒含量略高,且缩短了培养时间,简化了生产工艺。     

猪细小病毒CG-05株在ST细胞上的增殖规律研究

通过将猪细小病毒CG-05株同步接种于ST细胞,测定不同时间收获的病毒液的TCID50和HA,研究了CG-05株病毒在ST细胞上的增殖规律。病毒接种后镜检观察接毒细胞,在接种病毒后24 h,即可在细胞较少的区域看到非常轻微的病变。测定病毒TCID50,检测到接毒后培养17h病毒已经明显增殖;当培养到40h左右,其TCID50即接近高峰,达到10-7.2/0.1mL以上,并进入平台期;继续培养,TCID50最高可达到10-8.5/0.1mL,且直到122 h也不见明显降低。病毒HA价也出现同样的平台期,但比TCID50的平台期出现得晚,到50 h才进入平台期。结果表明,用ST细胞培养CG-05株病毒,接种病毒培养56～96 h后,如病变达到80%以上,且细胞脱落已形成20%以上空斑,此时收获病毒可获得高效价的病毒液。该研究可为制备高效价的PPV病毒抗原提供数据资料。     

重组禽流感病毒H5亚型Re-7株在MDCK细胞上增殖条件的研究

为了探索重组禽流感病毒H5亚型Re-7株在MDCK细胞上的增值规律,确定最适的接毒量与最佳收获时间。将重组禽流感病毒H5亚型Re-7株接种至100 L生物反应器全悬浮无血清培养的MDCK细胞进行增殖试验,检测不同病毒感染量,接种后不同时间病毒的HA、TCID50以及EID50。根据确定的最佳增值条件将病毒接种到MDCK细胞中进行大规模增殖培养。确定最适接毒量MOI为10~(-2),最佳收获时间为60 h。在100 L生物反应器中进行重复验证,获得稳定的试验结果,病毒HA达到1∶1024,每1 m L病毒含量达到107.33TCID50,每0.1 m L病毒含量达到106.83EID50。研究为重组禽流感病毒H5亚型Re-7株的全悬浮规模化生产提供了相对稳定的参数指标。     

PK-15细胞微载体悬浮培养及PCV2增殖工艺研究

研究表明,PCV2仅在PK15等少数哺乳动物细胞上增殖,但由于PCV2毒力弱,且不产生细胞病变,获得高滴度病毒难度较大~([1])。因此,PCV2的培养滴度高低已成为制约现有疫苗质量的关键瓶颈之一。为建立在生物反应器内微载体逐级放大培养PK-15细胞和增殖PCV2技术,本研究以德国Sartorius14 L生物反应器微载体悬浮培养PK-15细胞,对PK-15细胞初始接种密度、搅拌转速、微载体浓度、PCV2接毒时间、接毒剂量、收毒时间等工艺参数进行了摸索和优化~([2-3])。结果表明:3 g/L的微载体和60 r/min的搅拌转速下,采用0.5×10~6cells/mL的初始接种密度操作工艺可获得最佳PK-15细胞生长效能。细胞生长后6 h接毒,采用感染复数(MOI)为0.5的接毒比例,细胞接毒后在微载体上生长96 h可获得最高的PCV2增殖滴度10~(8.5)TCID_(50)/mL,利用该工艺,经过消化转移将PK-15细胞从14 L反应器放大至42 L反应器,微载体上细胞贴附均匀、生长旺盛,42 L反应器中培养72 h细胞密度可达39.0×10~5 cells/mL,病毒滴度10~(8.3)TCID_(50)/mL,应用生物反应器培养PCV2滴度较常规转瓶培养工艺提高了近10倍。进一步表明PCV2悬浮培养放大与接毒工艺稳定,为下一步实现工业级规模化生产奠定基础。     

断奶前仔猪经胎盘感染猪圆环病毒2型对猪流行性腹泻病毒引起的肠炎的影响

本文报道了经胎盘感染猪圆环病毒2型对猪流行性腹泻病毒引起新生仔猪肠炎的影响。6头怀孕母猪被随机分为感染组和对照组,每组3头。感染组3头怀孕母猪在分娩前3周鼻内接种6mLPCV2组织培养毒(病毒含量为1.2×105TCID50/mL,毒株为SNUVR000470);对照组3头怀孕母猪同时接种正常细胞培养上清液。PCV2感染母猪所产的30头仔猪被随机分为A、B两组,每组15头;对照组非感染母猪所产的30头仔猪被随机分为C、D两组,每组15头。A和C组仔猪在3日龄口服2mLPEDV第3次传代病毒液(病毒含量为1×106.5TCID50/mL,毒株为SNUVR971496)。在感染后36、48和72h测量绒毛高度与隐窝深度的平均比值,A组PCV2感染母猪所产的仔猪感染PEDV与C组PCV2阴性母猪所产的仔猪感染PEDV差异显著。在感染后24h,A组PEDV感染仔猪的空肠组织中比C组检测到更多的PEDV核酸。此后,在感染后36、48、60和70h,C组PCV2阴性母猪所产的PEDV感染仔猪的空肠组织中比A组检测到更多的PEDV核酸。由此推断,经胎盘感染PCV2显著影响PEDV所致疾病的临床进程。     

猪圆环病毒2型细胞培养适应毒株的培育和鉴定

从临床表现为仔猪断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）淋巴组织病料，经聚合酶链式反应（PCR）证实为猪圆环病毒2型（PCV2）感染，采用无污染的猪肾细胞系（PK15）分离培养，并连续传代培育成一株细胞培养适应毒，命名为PCV2／LG株。分离毒株经细胞培养，于第25代后毒价显著升高，于第35代毒价可达10^5.6TCID 50/mL。采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法（IPMA）、免疫电镜技术、分子克隆及核酸序列分析等鉴定表明，分离株感染细胞后病毒抗原主要分布在细胞核及细胞质中；病毒感染的阳性细胞呈散在分布，阳性细胞数可达50％以上；免疫电镜观察到与PCV2特异抗体结合形成的病毒免疫复合物呈实心小颗粒样粒子团，病毒粒子直径约为17nm；病毒抗原基因组由1768个核苷酸组成，与GenBank登录的8个PCV2基因组序列同源性达96．2％以上。用2mL的病毒细胞培养物（10^5.6TCID 50/mL）接种30日龄PCV2抗体阴性仔猪3头，可引起典型PMWS临床症状。本研究为进一步开展该病毒的致病性、疫苗免疫、诊断及分子生物学等研究奠定了基础。     

猪圆环病毒2型灭活疫苗最小免疫保护剂量研究

猪圆环病毒2型(PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原,疫苗是防制该病的主要手段.为研究PCV2灭活疫苗的免疫效果,本研究将PCV2 SH株灭活,用生理盐水稀释成5×105.0TCID50/mL(高剂量)、2.5×1050 TCID50/mL(中等剂量)、1.25×105.0 TCID50/mL(低剂量)、6.3×104.0 TCID50/mL(超低剂量)4种剂量,与等量白油佐剂乳化后,通过断乳仔猪的免疫攻毒试验观察该灭活疫苗的免疫特性.结果表明,PCV2疫苗抗原含量大于1.25×105.0 TCID50/mL时免疫仔猪后均可以产生特异性抗体,能够明显减轻攻毒后仔猪的临床症状、缓解组织病变、降低病毒血症,对免疫猪有一定的保护效果,可以作为预防PCV2感染的疫苗使用.本研究为研制商品化的PCV2灭活疫苗提供实验依据.     

猪细小病毒在F81细胞和PK15细胞增殖的研究

将猪细小病毒(PPV)接种于F81和PK15细胞,研究不同的培养基、pH值、血清含量、细胞密度对病毒在细胞里增殖的影响,细胞毒液冻融3次后测半数组织细胞感染量(TCID50)。试验结果表明,接毒24 h后F81和PK15细胞都有病变产生,在细胞病变达到75%以上时收获细胞毒液,发现PPV在F81细胞和PK15细胞中均能增殖且病毒滴度比较高。测得F81细胞接种PPV最高滴度为108.71TCID50/mL;PK15细胞接种PPV最高滴度为108.73TCID50/mL。     

猪圆环病毒2型培养工艺比较研究

猪圆环病毒2型(PCV2)细胞内增殖滴度的提高是开发PCV2全病毒灭活苗的瓶颈问题。为克服该困难,探究高病毒滴度PCV-2规模化增殖工艺,采用PK-15细胞单层接毒、同步接毒与带毒传代3种增殖工艺对PCV2进行增殖,并应用细胞孵育剂D-氨基葡萄糖对各增殖工艺进行优化,最后通过间接免疫荧光试验对比分析不同的增殖工艺组病毒增殖滴度。结果表明,单层接毒、同步接毒以及带毒传代工艺生产的PCV2病毒滴度均符合规程要求(TCID_(50)/mL10~(5.5)),带毒传代(第5代)生产效果显著优于前两种工艺(P0.01);D-氨基葡萄糖的添加可将同类工艺下PCV2的病毒滴度提高1.6～3.16倍。     

猪流行性腹泻病毒培养的工艺参数优化试验

为了提高猪流行性腹泻病毒的病毒滴度,建立最优的病毒培养条件,对影响病毒培养的细胞培养时间、接毒剂量、收毒时间等条件进行了研究。结果表明:细胞培养时间为主要因素,对于流行性腹泻病毒毒价影响较为显著,细胞培养72 h接毒平均毒价为107.44TCID50/0.1 m L,均高于其他两组;而收毒时间则为次要因素,平均毒价为107.21TCID50/0.1m L;接毒剂量影响不显著,平均毒价为107.08TCID50/0.1 m L,本试验最佳工艺组合为细胞培养72 h接毒、接毒剂量为0.1%、收毒时病变程度为60%。