气肿疽梭菌NanA基因核酸疫苗的免疫效果评价

为了检测气肿疽梭菌NanA基因核酸疫苗的免疫效果,在成功构建pVAX1-NanA真核表达重组质粒的基础上将其转染至Vero细胞,通过间接免疫荧光鉴定其表达,并将成功构建的pVAX1-NanA质粒大量提取后免疫Balb/c小鼠,设置pVAX1-NanA核酸疫苗组、pVAX1空载体组和PBS对照组。对小鼠采血并分离血清,用ELISA测定血清中的IgG、IgG1、IgG2a抗体水平和IFN-γ、IL-4细胞因子水平;第3次免疫2周后,用流式细胞仪测定小鼠脾脏中的CD4~+和CD8~+T细胞水平。结果表明,pVAX1-NanA核酸疫苗免疫Balb/c小鼠后,小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a的抗体水平极显著高于pVAX1空载体组和PBS对照组(P0.01);IFN-γ和IL-4细胞因子水平极显著高于pVAX1空载体组和PBS对照组(P0.01);CD4~+、CD8~+T细胞分析表明, pVAX1-NanA免疫组的CD4~+和CD8~+T细胞水平显著高于pVAX1组和PBS对照组(P0.05),pVAX1-NanA核酸疫苗组的CD4~+/CD8~+T细胞比值高于pVAX1空载体组与PBS对照组(P0.05),pVAX1空载体组和PBS对照组之间无显著差异(P0.05)。试验成功制备了pVAX1-NanA核酸疫苗,且pVAX1-NanA核酸疫苗可刺激Balb/c小鼠产生体液免疫和细胞免疫。     

评价牛型布鲁氏菌疫苗免疫保护力BALB/c鼠模型的建立

为建立评价流产布鲁氏菌疫苗株免疫保护力的小鼠模型,选取6周龄雌性BALB/c小鼠为试验动物,随机分为3组(n=40):A19免疫攻毒组、非免疫攻毒组和PBS对照组。A19免疫组腹腔接种BALB/c鼠A19 5.0×10⁴ CFU,非免疫攻毒组和PBS对照组均接种PBS液0.2 mL。免疫后45 d,A19免疫攻毒组和非免疫攻毒组BALB/c鼠以3.0×10⁴ CFU剂量的2308强毒株攻击,攻毒后15和45 d分别剖杀小鼠,取小鼠脾脏称重、细菌分离、病理组织学检测。结果表明,攻毒后15 d,A19免疫攻毒组与未免疫攻毒组和PBS对照组之间克脾指数差异显著(P<0.05);攻毒后45 d,A19免疫攻毒组与PBS对照组的克脾指数差异不显著(P>0.05),与未免疫攻毒组克脾指数差异显著(P<0.05);免疫攻毒组的小鼠组织病理变化明显轻于未免疫攻毒组。结果表明,用BALB/c鼠为试验动物,以A19为疫苗参考株建立动物实验模型可以应用于牛型布鲁氏菌疫苗免疫保护力评价。     

菊粉对铜绿假单胞菌flgE基因DNA疫苗的免疫增强作用

为研究菊粉对铜绿假单胞菌flgE基因DNA疫苗的免疫增强作用,本研究将铜绿假单胞菌的flgE基因克隆于真核表达载体pcDNA3.1(+)中制备DNA疫苗,分别以该DNA疫苗(100μg/只)和菊粉佐剂+DNA疫苗免疫BALB/c小鼠(质粒100μg/只,终浓度20%菊粉),同时设置菊粉灌胃对照组(600 mg/kg)以及灭活疫苗(100μL/只)、鞭毛蛋白(100μL/只)、pcDNA3.1(+)空载体(100μg/只)和PBS对照组(100μL/只)。每两周免疫一次,共免疫3次。利用间接ELISA检测免疫后血清特异性抗体水平,MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖水平,双抗夹心ELISA检测IFN-γ分泌情况,计算强毒攻击后各组小鼠的存活数及保护率。结果显示,菊粉佐剂组和菊粉灌胃组小鼠产生的抗体水平与DNA疫苗组相比无明显差异(p0.05),且显著低于灭活疫苗组和鞭毛蛋白组(p0.05);菊粉佐剂组对小鼠脾淋巴细胞的刺激值(SI值)和IFN-γ水平与鞭毛蛋白组相当,明显高于菊粉灌胃组和DNA疫苗组(p0.05);菊粉佐剂组和菊粉灌胃组对小鼠的保护率均高于DNA疫苗组,但低于灭活疫苗组,表明以菊粉预先灌胃和以菊粉为佐剂均可在一定程度上提高flgE基因DNA疫苗对小鼠的保护效率,但仍不及传统的灭活疫苗。本实验为铜绿假单胞菌DNA疫苗的研究及菊粉在DNA疫苗中的应用奠定基础。     

日本血吸虫重组IAP蛋白的免疫保护效果评估

为研究日本血吸虫凋亡蛋白抑制因子（inhibitor of apoptosis protein of Schistosoma japonicum,SjIAP）重组蛋白诱导BALB/c小鼠的免疫保护效果,利用PCR技术扩增SjIAP基因,构建重组表达质粒pET-28a（＋）-SjIAP,诱导表达重组SjIAP蛋白,并利用重组蛋白制备兔源多克隆抗体血清。然后,选用SjIAP重组蛋白免疫BALB/c小鼠,利用ELISA检测免疫小鼠血清中的特异性抗体水平,以及免疫小鼠脾脏淋巴细胞在SjIAP重组蛋白刺激后产生的细胞因子水平。强化免疫后,将小鼠进行血吸虫尾蚴攻虫试验,感染38 d,进行剖杀,计算虫体减虫率及肝脏减卵率。Western blot结果表明本研究制备的兔源多抗血清能特异性识别SjIAP重组蛋白。ELISA检测表明免疫SjIAP重组蛋白可诱导较高水平的IgG及IgG亚型（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3）抗体和IFN-γ、IL-2及IL-4细胞因子。动物试验表明,免疫SjIAP重组蛋白的小鼠与PBS组相比分别获得了31.5%的减虫率和37.2%的肝脏减卵率。免疫SjIAP重组蛋白能诱导小鼠获得一定减虫和减卵保护效果,提示血吸虫凋亡蛋白抑制因子可作为抗血吸虫病的疫苗候选分子。     

寨卡病毒DNA疫苗pVAX-ZikaME构建及新型佐剂的筛选

选用1种递送载体与4种免疫刺激增强剂混合,与赛卡病毒DNA疫苗pVAX-ZikaME联合免疫BALB/c小鼠,观察新型佐剂对DNA疫苗抗原的免疫应答能力。首先构建表达ZikaME蛋白的DNA疫苗,然后将重组质粒转染至HEK293细胞,采用Western blot检测目的蛋白的表达。用配制的佐剂与重组的DNA疫苗联合免疫BALB/c小鼠,通过细胞亚群检测、淋巴细胞增殖试验和特异性抗体检测验证新型佐剂的增强免疫效果。结果显示,Western blot检测所构建的DNA疫苗表达68 000目的蛋白。用重组疫苗辅以佐剂免疫小鼠,免疫35 d时淋巴细胞增殖刺激组刺激指数、细胞亚群分化、特异性抗体水平均高于对照PBS组(P0.05)。结果表明,DNA疫苗pVAX-ZikaME辅以新型佐剂免疫小鼠可增强机体对该疫苗的免疫应答能力。     

幽门螺旋杆菌lpp20-cagA融合基因在乳酸球菌中的表达及免疫原性研究

为研究载体疫苗对幽门螺旋杆菌(HP)感染的免疫保护作用,本实验应用无缝克隆技术将HP的两个候选抗原基因lpp20和cagA直接连接后克隆于表达载体pNZ8149中,构建重组表达质粒pNZ8149-lpp20-cagA。将重组质粒电转化乳酸球菌(L.lactis)NZ3900,构建了不含任何抗生素筛选标记的食品级原核表达系统pNZ8149-lpp20-cagA/NZ3900,经nisin诱导表达,得到的重组蛋白分子量约为50.3ku。将以上得到的重组L.lactis灌胃免疫BALB/c小鼠,利用ELISA方法分别检测各组小鼠血清中IgG、IgG1、IgG2a及细胞因子IL-4、IFN-γ水平。结果显示,与对照组相比,实验组小鼠血清中IgG、IgG1、IL-4水平显著升高,表明重组蛋白Lpp20-CagA可以诱导良好的体液免疫应答;利用HP攻毒经重组菌灌胃免疫的小鼠,检测小鼠胃组织中HP的定植密度及脲酶活性,结果显示重组蛋白Lpp20-CagA在一定程度上可以减少HP在小鼠胃组织中的定植。本实验构建的载体疫苗在预防HP感染方面具有重要的应用价值。     

牛分枝杆菌二价组合及融合DNA疫苗的免疫效果

利用PCR技术和重叠延伸剪接(SOE)技术扩增牛分枝杆菌ag85b、mpb64基因和ag85b-mpb64融合基因,连接真核表达载体pCDNA3.1(+),构建二基因融合(pCDNA-MPB64/Ag85B,pCMA)和二价组合(pCDNA-Ag85B+pCDNA-MPB64,pCA+pCM)DNA疫苗.以牛分枝杆菌卡介苗(BCG)为阳性对照,以pCDNA3.1(+)和PBS为阴性对照,免疫BALB/c小鼠,检测血清特异性抗体水平、脾淋巴细胞增殖情况和IFN-γ及IL-2分泌情况.结果显示:融合DNA疫苗组免疫小鼠血清抗体水平、刺激值(SI值)及IFN-γ和IL-2的分泌水平均明显高于其他各组(P<0.05).二价组合DNA疫苗组的体液和细胞免疫指标与BCG组相当(P>0.05),而显著高于两阴性对照组(P<0.05).     

分泌型和非分泌型表达猪细小病毒VP2蛋白的重组乳酸菌经口免疫小鼠的效果分析

对比分析在不同细胞部位表达猪细小病毒（PPV）主要免疫保护性抗原VP2蛋白的重组干酪乳杆菌系统作为口服疫苗的免疫效果。将构建的细胞表面表达和分泌表达猪细小病毒VP2蛋白的重组干酪乳杆菌分别经口免疫BALB／c小鼠，免疫分3次进行，时间间隔为2周，每次连续接种3d，每只小鼠每次接种100μL10^10CFU／mL的菌量，对照组小鼠接种相同剂量的PBS。初免后不同时间收集免疫小鼠粪便及肠黏液样本测定小鼠产生抗PPV的特异性sIgA抗体水平，采集小鼠血液样本测定其血清中抗PPV的特异性IgG抗体水平。间接ELISA检测结果表明，两种表达系统均能诱导小鼠产生黏膜及系统免疫应答，分泌型的重组菌系统免疫小鼠诱导机体产生的抗PPV的特异性sIgA和IgG抗体水平高于细胞表面表达型的重组菌系统的免疫效果，表明分泌型的重组乳酸菌作为活菌疫苗具有更好的免疫性。     

PRRSV GP5和M蛋白滴鼻免疫小鼠后特异性抗体的中和活性分析

为探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5和M蛋白滴鼻免疫小鼠后产生的特异性抗体的中和活性,研究以原核表达的重组蛋白GP5和M为抗原分别与霍乱毒素B亚基(CTB)佐剂按10∶1的比例混合制备成CTB黏膜佐剂疫苗,滴鼻免疫小鼠,于首次免疫后0,7,14,21,28,35,42 d收集唾液和血清样品,利用间接ELISA方法分别检测免疫小鼠唾液中特异性抗体IgA,结果均于28 d时S/N值达到最高,ELISA效价均为1∶2;血清中特异性抗体IgG分别于21,28 d时S/N值达到最高,ELISA效价均为1∶800。通过本实验室建立的基于PAM细胞中和试验方法分别检测唾液中特异性抗体IgA和血清中特异性抗体IgG中和滴度均1∶2,结果表明PRRSV GP5和M蛋白滴鼻免疫小鼠后产生的特异性抗体未达到免疫保护作用的中和抗体水平。     

表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的重组乳酸菌口服免疫小鼠特异性免疫应答分析

将表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的重组乳酸乳球菌pNZ8112-Sa/NZ9000经口服免疫BALB/c小鼠,在免疫后的不同时间收集免疫鼠粪便样品,断尾采血收集血液样品并分离血清,用间接ELISA技术检测血清中的IgG抗体及血清和粪便中的IgA抗体的动态产生规律;在加强免疫后流式细胞仪检测分析外周血T细胞的变化情况及无菌收集免疫鼠的肠黏液,经中和试验检测其抗体的中和能力。结果表明重组菌株口服免疫小鼠后血清中的IgG和IgA抗体产生能力由于非特异性干扰不能确定,外周血中T细胞百分数在实验组和对照组间变化不显著;粪便中的IgA抗体水平产生效果明显;黏液的抗体具有一定的中和能力,其效价检测结果为1:36。