牛病毒性腹泻病毒不同检测方法的比较研究

采用Idexx公司抗原捕获ELISA试剂盒对新疆部分地区160份牛血清进行了牛病毒性腹泻病毒抗原检测,结果有6份样品为阳性,对该6份血清用BVDV阴性血清进行了系列稀释后,分别用抗原捕获ELISA、RT-PCR和荧光RT-PCR进行检测,发现RT-PCR方法比ELISA检测灵敏度高10-100倍,荧光RT-PCR比RT-PCR灵敏度高约10-100倍。     

基因2型牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立和初步应用

根据已发表的牛病毒性腹泻病毒基因1型(BVDV-1)和2型(BVDV-2)5非编码区(5-UTR)的序列,分别设计了针对BVDV-1型、BVDV-2型以及针对BVDV-1和BVDV-2两型的特异性引物和通用引物,以标准参考株BVDV-1 NADL株和BVDV-2890 株为对照,建立了分别能检测BVDV-1、BVDV-2和BVDV-1/BVDV-2的RT-PCR 检测方法.在此基础上,进一步对疑似BVDV-2感染牛的临床病料组织(脾、淋巴结、心肌、血液等)检测结果表明,在所检测的18份样品中,BVDV-2阳性8份(44%).经RT-PCR鉴定为阳性的组织病料,进一步通过MDBK 细胞进行病毒分离,病毒分离率为100%;结合感染细胞病变观察,间接免疫荧光试验RT-PCR和序列测定鉴定,所分离的病毒均为BVDV-2.上述研究表明,该RT-PCR检测方法敏感、特异;并证实我国牛群已存在BVDV-2的污染或感染.     

某农场受体牛血清中牛传染性鼻气管炎抗体检测

用ＭＤＢＫ细胞，采用血清微量中和试验方法，对黑龙江省某进口牛精液的奶牛场的受体牛进行血清抗牛传染性鼻气管炎病毒抗体检测。用一定量的已知牛传染性鼻气管炎病毒通过观察ＭＤＢＫ细胞病变情况，检查被检血清中ＩＢＲ中和抗体，结果发现，所检２７份血清中，其抗ＩＢＲ病毒抗体均为阳性，且抗体效价相当高。     

猪瘟病毒和牛病毒性腹泻病毒双重荧光RT-PCR检测方法的建立

为同时检测猪源临床样本中的猪瘟病毒(CSFV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV),基于这两种病毒的5'UTR序列设计特异引物和TaqMan探针,建立了一种检测CSFV和BVDV的双重荧光RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、最低检出限和重复性等进行了评价。结果显示,该方法只对CSFV和BVDV呈现特异性扩增,对猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪圆环病毒2型不发生交叉反应,对阳性标准对照CSFV-5'UTR-RNA、BVDV-1-5'UTR-RNA和BVDV-2-5'UTR-RNA,最低可分别检出27、36和32拷贝/μL。该方法的组内和组间试验Ct值变异系数介于0.11%～1.20%,具有良好的重现性。对152份猪组织样本用该方法进行CSFV和BVDV核酸检测,结果检出CSFV阳性样本16份,BVDV阳性样本3份,CSFV和BVDV双阳性样本1份,与国标和OIE《陆生动物诊断试验和疫苗》相应的荧光RT-PCR方法阳性符合率为100%。结果表明,本研究建立的双重荧光RT-PCR方法可用于临床样本中的CSFV和BVDV检测,从而为猪瘟防制和净化提供了一种有效的技术手段。     

牛传染性鼻气管炎病毒LUXTM新型荧光PCR检测方法的建立

本研究针对牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）高度保守的gC基因设计单标记并具有自身荧光淬灭功能的LUX^TM引物，建立L刚新型实时荧光PCR方法用于快速检测IBRV。该方法对四株IBRV细胞培养物的检测均呈典型阳性反应，而对其它动物疱疹病毒以及健康牛组织DNA和细胞对照的检测结果为阴性，检测时间包括核酸提取仅需1h～2h。试验表明，LUX^TM荧光PCR法对IBRV细胞增殖病毒液的检测敏感性可达0．04TCID50，比病毒分离敏感性至少提高10倍；对10倍系列稀释的纯化IBRV核酸样品，L刚荧光PCR的检测敏感性比常规PCR可提高10^3倍。将病毒液添加到健康牛精液和血液样品中，该荧光PCR可检测到牛冻存精液中40TCID50牛抗凝全血、血清和临床精液中0．04TCID50的病毒，说明对临床样品的检测有效。本研究所建立的LUXTM荧光PCR方法快速敏感，适合应用于活牛及其遗传物质的进出口检疫、养牛业疾病防控等领域对IBRV的快速检测。     

牛病毒性腹泻病毒TaqMan探针荧光RT-PCR方法的建立和临床应用

为建立一种牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的快速检测方法,本研究根据国内BVDV流行毒株5’-UTR序列保守区域设计1对特异性引物和TaqMan探针,并优化了反应条件,最终建立了一种检测BVDV基因1型(BVDV-1)的TaqMan探针荧光RT-PCR检测方法,并开展7省份BVDV-1型检测和流行情况分析。结果显示：所建立方法能够特异性检测出BVDV-1,与基因2型BVDV、猪瘟病毒、边界病毒、牛冠状病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛轮状病毒等病原无交叉反应;灵敏度高,最低检测下限为4.3 copies/μL;批内和批间变异系数均小于2%,重复性良好。7省份规模化牛养殖场BVDV-1型平均阳性率为17.40%(161/925),序列分析表明我国主要流行的为BVDV-1a,BVDV-1c亚型。本研究成功建立了一种良好的诊断BVDV的方法,监测地区优势流行毒株为BVDV-1a与1c亚型,为临床中BVDV早期诊断和流行病学调查监测提供了技术和数据支持。     

胎牛血清中牛病毒性腹泻病毒2型毒株分离及脱脂奶粉中抗体的检测

本研究旨在对进口胎牛血清中的牛病毒性腹泻病毒（BVDV）进行分离及鉴定。利用BVDV抗原和抗体检测试剂盒检测,提取胎牛血清中的病毒RNA,用5'-UTR巢式PCR进行扩增,PCR扩增产物连接pMD19-T进行测序分析。胎牛血清样品接种MDBK细胞,进行细胞传代培养,通过细胞分离培养、直接免疫荧光抗体检测对实验室进口胎牛血清样品进行病毒分离及鉴定,应用DNAStar对BVDV 5'-UTR、N^pro与GenBank中公布的瘟病毒参考株进行多序列比对,采用Mega 6.0进行遗传进化分析。同时通过包被脱脂奶粉进行间接ELISA检测其中的BVDV抗体。结果显示,胎牛血清中BVDV抗原和抗体均为阳性,并且从胎牛血清中成功分离到一株新的牛源BVDV,命名为BVDV-GC株,该病毒株在MDBK细胞上进行增殖培养时未能引起细胞病变;5'-UTR与N^pro PCR扩增为阳性,扩增产物大小均与预期相符;直接免疫荧光检测荧光信号为阳性;病毒滴度为10^-3.6TCID₅₀/0.1 mL;遗传进化分析表明,该分离株与USMARC-60779（BVDV-2）株有较近的亲缘关系,同属于BVDV-2型毒株;通过包被脱脂奶粉和商品化的ELISA试剂盒进行检测,结果表明脱脂奶粉中存在BVDV抗体。本研究从进口胎牛血清中分离出1株BVDV-2型非致细胞病变病毒,从脱脂奶粉中检测到BVDV抗体,表明进口胎牛血清和脱脂奶粉中都存在BVDV抗原和抗体污染,本研究为后续试验分析提供参考。     

牛白血病病毒LUX^TM实时荧光聚合酶链式反应检测方法的建立

采用LUXTM新型荧光PCR技术原理,设计并合成1对单标记LUXTM荧光引物.建立了LUXTM荧光PCR和RT-PCR方法,可快速检测牛白血病病毒(BLV)前病毒DNA和病毒RNA.结果显示所建立的LUXTM荧光PCR/RT-PCR体系可特异检测牛白血病病毒核酸,而对蓝舌病、牛病毒性腹泻-粘膜病、水泡性口炎、口蹄疫、牛流行热、牛传染性鼻气管炎等病毒核酸以及牛结核分支杆菌、大肠杆菌、健康动物组织核酸扩增均呈阴性反应.敏感性实验表明LUXTM荧光RT-PCR对RNA前病毒的检测敏感性达0.49 ng/μL,荧光PCR对pTblv-gp51重组质粒的检测敏感性可达0.138拷贝,比OIE规程的巢式PCR方法高104倍以上.采用该方法从血清学阳性临床牛血清中检出BLV阳性样品.     

牛病毒性腹泻病毒两种基因型双重RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立牛病毒性腹泻病毒(BVDV)双重RT-PCR检测方法,根据BVDV-1(AF091605.1、KF501393.1、MK204904.1、MN513404.1和MG923683.1)和BVDV-2(AF502399.1、MG436782.1、 AF145969.1、KC176777.1和MN513411.1)流行毒株5′-UTR保守序列设计2对特异性引物,通过优化反应条件,建立可同时检测BVDV-1和BVDV-2的双重RT-PCR方法。结果显示,该检测方法重复性好、特异性强,可分别检测出BVDV-1和BVDV-2核酸,与牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCV)、牛副流感病毒3型(BPIV-3)、猪瘟病毒(CSFV)均不发生交叉反应;最低检测量为1×10~3拷贝/μL和1×10~2拷贝/μL;对达州及周边地区的332份临床样品进行检测,结果表明,该地区BVDV-1阳性率为7.83%,BVDV-2阳性率为0.90%,未检出BVDV-1和BVDV-2混合感染的临床样品。综上所述,建立的双重RT-PCR检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和临床适用性,可用于BVDV的临床诊断和分子流行病学调查。     

牛肠道病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立快速、准确地检测牛肠道病毒(BEV)及对北京周边地区牛群中BEV感染情况进行检测,本研究通过设计合成扩增BEV 5＇UTR序列的引物及探针建立了检测BEV的通用型TaqMan荧光定量RT-PCR快速检测方法并对反应条件进行了优化.该方法对BEV的最小检测量为0.1 TCID50/0.1mL,敏感性比病毒分离法高10倍.而且该方法对其他牛相关病毒均无交叉反应.用3批试剂对3个稀释度的BEV培养物进行批内和批间重复性试验,其变异系数均小于1.1％,表明该方法具有良好的重复性.采用该方法对北京周边地区牛群采集的852份临床样品进行检测,并与病毒分离方法比较,两种方法检测结果完全一致.因此,本研究所建立的BEVTaqMan RT-PCR检测方法具有快速、准确、特异性强、敏感性高、重复性好的优点,为国内BEV的检测提供了有力的技术支持.本研究首次通过病毒核酸检测证明了我国部分地区的牛群中存在BEV感染.     

牛病毒性腹泻病毒RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中登录的牛病毒性腹泻病毒(BVDV)基因序列,设计合成了1对特异性引物,建立了检测BVDV的RT-PCR方法。通过对该方法的特异性、敏感性和重复性进行试验,结果显示,该方法可从BVDV标准毒株Oregon C24V中扩增出471 bp的特异性片段,而对猪瘟病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒、MDBK正常细胞的扩增结果均为阴性。经对标准毒株的细胞毒进行检测,其敏感度达10^-1 TCID₅₀/mL。应用该方法对临床腹泻病牛各脏器样品进行检测,结果比病毒分离方法更为敏感,操作简便。表明建立的RT-PCR方法具有特异、灵敏、高效、快速的特点,可用于BVDV的临床检测及流行病学监测。     

Comparative evaluation of the fluorescent antibody test and microtiter immunoperoxidase assay for detection of bovine viral diarrhea virus from bull semen.

An indirect immunoperoxidase staining technique (IP) is described for the detection of bovine viral diarrhea virus (BVDV) in bovine semen. The performance of the IP was compared to the reference immunofluorescent staining test in its ability to detect BVDV in 23 coded field semen samples. The IP assay which can be applied with ease to a large number of samples and does not require expensive fluorescence microscope equipment, appears to be an alternative method for BVDV detection. The IP assay can be strongly recommended for certification of BVDV-free bovine semen for artificial insemination and trading purposes and for laboratories which are not equipped for performing the immunofluorescent test.     

牛病毒性腹泻病毒一步法RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速检测牛病毒性腹泻病毒病原的方法,本研究根据GenBank上登录的牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)基因组序列,设计1对引物,建立了检测BVDV的一步法RT-PCR方法。该方法对牛传染性鼻气管炎病毒、猪瘟病毒、牛副流感病毒3型的扩增结果均为阴性,检测的敏感性达1 ng RNA。该一步法RT-PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,可以准确快速检测出极低含量的BVDV,将为BVDV的病原检测及分子流行病学调查等提供一种快速、灵敏、特异、准确的分子生物学检测方法。     

Insemination of Susceptible Heifers with Semen from a Non-Viraemic Bull with Persistent Bovine Virus Diarrhoea Virus Infection Localized in the Testes

Bulls shedding bovine viral diarrhoea virus (BVDV) in semen and simultaneously having a high concentration of circulating antibodies may cause reproductive problems and spread the viral infection within cattle populations. To investigate this in detail, three heifers were inseminated with BVDV‐infected semen from a non‐viraemic, seropositive Holstein–Friesian bull, named `Cumulus'. One control heifer was inseminated with semen from a healthy bull that was free of BVDV. All four heifers remained clinically healthy throughout the experiment. The conception succeeded in the control animal and in two of the three heifers inseminated with semen containing BVDV. The heifer with the failed conception was the only one that became systemically infected with BVDV. This animal was deemed non‐pregnant by ultrasonic examination on day 34 after insemination and showed no signs of subsequent oestrus during the entire experimental period. At slaughter, 42 days after insemination, there were no histopathological changes in the ovaries and virus was not detected in ovarian tissue. The fact that seronegative dams served with semen from persistently infected bulls have occasionally produced persistently infected calves together with the present findings and the fact that non‐viraemic, seropositive bulls can constantly shed BVDV, suggest that the use of semen from such bulls in BVDV‐free herds could have far‐reaching consequences, especially if it led to the birth of persistently infected (P1) calves.     

牛病毒性腹泻病毒一步法RT-PCR检测方法的建立

根据牛病毒性腹泻/粘膜病病毒5'端非结构蛋白基因序列,设计合成1对特异性引物,建立检测牛病毒性腹泻/粘膜病病毒244 bp片段的RT-PCR一步法。该方法对牛病毒性腹泻/粘膜病病毒NADL、OregonC24V和长春184毒株各标准毒株检测,结果均为阳性。对标准毒株的细胞毒进行检测,其敏感度达0.1 TCID50;而对牛传染性鼻气管炎病毒、猪瘟病毒、牛轮状病毒和牛冠状病毒的细胞培养物进行检测,结果均为阴性。检测460份不同样品,与病毒分离试验比较,符合率100%,证明该方法特异性强,敏感性高。初步结果表明所建立的一步法RT-PCR技术可用于牛病毒性腹泻/粘膜病的检测及流行病学调查。     

Enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of antibodies to bovine viral diarrhea virus in bovine sera

A specific and sensitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) was established for the detection of antibodies to bovine viral diarrhea virus (BVDV) in bovine sera. Polyethylene-glycol concentrated, equilibrium density gradient purified BVDV was used as test antigen at an optimal amount of 1 microgram/well, whereas the optimal concentration of conjugate was at 1/2000 dilution. The standardized test encountered no non-specific reaction with test sera at a starting dilution of 1/10. A total of 50 bovine serum samples was assayed for the presence of antibodies against BVDV by ELISA and serum neutralization test (SNT). A positive correlation between the 2 tests was found. However, ELISA could be as much as 500-fold more sensitive than SNT in detecting low levels of BVDV antibodies.