进境蓝舌病抗体阳性动物带毒分析及检疫处理研究

为评估进口蓝舌病病毒(BTV)抗体阳性动物的感染状态,分析其带毒风险,对从国外进口的9批19714头动物,无菌采集全血分离血清,采用竞争ELISA方法检测BTV抗体。对BTV抗体检测阳性的动物,采集抗凝血,采用OIE推荐的套式RT-PCR和荧光RT-PCR方法进行检测,同时将样品送往蓝舌病参考实验室进行病毒分离鉴定,以确定动物的蓝舌病感染状态。结果 9批动物中检出28头BTV抗体阳性动物,但核酸检测和病毒分离鉴定的结果均表明这些BTV抗体阳性动物并不携带有非感染性和感染性病毒粒子。结合9个批次的进口动物并无明显临床表现,且进口动物来源地也无蓝舌病(BT)的疫情发生,据此根据OIE《陆生动物卫生法典》条款,判定这些抗体阳性动物为带毒阴性。本研究通过对BTV抗体阳性动物的带毒分析,并结合OIE确定BTV感染的要求,对BTV口岸隔离检疫流程提出建议,以指导动物检疫工作,阻止病原经口岸传入。     

云南省师宗县蓝舌病病毒的分离及鉴定

为了解近年来云南省师宗县蓝舌病病毒流行情况,2012年在师宗县五龙乡建立了10头蓝舌病血清学阴性黄牛的监控动物群。从2012年5~10月,每周采血1次,11~12月,每月采血1次,采用C-ELISA进行血清学监测。8月开始动物血清学检测结果转阳性,至11月,监控动物全部转为阳性。用转阳前1周、转阳本周、转阳后2~13周的经处理的红细胞静脉接种鸡胚,收获鸡胚肝脏,用PBS悬浮捣碎的鸡胚肝脏,上清接种于C6/36细胞一代、BHK-21三代后,出现细胞病变(cytopathic effect,CPE)。采用RT-PCR方法,针对蓝舌病较为保守的血清型群特异片段VP7设计了2对引物,扩增其相应片段。结果显示,共分离到86份疑似分离物,其中67份疑似分离物细胞培养液上清经RT-PCR扩增,均扩增出1156 bp片段,初步确认为蓝舌病病毒。采用国际24个蓝舌病标准毒及24个标准阳性血清对86份疑似分离物及其对应血清进行细胞微量中和试验,67份毒株为蓝舌病病毒,与RT-PCR结果一致。通过对2份经中和试验定型为BTV-1、BTV-16分离株的VP2基因测序分析发现,BTV-1株序列与同型Y863(登录号:KC879616)参考毒株的同源性为92%,BTV-16株序列与登录号为AB686221的毒株同源性为99%。结果表明共分离到67株蓝舌病毒株,分离株主要为BTV-1、BTV-9、BTV-16三个血清型。     

2013—2016年云南省江城县牛羊蓝舌病血清流行病学调查

为了解近年来云南省江城县蓝舌病病毒（BTV）的感染和流行情况,从2013年5月至2016年4月连续3年在江城县设立监控动物群,每年选择BTV病原及抗体检测阴性牛10头、羊5只作为哨兵动物,用于BTV抗体监测和病毒分离。应用BTV C-ELISA抗体检测试剂盒,对哨兵动物进行血清抗体检测,应用鸡胚、C6/36细胞和BHK-21细胞进行病毒分离。结果显示：连续3年的哨兵动物BTV抗体阳性率分别为40.35%、44.08%、50.65%; 3年内共分离到45株BTV,包括1~5型、15~16型、21型和24型共9种血清型。结果表明,江城县蓝舌病流行有逐年加重趋势,且呈现多种血清型毒株交叉感染状况,亟需加大BTV监测力度,及时发现毒株变化。     

蓝舌病病毒群特异性RT-LAMP检测方法的建立与初步应用

本研究旨在建立针对中国流行蓝舌病病毒（bluetongue virus,BTV）的逆转录-环介导等温扩增（RT-LAMP）检测方法。根据我国分离BTV毒株Seg-5基因序列的高度保守区域,设计特异性引物,优化反应条件及反应体系,进行特异性及灵敏度验证,建立BTV RT-LAMP检测方法;对46株中国分离的12种血清型BTV（BTV-1、-2、-3、-4、-5、-7、-9、-12、-15、-16、-21与-24）代表毒株进行检测,进一步对120份BTV核酸阳性血液样品及60份2020年采集自监控动物的临床血液样品进行BTV的RT-LAMP及qRT-PCR检测,验证建立的RT-LAMP检测方法的准确性和可靠性。试验结果表明,本研究建立的RT-LAMP方法最佳反应条件为64℃,扩增45 min;反应体系中外引物：内引物：环引物的最佳浓度及比例为0.2 μmol·L^-1：0.6 μmol·L^-1：0.4 μmol·L^-1。该方法可特异性检测中国流行的12种血清型BTV核酸,与动物流行性出血病病毒（EHDV）、中山病毒（CHUV）、阿卡斑病毒（AKAV）、口蹄疫病毒（FMDV）及非洲马瘟病毒（AHSV）核酸均无交叉扩增现象;最低可检测4.5拷贝·μL^-1的BTV核酸。对46株分属12种血清型的BTV代表毒株的检测结果均为阳性;120份BTV核酸阳性血液样品的检测结果与qRT-PCR检测结果无显著差别（McNemar检验P>0.05）,符合率为95.0%;60份临床血液样品的检测结果与qRT-PCR结果完全一致,以上结果表明本研究建立的RT-LAMP方法准确可靠,对中国分离的BTV毒株及临床血液样品均具有良好的检测效果。本研究建立的BTV RT-LAMP检测方法具有反应快速、结果可视化、特异性强和敏感度高等优点,为我国开展BTV检测诊断与流行病学研究提供了技术支持,具有较好的应用前景。     

2种蓝舌病ELISA抗体检测试剂盒的比较和分析

为了验证云南出入境检验检疫局检验检疫技术中心自主研发的蓝舌病病毒C-ELISA抗体检测试剂盒(YN BTV C-ELISA)的可应用性,将YN BTV C-ELISA抗体检测试剂盒与美国IDEXX公司研制的蓝舌病病毒VP7蛋白抗体ELISA检测试剂盒对田间牛羊的1 028份血清样本进行对比检测试验,并使用YN BTV C-ELISA抗体检测试剂盒对15份检出的已知背景血清进行批内和批间可重复性试验。YN BTV C-ELISA抗体检测试剂盒相对IDEXX公司蓝舌病病毒ELISA抗体试剂盒的符合率、敏感性、特异性分别是98.44%、98.03%、98.85%,两者一致性用Kappa值表示,Kappa=0.97。批内试验强阳性、弱阳性变异系数在0.23~1.81之间,阴性血清变异系数在3.94~6.64之间,批间试验强阳性、弱阳性变异系数在0.26~2.35之间,阴性血清变异系数在3.55~8.51之间。结果表明:YN BTV C-ELISA抗体检测试剂盒的符合率、敏感性、特异性均较高,具有高度的可靠性、一致性和真实性。YN BTV C-ELISA抗体检测试剂盒的批内和批间有高度的重复性,在蓝舌病的诊断中具有良好的实用价值。     

两种蓝舌病病毒ELISA抗体检测试剂盒的比较

为验证昆明海关检验检疫技术中心等单位联合研发的蓝舌病病毒B-ELISA抗体检测试剂盒(YN BTVB-ELISA)的临床适用性,将YN BTV B-ELISA检测试剂盒与法国ID.VET公司研制的蓝舌病病毒ELISA抗体检测试剂盒(ID.VET C-ELISA)进行比对检测试验。本试验对1 278份牛羊血清进行比对检测,另外对1份已知背景的阳性血清倍比稀释后进行检测,比较两种试剂盒的敏感性。结果显示:YN BTV B-ELISA检测试剂盒与ID.VET C-ELISA试剂盒的符合率、相对敏感性、相对特异性分别是99.92%、99.63%、100%;将两者一致性用Kappa值表示,Kappa=0. 998;YN BTV B-ELISA、ID.VET C-ELISA检测阳性血清效价的最低稀释倍数分别是1:128、1:16。试验表明,YN BTV B-ELISA检测试剂盒与ID.VET C-ELISA检测试剂盒的符合率、相对敏感性、相对特异性均较高,并且YN BTV B-ELISA检测试剂盒敏感性更高,在蓝舌病病毒抗体检测中具有良好的实用价值。     

BTV核酸检测能力验证样品制备及其应用评价

为了解国内蓝舌病病毒(bluetongue virus,BTV)核酸检测的整体水平,督促实验室保持和提高BTV核酸检测的能力,设计和实施了"CNCA-15-A02《蓝舌病病毒核酸检测》能力验证计划"。本次能力验证制备了BTV阴性,强阳性和弱阳性样品。无菌采集健康山羊抗凝血加少量TRIzol后制备阴性样品;将BTV1型细胞培养物通过TRIzol处理灭活病毒后,用阴性样品做适当稀释制备了BTV强阳性和弱阳性样品;均匀性和稳定性检验证实样品均达到中国合格评定国家认可委员会对能力验证样品的要求。将能力验证样品编号后通过快递的方式下发给参试实验室,共有21个省、市的31实验室参加了本次能力验证活动,其中1家实验室选用了套式RT-PCR进行检测,其余30家均选用荧光RT-PCR方法,报送结果经比对验证均为满意,满意率达100%。本次能力验证对提升我国BTV的检测水平和评估各级实验室检测能力具有重要意义,为我国蓝舌病的诊断和防控工作提供技术保障。     

云南蓝舌病毒株人工感染绵羊血液中核酸变化规律研究

为研究云南蓝舌病毒株对绵羊持续性感染特性,分别用云南地方毒株BTV-1、BTV-15和BTV-16三个原始血毒接种绵羊,在BTV感染绵羊后,定期采集血液,测定BTV核酸变化规律。结果表明:动物血液中病毒核酸存在期为90 d左右,在检测期其核酸含量呈周期性变化。研究证明云南BTV毒株存在持续感染的状况,而且血液中病毒核酸呈周期性变化。     

人工感染BTV的绵羊血液中进行病毒分离的研究

为了指导蓝舌病(BT)研究中病毒分离工作,确定最佳病毒分离时间,比较鸡胚分离方法和BHK21分离方法的优缺点。本研究通过绵羊人工感染云南优势蓝舌病毒株BTV-1和BTV-16,采集不同时间的血液样品,用鸡胚和BHK21进行病毒分离。结果表明:用鸡胚的分离时间为接种后4~14 d,而BHK21细胞分离时间为2~8 d。本研究结果有助于BTV分离。     

蓝舌病病毒荧光定量RT-PCR检测技术

蓝舌病是一种侵害反刍动物的虫媒传染病,被世界动物卫生组织(Office International des Epizooties,OIE)列为上报疾病,我国将其列为一类动物疫病.本研究利用计算机软件分析获取蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)核酸检测的保守靶序列,设计引物和TaqMan荧光探针,建立了BTV荧光定量RT-PCR技术,进行了特异性、敏感性、重复性等实验评价,并对动物样品进行检验.结果显示,该技术可有效检出不同血清型BTV,与流行性出血病病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)无交叉反应;对RNA标准品的检测灵敏度为102 copies;重复检测CV<5%,可对动物样品进行有效检测.因此,所建立的BTV TaqMan/荧光定量RT-PCR技术可为蓝舌病诊断提供一种快速、可靠的病原检测手段.     

攀西地区牛羊蓝舌病血清学调查

为了解攀西地区牛羊蓝舌病病毒(BTV)的感染情况,同时为该地防控BTV提供理论依据。采集攀西地区牛羊血清共计1 211份,应用竞争ELISA方法对牛羊血清样品进行检测。结果显示,攀西地区621份羊血清中,检出46份羊血清抗体阳性,总阳性率为7.41%;在590份牛血清中未检出抗体呈阳性血清。结果表明,该地区羊存在BTV感染,且分布广泛。     

2022年云南省边境地区牛蓝舌病病毒及阿卡斑病毒抗体检测

为了解云南省边境地区牛蓝舌病病毒（bluetongue virus,BTV）与阿卡斑病毒（Akabane virus,AKAV）的流行与分布现状，2022年在云南省9个边境县（市）采集1 820份牛血清样本，应用c ELISA方法进行BTV与AKAV抗体检测，并对检测结果利用IBM SPSS Statistics 22、Excel 2007等软件进行区间、群间和时间的分类统计分析。结果显示：共检出BTV阳性样品1 207份，样品阳性率为66.32%(1 207/1 820)；检出AKAV阳性样品350份，样品阳性率为32.17%(350/1 088)。各县（市、区）的BTV样品阳性率为43.50%～93.00%,AKAV为12.90%～50.00%，不同地区间的差异有统计学意义（P <0.01）；黄牛和西门塔尔牛的BTV和AKAV抗体样品阳性率均高于水牛，入境牛BTV抗体阳性率显著高于本土牛，两组数据差异均有统计学意义（P <0.01）；规模养殖场的BTV和AKAV抗体阳性率和散养户差异无统计学意义（P> 0.05）;7—8月的BTV和AKAV抗体阳性率显著高于5—6...     

蓝舌病病毒血清9型毒株在我国的首次分离

旨在分离流行于我国云南省的蓝舌病病毒(BTV),掌握分离BTV的遗传特征与感染特性。采用"鸡胚—C6/36细胞—BHK-21细胞"接种的方式,采集哨兵牛的BTV阳性血液进行病毒分离;采用血清中和试验以及Segment 2与Segment 6ORF区的克隆测序确定分离病毒的血清型;通过病毒噬斑形成和增殖曲线的测定,分析病毒在BHK-21细胞的增殖特性;通过qRT-PCR与血清中和试验分析BTV感染动物血液中病毒含量与中和抗体动态变化情况。结果显示:2013年8月,在云南芒市设定的哨兵牛中分离出一株BTV(毒株号V013/YN/2013),血清中和试验显示V013/YN/2013为BTV-9型病毒,Segment 2与Segment 6序列分析表明分离的病毒属BTV-9Eastern型,与日本毒株和澳大利亚BTV-9型毒株具有最近的亲缘关系。病毒噬斑与增殖曲线测定结果显示V013/YN/2013在BHK-21细胞上增殖能力明显强于BTV-9型参考毒株。自然感染V013/YN/2013的牛在连续5个月的监控期内未出现临床症状,感染动物虽产生了特异性中和抗体,但血液中始终能持续检测到病毒核酸。本研究首次报道了BTV-9Eastern型毒株V013/YN/2013在我国的分离,为进一步开展中国BTV-9型病毒的全基因组测序、诊断方法的建立、流行病学调查与致病性研究奠定了基础。     

光生物素RNA探针:RNA/RNA杂交试验检测蓝舌病病毒

用国产光敏生物索标记20型蓝舌病病毒(BTV)全基因RNA,检测BTV、鹿流行性出血热病毒(EHDV)和实验感染绵羊的血样品。3、10、20、21型BTV RNA杂交阳性,与EHDV无交叉反应。0号感染羊的血样为阳性。试验表明,用乙二醛变性RNA样品,可检出10pg水平的BTV RNA样品,灵敏度高出热变性方法的10—100倍。 蓝舌病是由呼肠孤病毒科环状病毒属内的蓝舌病病毒引起的重要疾病。主要通过昆虫传播,感染反刍动物。本病上世纪发现于非洲,现在叫中东、北美、澳大利亚等国家和地区都有蓝舌病的报道。蓝舌病现有24个血清型,其痫毒的核酸由10个片段的双链RNA(dsRNA)组成。这些基因片段决定BTV衣壳蛋白的氨基酸序列上的差异。通常用补反、琼脂扩散或ELISA等血清学方法检查BTV抗体的存在。但这些方法除了敏感性低以外,一个重要缺陷是和EHDV等相关病毒存在交叉反应。K.R.E.Squire等人采用放射性同位素~(32)P,3'末端或5'末端标记全基因组BTV RNA作探针,检测BTV。P·P.C.Mertens和吴时友等,将基因组RNA用一定浓度的NaOH随机水解成150bp左右的片段,再进行末端标记,末端的增加使标记效率显著提高。由于同位素的使用受到经济和安全等方面的限制,为此我们采用非放射性的光生物素标记BTV RNA,打点杂交检测BTV,试验证明该方法是可行的。     

山西省牛羊蓝舌病血清流行病学调查与分析

为了解蓝舌病病毒(BTV)在山西省的感染及分布情况,采用竞争ELISA方法,对分别在2013年和2015年的5—6月份采自山西省11个市的1 090份牛羊血清样品进行了BTV抗体检测,分析BTV阳性分布与地理、气候因素的关系。结果共检测出BTV抗体阳性样品127份,总阳性率为11.65%。其中,羊阳性血清96份,阳性率为19.28%(96/498);牛阳性血清31份,阳性率为5.24%(31/592)。结果表明,山西省部分地区牛羊群中存在BTV感染,且阳性率与纬度、降雨量有关。     

2018年我国蓝舌病血清学调查及影响因素分析

为进一步了解2018年我国蓝舌病的流行分布情况,对来自重庆、新疆、吉林、湖北、内蒙古、贵州、河北、广西和云南等9个省(市、自治区)93个县(市、区、旗)的5 721份血清样本进行蓝舌病C-ELISA抗体检测,共检测出1 769份蓝舌病抗体阳性血清,抗体阳性率为30.92%(其中:牛血清样品1 827份,共检测出806份蓝舌病抗体阳性血清,抗体阳性率为44.12%;羊血清样品3 894份,共检测出963份蓝舌病抗体阳性血清,抗体阳性率为24.73%)。对检出的1 769份蓝舌病抗体阳性的血清样品进行BTV-8型微量细胞中和试验,结果均为阴性,未检测到BTV-8型抗体。本研究对我国多地的牛羊进行了BTV的血清学调查,覆盖我国不同气候类型地区,样本量较大,较好的反映了2018年度蓝舌病在中国的分布情况,为该病的防控提供了流行病学依据。     

用~(32)P标记RNA5′末端探针检测蓝舌病病毒研究初报

目前世界上报导蓝舌病病毒(BTV)已有24个血清型,各型病毒的毒力不一致。由于蓝舌病病毒的基因序列漂移和基因重配列现象的存在,新的BTV血清型还有不断增加的趋势,这就给蓝舌病的研究和诊断带来了困难。近年来,不少国外学者应用核酸杂交技术来研究蓝舌病各型之间的相关性和进行病毒的检测。不少国家和地区用琼扩及其它血清     

几种外来动物病毒多重普通和实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及其初步应用

为了能够同时开展对小反刍兽疫病毒(PPRV)、蓝舌病血清8型病毒(BTV8)、鹿流行性出血热血清1型病毒(EHDV1)和非洲马瘟病毒(AHSV)4种外来动物疫病病原体的核酸检测,本试验根据GenBank中相关病毒序列设计引物和探针,建立多重普通逆转录PCR(RT-PCR)和实时荧光定量RT-PCR检测方法,并在采集的临床样本检测中进行初步应用验证。结果显示：建立的PPRV/BTV8/EHDV1三重实时荧光定量RT-PCR检测方法仅对PPRV、BTV8和EHDV1有特异荧光信号,检测敏感度可达10^1.70～10^2.08copies/μL DNA;建立的PPRV/BTV8/EHDV1/AHSV四重普通RT-PCR方法可特异性同步检测PPRV、BTV8、EHDV1和AHSV,检测敏感度可达10~3 copies/μL DNA;2种方法对羊痘、羊口疮、口蹄疫、阿卡斑、牛病毒性腹泻等临床相似的病毒均无扩增。在925份临床样本中检测出1例PPRV核酸阳性样本;经核苷酸序列测定及BLAST比对确定为谱系IV型PPRV毒株序列。本试验所建立的三重实时荧光定量...     

蓝舌病病毒7型毒株的分离与分子鉴定

为监测广东省蓝舌病流行状况,2014年从广东省某一奶牛场采集血液样品,检测虫媒病病原,对经RTPCR检测蓝舌病病毒核酸阳性的样品进行病毒分离并鉴定。经鸡胚静脉接种后取肝,研磨后离心取上清转接C6/36细胞和BHK-21细胞,出现CPE,RT-PCR检测蓝舌病病毒的VP7基因并进行序列比对,电镜观察病毒粒子,证实分离到蓝舌病病毒,命名为GD/ST2014。进一步扩增VP2基因,进行系统发育树分析,以及血清中和试验,表明此分离株为血清型7型。这是国内首次报道牛源蓝舌病病毒血清型7型的分离鉴定。     

用抗蓝舌病非结构蛋白NS_1的单克隆抗体的竞争ELISA检测抗NS_1抗体

制备针对蓝舌病病毒最大的非结构蛋白NS；抗体。此抗体在绵羊感染蓝舌病病毒10天后即可检出，而接种蓝舌病灭活疫苗的绵羊体内检测不到此抗体，说明NS；的产生与病毒在动物体内繁殖有关。研究同时证明抗蓝舌病NS；的单克隆抗体不与其他环状病毒（如鹿流行性出血病病毒）的NS；抗体竞争，表明本方法具有群特异性。本方法除可检测灭活疫苗是否完全灭活外，还可检测免疫动物感染强毒后病毒的体内繁殖情况，评价疫苗的保护性能。如果广泛应用灭活BTV疫苗，本方法还可用于区S临疫动物和自然跷染动物。用抗蓝舌病非结构蛋白NS_1的单克隆抗体…