云南省牛流行性出血病血清学调查

为了解牛流行性出血病(epidemic hemorrhagic disease,EHD)在云南省的流行和分布情况,采用竞争ELISA方法,2019年对11个县市的1 199份牛血清进行流行性出血病病毒(epidemic hemorrhagic disease virus,EHDV)抗体检测,同时从各县市检测出的阳性血清中,随机选取18～50份通过微量血清中和试验进行血清型鉴定。结果显示:云南省11个县市均检测出EHDV抗体阳性样品,阳性率介于49.3%～91.3%,平均为81.8%;各地普遍存在3个及以上血清型,其中EHDV-7、-10、-6、-5血清型检出率较高,EHDV-8、-2血清型检出率较低,未检出EHDV-1型。结果表明,EHD在云南省流行广泛且较严重,流行血清型复杂。结果提示,需持续开展EHDV血清学监测,重视对该病的防控。此次血清学调查为我国西南地区EHD防控提供了数据参考。     

云南省边境地区牛阿卡斑病毒血清学调查

为掌握云南省边境地区牛群中的阿卡斑病毒（Akabane virus,AKAV）流行情况和分布特征,采用竞争ELISA检测方法,对2019—2020年采自云南省边境地区10个县市的牛群血清样品进行AKAV抗体检测与分析。结果显示：在采集的4 437份牛血清样品中,检出抗体阳性样品1 367份,平均抗体阳性率为30.81%;2019年抗体阳性率为27.88%,2020年为32.14%,差异不显著（P＞0.05）;入境牛抗体阳性率显著高于本地牛（P＜0.05）;养殖场抗体阳性率略高于散养户和交易市场,但三者间差异不显著（P＞0.05）;舍饲牛群的抗体阳性率显著高于半放牧半舍饲和系牧饲养（P＜0.05）,黄牛的抗体阳性率明显高于水牛（P＜0.05）。结果表明,云南省边境地区存在一定程度的AKAV感染且有加重趋势,入境牛感染风险较高,需持续开展血清学调查和监测,加强境外牛的检疫和移动控制,降低AKAV向内地扩散的风险。本研究摸清了云南省边境地区牛群中的AKAV流行本底,为今后该病毒流行控制策略的研究与制定提供了参考。     

感染16型蓝舌病病毒后绵羊部分细胞因子消长特点研究

本试验旨在探明绵羊感染16型蓝舌病病毒（Bluetongue virus type 16,BTV16）后细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10的消长特点。用实时荧光定量PCR检测方法对感染BTV16后3只绵羊上述4种因子mRNA进行检测,同时设立阴性对照绵羊,并以0 d mRNA为基准,计算mRNA的相对表达量,同时检测病毒抗体效价、测量绵羊体温。结果显示,接种BTV16的3只绵羊均不同程度产生抗体和体温症状,4种细胞因子的mRNA在接种病毒2~4 d内均出现显著上升,其中IFN-γ峰值在2.58~27.84倍之间,IL-2峰值在5.24~17.19倍之间,IL-4峰值在2.16~3.43倍之间,IL-10峰值在15.78~48.77倍之间,个体上升幅度存在显著差异,4种细胞因子均在高水平持续6 d左右后逐渐下降。对照绵羊上述参数在正常范围内波动。本研究阐明了接种BTV16后绵羊细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10在转录水平上的消长特点,为进一步深入开展BTV感染特征、宿主机体免疫机制研究提供参考。     

云南省边境地区送检牛血清样品蓝舌病病毒抗体检测与血清型鉴定

为了解云南边境地区的蓝舌病流行和分布情况,采用竞争ELISA方法,2019年对云南省边境地区5个州市12个县（市）的1 580份牛血清样品进行蓝舌病病毒抗体检测,同时从检出的阳性血清中,每县（市）随机选取15~55份,采用微量血清中和试验进行血清型鉴定。结果显示：12个边境县（市）均检出阳性血清样品,但有一定的地区差异,其中芒市最高（94.1%）,沧源县最低（17.0%）;本地牛和境外牛血清样品阳性率差异不大（P＞0.05）,均在70.0%以上;各县（市）均存在5个以上血清型的交叉感染。结果表明,蓝舌病在云南边境地区广泛存在,且呈多种血清型混合流行态势,需要持续开展血清学调查。本研究为我国西南边境地区蓝舌病防控提供了数据参考。     

非洲猪瘟疫苗和病原学诊断技术研究进展

非洲猪瘟疫情给我国养猪业造成了巨大经济损失，因而开发安全高效的疫苗和建立快速可靠的病原学诊断方法对该病防控具有重要意义。本文综述了当前国内外非洲猪瘟（African swine fever，ASF）疫苗和病原学诊断技术的研究进展，以期为今后ASF疫苗研制和诊断技术选择提供参考。疫苗研究方面，目前仍无安全有效疫苗上市。灭活疫苗不能提供有效的免疫保护力，已不作为今后研究的重点方向；减毒活疫苗存在生物安全隐患，疫苗接种后的安全性、有效性等有待进一步评估；基因工程疫苗与前两种疫苗相比，成本低且安全性高，但对强毒株攻击的有效保护作用不强。目前认为利用天然分离或敲除非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）毒力基因的致弱毒株开发重组减毒活疫苗具有较好的利用前景，但其安全性和有效性仍有待进一步研究。目前在没有有效疫苗免疫的前提下，建立快速、可靠的早期病原诊断方法对于ASF疫情确认和控制同样至关重要。近年来，ddPCR、LAMP、RPA、CRISPR/Cas等新兴诊断技术相继涌现。这些方法具有操作更简单、检测速度更快、特异性更强等方面的优势，但其检测能力与适用场景尚存在一定不足，还需要进一步完善。未来ASFV病原学检测的研究方向应建立在成本低廉、简单便捷、高效准确、集成化的基础上，或可将多种诊断方法联合应用，各取所长。     

云南省蓝舌病病毒血清7型毒株的分离与基因组序列分析

2014年,我国广东省的哨兵牛上分离出蓝舌病病毒血清7型（BTV-7）毒株,但该血清型病毒在我国的流行情况尚不清楚,本研究旨在分离我国流行的BTV-7型毒株并掌握其遗传特征。作者在云南省景洪市勐罕镇设立哨兵牛,每周定时采血,并接种C6/36、BHK-21细胞分离虫媒病毒,通过病毒蚀斑试验与增殖曲线分析病毒在细胞上的感染特性,采用高通量测序获取分离毒株的全基因组序列,通过qRT-PCR与血清中和试验对哨兵牛血液中的病毒核酸与中和抗体变化进行回溯分析。结果表明：2020年5月,分离到1株能引起BHK-21细胞发生细胞病变的病毒（毒株号V303/YNJH/2020）,经鉴定为BTV-7型。分离毒株的基因组全长19 154 bp （GenBank收录号MW046280至MW046289）,与广东省2014年分离的BTV-7型GDST008毒株具有最近的亲缘关系,基因节段1至6,基因节段9与10的核酸与编码蛋白氨基酸序列（nt/aa）相似度分别大于98%、99%;V303/YNJH/2020毒株的基因的节段7和基因节段8属Western地域型,与广东GDST008毒株对应基因节段的nt/aa序列相似度仅为71.5%/81.6%、79.6/%84.4%。病毒蚀斑与增殖曲线比较显示,V303/YNJH/2020在BHK-21细胞的增殖能力明显强于GDST008。回溯分析显示,感染V303/YNJH/2020的哨兵牛未出现临床症状,血液中的病毒核酸持续存在长达12周;在病毒感染后第4~9周,血液中的中和抗体滴度水平维持在1∶256。云南省2020年分离的BTV-7型V303/YNJH/2020毒株与广东省分离的BTV-7型GDST008毒株具有最近的亲缘关系,在BHK-21细胞上的增殖能力强于GDST008毒株;V303/YNJH/2020虽未引起感染动物的临床症状,但病毒核酸与中和抗体在感染动物血液中长时间存在。研究结果为开展BTV-7型在我国的演化规律、病毒变异以及致病性等方面的研究奠定了基础。     

环介导等温扩增技术的最新研究进展

环介导等温核酸扩增技术是一种新型的核酸扩增技术,其核心原理是对靶基因片段的6个区域设计3对引物,实现对靶基因片段地快速、高效扩增。该技术目前已广泛的运用于一些领域。通过简述该技术的原理方法,在一些领域的运用,总结该技术国内外目前的研究进展以及改进措施,分析该技术未来的发展趋势,对环介导等温核酸扩增技术有一个全面的了解,以期为今后该技术的发展运用提供一定的参考依据。     

2017—2018年云南省边境地区阿卡斑病毒抗体检测

为了解云南边境地区近年来阿卡斑病毒(Akabanne disease virus,AKAV)流行情况,2017—2018年连续2年在云南省与缅甸、老挝、越南接壤的12个边境县采集牛血清,应用cE LISA方法进行AKAV抗体检测。结果显示:2017—2018年共检测牛血清样品1 860份,检出阳性样品108份,阳性率为5.8%,显示这些地区存在一定的AKAV感染;各县AKAV抗体阳性率在0～24.4%之间,差异较大,其中抗体阳性率最高的为富宁县,2017年和2018年的阳性率分别为24.4%和20.0%,而瑞丽连续2年未检出抗体阳性;黄牛AKAV抗体阳性率(6.6%)高于水牛(4.7%),差异显著(P<0.05);入境牛抗体阳性率(6.5%)高于境内牛(3.0%),差异显著(P<0.05);养殖场(9.0%)、交易市场(8.4%)、屠宰场(7.6%)的牛AKAV抗体阳性率高于村寨散养户(2.5%),差异极显著(P<0.01)。结果表明,AKAV在云南边境地区存在一定的流行,其流行趋势受入境动物影响。结果提示,应继续加强云南省边境地区AKAV等虫媒病毒病的监控,及早发现和控制该病流行。     

蓝舌病病毒、流行性出血病病毒和帕利亚姆血清群病毒三重RT-qPCR检测方法的建立及应用

目的 建立蓝舌病病毒(Bluetongue virus,BTV)、流行性出血病病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)及帕利亚姆血清群病毒(Palyam serogroup virus,PALV)快速筛查和诊断的三重RT-qPCR检测技术。方法 选择BTV的NS3、EHDV的NS1以及PALV的VP7基因作为靶基因,设计3组特异性引物和探针,建立3种病毒的三重RT-qPCR检测方法。对检测方法的灵敏度、特异性和重复性进行验证,同时使用我国分离的BTV、EHDV与PALV不同血清型毒株和对应的阳性血液样本,与24个BTV血清型及6个EHDV血清型参考毒株对该三重法的检测效果进行验证。结果 三重RT-qPCR的扩增效率均可达90%以上,对3种病毒核酸拷贝数的检测下限均为10 μL^-1级别,与单重法的检测灵敏度相当;与阿卡斑病毒、小反刍兽疫病毒、口蹄疫病毒和牛流行热病毒之间无交叉反应;Ct值批内、批间变异系数均在2%以内;可检测出24种BTV血清型、6种EHDV血清型与3种PALV血清型,具有群特异性;可有效检测血液中的病毒核酸,检测结果与单重法一致。结论 本研究建立的BTV、EHDV与PALV三重RT-qPCR具有良好的敏感性、特异性和重复性,可用于临床样本中对3种病毒的同时诊断与筛查。     

1株分离自云南省师宗县库蠓的新型西藏环状病毒

西藏环状病毒（Tibet orbivirus,TIBOV）为环状病毒属的新成员,病毒于2009年首次从我国西藏墨脱县采集的圆斑按蚊中分离,目前,对该病毒的认识仍十分有限。本研究对1株分离自我国云南省师宗县库蠓的新型TIBOV毒株YNSZ/V290/2019进行了鉴定,结果表明,病毒可在C6/36与BHK-21细胞上引起明显的细胞病变,电镜下观察,病毒粒子呈球形,直径55~75 nm,具有环状病毒属病毒典型形态特征。电泳结果显示,病毒基因组为十节段双链RNA,呈现"3-3-3-1"的电泳带型特征。对环状病毒属病毒高度保守的基因节段及其编码蛋白（Seg-3/T2）的序列分析显示,YNSZ/V290/2019为TIBOV的成员,与其他TIBOV毒株的核酸与氨基酸序列相似度分别为80.90%~81.70%与97.20%~97.30%。对决定环状病毒属病毒血清型的基因节段及其编码蛋白（Seg-2/OC1）的序列分析显示,YNSZ/V290/2019与已知TIBOV毒株的核酸与氨基酸序列相似度分别为26.90%~30.60%与28.50%~33.20%,表明该毒株可能是一种新血清型的TIBOV。对采集于师宗县牧场的40份黄牛与68份山羊血清进行血清中和试验,结果显示,新型TIBOV在牛、羊的阳性率分别为22.50%与4.41%。新型TIOBV在我国的发现,丰富了我国虫媒病毒的研究,为深入研究我国TIBOV的分布、致病性、感染宿主范围与诊断试剂的开发提供了基础。