2021年昆明市晋宁区流行性出血病调查报告

为了解流行性出血病(epizootic hemorrhagic disease, EHD)在昆明市晋宁区流行和分布情况，采用竞争性酶联免疫吸附测定方法，对2021年该地区1 413份肉牛、山羊(包括奶山羊和肉山羊)血清样品进行流行性出血病病毒(epizootic hemorrhagic disease virus, EHDV)抗体检测。结果显示：山羊血清EHDV抗体阳性率较低(肉山羊阳性率为0,奶山羊阳性率为0.73%),而肉牛血清EHDV抗体阳性率较高(48.99%),舍饲牛群血清EHDV抗体阳性率高于半牧半舍牛群和放牧牛群。结果表明：昆明市晋宁区肉牛群中EHD普遍流行。该调查结果对昆明市晋宁区EHD流行病学研究具有重要意义。     

流行性出血病病毒(EHDV)血清7型毒株在中国的首次分离与鉴定

流行性出血病(EHD)是由流行性出血病病毒(EHDV)感染反刍动物引起的一种虫媒病毒病,为了解中国云南EHDV的感染情况和病毒遗传特征,笔者课题组在云南省师宗县以EHDV血清学和核酸阴性的牛、羊为哨兵动物,拟对流行于云南省的EHDV进行分离与鉴定。将采集于哨兵动物的EHDV核酸阳性血液接种BHK-21细胞进行病毒分离;通过血清中和试验与病毒Seg-2、Seg-3 ORF区的序列分析,确定病毒的血清型与遗传特征;采用C-ELISA和qRT-PCR方法对EHDV感染动物血液中的抗体水平与病毒核酸进行监测。结果如下:从2013年8月采集自云南师宗县哨兵牛的血样中分离出一株EHDV(毒株号YNSZ/V269/2013),血清中和试验结果表明分离的病毒为血清型7型(EHDV-7);Seg-2、Seg-3序列分析表明分离的病毒属EHDV-7 Eastern型,与日本毒株和澳大利亚EHDV-7型毒株具有最近的亲缘关系。哨兵动物病毒核酸转阳后,血清抗体迅速上升,3周后达最高点并能在该水平持续较长时间,而病毒核酸含量却迅速下降,7周后已经检测不到。本研究首次报道了EHDV-7型毒株在中国的分离、毒株序列特征以及在动物上的感染特性。研究结果可为进一步开展中国EHDV-7型病毒的全基因组测序、流行病学调查、诊断方法的建立和致病性等相关研究提供基础。     

一株新型牛源流行性出血病病毒的分离与鉴定

为分析云南省动物流行性出血病病毒(EHDV)的流行情况,本研究将2018年采集的280份牛EDTA抗凝血液样品通过EHDV群特异性qRT-PCR和血清型特异性qRT-PCR方法进行病毒核酸检测,利用竞争性ELISA(C-ELISA)检测牛常规血液样品中的抗体水平,将EHDV核酸阳性牛血液样品先接种白纹伊蚊(C6/36)细胞再接种BHK-21细胞进行病毒分离;利用血清型特异性qRT-PCR和血清中和试验分别鉴定分离病毒的血清型;通过蚀斑特征和增殖曲线分析分离病毒的增殖特性;经全长cDNA扩增技术(FLAC)获得分离病毒的Seg-2和Seg-3基因序列,并分析其同源性及遗传进化关系;采用C-ELISA和qRT-PCR对感染牛体内的抗体和病毒核酸进行回溯检测。结果显示,280份牛EDTA抗凝血样品中共有35份样品呈EHDV核酸阳性,其中13份为EHDV-1型,11份为EHDV-5型,另外11份均未有已知血清型的特异性扩增曲线。共分离到3株病毒,经EHDV血清型特异性qRT-PCR鉴定其中两株分别为EHDV-1和EHDV-5型,但无法判定其中一株病毒(YNDH/V079/2018株)的血清型。蚀斑特征和增殖曲线结果显示,该株病毒的蚀斑明显小于EHDV-1、EHDV-5和EHDV-6型,而与EHDV-7和EHDV-10型接近,但其增殖特性则与上述血清型EHDV均相似。序列分析结果显示,YNDH/V079/2018株Seg-3/VP3与GenBank中EHDV参考株相应基因节段的核苷酸/氨基酸序列的同源性分别为78.5%～80.0%/94.6%～96.5%,表明其为一株EHDV;但其Seg-2/VP2与GenBank中各血清型EHDV参考株相应基因节段的核苷酸/氨基酸序列同源性分别为44.3%～50.9%/31.0%～40.6%,表明该株病毒不属于已知血清型的EHDV。系统进化树结果显示,YNDH/V079/2018株Seg-3基因形成一个单独的进化分支,不属于已报道的东方和西方两种地域型;且其Seg-2基因也不属于已知血清型EHDV形成的A～D 4个基因群,而是单独形成了E基因群。感染牛的回溯检测结果显示,牛感染YNDH/V079/2018株后,虽然未出现临床症状,但被感染牛的病毒血症能够持续11周,血液内的抗体则可持续13周且一直保持在较高水平直到采血终止。本研究首次报道在我国云南省分离到一种新型EHDV,并分析了其遗传特征和感染特性,为进一步开展该血清型EHDV的流行病学调查和致病性等研究奠定基础。     

云南边境地区流行性出血热病毒血清学监测及血清型鉴定

为了解近几年云南边境地区牛、羊流行性出血热病毒(EHDV)的感染和流行情况,本研究从2014年起连续3年在与老挝、越南接壤的江城县设置EHDV监测点,每年选择投放EHDV抗体阴性的10头牛和5只山羊作为哨兵动物进行跟踪监测。每年5～10月份对哨兵动物采血,每周1次,11、12月每月采集一次,进行EHDV抗体、抗原监测和病毒分离。针对致细胞病变的样品,采用EHDV群特异性S7基因片段引物进行RT-PCR方法检测,同时利用EHDV-1、-5、-6、-7、-10标准阳性血清对分离到的病毒进行中和试验鉴定。结果显示,2014-2016年江城县牛EHDV抗体阳性率分别为41.9%、58.6%和75.4%;3年期间共监测到15头EHDV抗体阳性黄牛,并从中分离到20个可致细胞病变样品,经RT-PCR确认为EHDV,遗传进化分析发现有11个毒株与1997和2003年日本分离的EHDV毒株亲缘关系较近,9个毒株与1977和1981年澳大利亚分离的EHDV毒株亲缘关系较近,5个毒株与2015年广西分离株的亲缘关系较近;3年期间在山羊体内未检测出抗体,未发现抗原阳性动物;经中和试验血清型鉴定,确定20株毒株包括EHDV-5、-6、-7、-10型4种血清型,感染时间均在5～9月之间。本研究发现,江城县长期存在多种血清型EHDV同时流行,2014-2016年EHDV抗体阳性率逐年增加,亟需加强对EHDV感染情况及活动规律的持续研究,提高流行性出血热的防控效率。     

云南边境地区流行性出血热病毒血清学监测及血清型鉴定

为了解近几年云南边境地区牛、羊流行性出血热病毒（EHDV）的感染和流行情况,本研究从2014年起连续3年在与老挝、越南接壤的江城县设置EHDV监测点,每年选择投放EHDV抗体阴性的10头牛和5只山羊作为哨兵动物进行跟踪监测。每年5~10月份对哨兵动物采血,每周1次,11、12月每月采集一次,进行EHDV抗体、抗原监测和病毒分离。针对致细胞病变的样品,采用EHDV群特异性S7基因片段引物进行RT-PCR方法检测,同时利用EHDV-1、-5、-6、-7、-10标准阳性血清对分离到的病毒进行中和试验鉴定。结果显示,2014－2016年江城县牛EHDV抗体阳性率分别为41.9%、58.6%和75.4%;3年期间共监测到15头EHDV抗体阳性黄牛,并从中分离到20个可致细胞病变样品,经RT-PCR确认为EHDV,遗传进化分析发现有11个毒株与1997和2003年日本分离的EHDV毒株亲缘关系较近,9个毒株与1977和1981年澳大利亚分离的EHDV毒株亲缘关系较近,5个毒株与2015年广西分离株的亲缘关系较近;3年期间在山羊体内未检测出抗体,未发现抗原阳性动物;经中和试验血清型鉴定,确定20株毒株包括EHDV-5、-6、-7、-10型4种血清型,感染时间均在5~9月之间。本研究发现,江城县长期存在多种血清型EHDV同时流行,2014－2016年EHDV抗体阳性率逐年增加,亟需加强对EHDV感染情况及活动规律的持续研究,提高流行性出血热的防控效率。     

云南省2株鹿流行性出血热病毒的分离鉴定

为了监测云南省反刍动物鹿流行性出血热病毒(epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)的感染情况,本试验在云南省师宗县设立了监控点,筛选出EHDV抗体阴性的10头牛和5只羊作为哨兵动物,每年的5～10月份每周采血1次,11月到次年4月份每月采血1次,通过酶联免疫吸附试验监测其抗体转阳情况,用转阳牛的红细胞接种BHK以分离病毒,用病毒RT-PCR和中和试验鉴定病毒。结果显示,从2头转阳牛的抗凝血中分离到2株EHDV,其TCID₅₀分别为10^-2.5/0.1 mL和10^-3.44/0.1 mL,血清型均为EHDV-5型。本试验在云南省分离到EHDV,明确了云南省反刍动物存在EHDV感染,为我国监控EHDV流行情况及疫病风险防范提供了重要借鉴意义。     

流行性出血病病毒阻断ELISA抗体检测试剂盒的研制

为研制流行性出血病病毒（epidemic hemorrhagic disease virus，EHDV）ELISA 抗体检测试剂盒，用饱和硫酸铵浓缩EHDV灭活病毒作为包被抗原，以EHDV鼠源单克隆抗体作为阻断抗体，商品化的IgG-HRP羊抗鼠二抗作为检测抗体，通过优化检测试剂中各组分含量和反应程序，建立了一种EHDV阻断ELISA抗体检测方法。用研制的试剂盒与ID Screen参考试剂盒分别检测实验室保存的血清样本，结果发现该方法的特异性、敏感性与ID Screen参考试剂盒一致，二者符合率为97.00%。结果表明，研制的EHDV阻断ELISA抗体检测试剂盒可作为EHDV抗体检测的候选试剂盒，代替国外试剂盒使用，从而降低EHDV检测成本，这对该病防控具有重要意义。     

流行性出血病多克隆抗体C-ELISA检测方法的建立

为能简便、快速地进行流行性出血病病毒(epizootic haemorrhagic disease virus,EHDV)抗体监测,采用纯化的6型EHDV抗原包被ELISA板,以豚鼠抗EHDV-2型多克隆抗体作为竞争抗体,建立了检测EHDV群特异性抗体的竞争ELISA(C-ELISA)方法。结果显示:抗原最佳包被浓度为5.12μg·mL-1(1∶10 000),竞争抗体最佳稀释倍数为1∶10 000;通过对各270份阴性和阳性的牛、羊血清检测,确定该检测方法临界值为50%;特异性试验表明该ELISA方法仅能检测出不同血清型EHDV抗体,具有较好的群特异性;对已知抗体效价的阳性血清检测表明,建立的C-ELISA方法敏感性好于血清中和试验(SNT)和琼脂扩散试验(AGID);分别用C-ELISA、SNT、RTPCR和病毒分离试验对监控动物采集的血清和抗凝血样品进行检测,ELISA结果与其他3种方法检测结果对应一致。结果表明本研究建立的C-ELISA为EHDV抗体的检测提供了一种快速、敏感、稳定的方法。     

流行性出血热及其检测技术的研究进展

流行性出血热(epizootic hemorrhagic disease,EHD)是由节肢动物库蠓叮咬引起的一种在全世界野生及家饲有蹄动物中广泛分布的非接触性虫媒病毒病,目前至少有9种血清型,其中有7种在我国流行.流行性出血热病毒(Epizootic hemorrhagic disease virus,EHDV)主要感...     

我国牛羊流行性出血病血清抗体调查

为了解流行性出血病(EHD)在我国的流行和分布情况,本研究采用竞争ELISA试验方法,对2015年～2017年我国吉林、河北、西藏、重庆、云南等15个省区的6 413份牛羊血清样品进行检测。结果显示,未发现绵羊EHDV阳性血清,山羊EHDV血清阳性率较低(0～4%),而牛血清EHDV阳性率有明显的地域性和季节性,由北向南逐渐升高(0～65.83%),表明EHD在我国的流行已具有广泛性;秋季阳性率(61.11%～65%)明显高于春季(10%～16.67%)和夏季(29%～32%),表明该病的流行分布状况与其媒介昆虫的活动有密切关系。本研究是我国首次大规模的EHD血清学调查,对有效防控该病提供了重要的实验数据。