粘虫中肠胰蛋白酶基因启动子的克隆及其功能分析

【目的】通过克隆粘虫Mythimna separata(Walker)(Lepidoptera:Noctuidae)中肠胰蛋白酶基因5′端侧翼启动子序列,并分析启动子功能,为进一步探索昆虫胰蛋白酶活性调控机制奠定基础。【方法】利用Genome Walking方法克隆粘虫中肠胰蛋白酶基因5′端侧翼启动子序列,运用在线分析软件NNPP v.2.2和数据库JASPAR进行序列分析,构建由胰蛋白酶基因启动子驱动的萤火虫荧光素酶报告基因载体,通过转染草地贪夜蛾sf21细胞系,瞬时表达后用双荧光素酶报告基因检测系统分析该启动子活性。【结果】克隆得到粘虫中肠胰蛋白酶基因5′端侧翼启动子序列1 863bp,其中含TATA框、CAAT框等启动子核心序列及GATA、STAT、C/EBP等转录调控元件。双荧光素酶报告基因检测系统分析表明,相对于空载体pGL3-Basic,所构建的重组载体p(-1 673/+25)具有明显的启动子活性。【结论】克隆得到的启动子片段明显具有启动报告基因表达的能力,可用于在胰蛋白酶基因启动子水平和转录因子水平研究杠柳新苷活性化合物的激活机理。     

鸭CD8α基因启动子的分析及其转录活性

【目的】对鸭CD8α基因启动子活性区域进行分析,为鸭CD8α基因功能和表达调控机理研究提供依据。【方法】利用前期基因组步移技术获得的鸭CD8α基因的启动子区序列,制备一系列启动子缺失突变体（-625/-1 bp,-1 110/-1 bp,-1 413/-1 bp,-2 151/-1 bp）,定向亚克隆至荧光素酶表达载体pGL3-Basic 中,构建荧光素酶报告基因重组载体,采用 Lipofectamine 2000 将重组质粒瞬时转染DT40细胞,分析CD8α基因启动子系列缺失突变体在细胞内的转录活性。【结果】鸭CD8α基因 5′侧翼区长片段具有较强的启动子活性,-1110--625启动子活性最强,且-625--1和-625--1 110 bp区域均存在正调控元件。【结论】成功构建了荧光素酶报告基因真核表达载体,确定了鸭CD8α基因调控区,为进一步研究其转录调控机制奠定了基础。     

牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因载体构建与活性检测

【目的】构建牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,并检测其在C2C12细胞系中的表达活性。【方法】从牛外周血中提取基因组DNA,通过PCR方法从牛基因组DNA中克隆获得牛ATP5B基因的5′端转录调控区的1 898bp目的片段,通过设计引物逐段缺失后获得7个亚克隆,将其纯化后经SmaⅠ和KpnⅠ双酶切与pGL3-Basic载体连接,连接产物转化感受态细胞DH5α,得到牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,经脂质体基因转染法转染C2C12细胞系后,检测7个重组质粒的荧光素酶活性;运用在线软件Gen-omatix和TFSEARCH对ATP5B启动子区序列进行分析。【结果】成功克隆获得7个系列缺失的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒pATP5B-1898、pATP5B-1607、pATP5B-1293、pATP5B-992、pATP5B-678、pATP5B-462和pATP5B-145;通过转染细胞和荧光素酶活性分析,可知构建的重组质粒均有启动子活性,且重组质粒pATP5B-678和pATP5B-462与空载体pGL3-Basic的荧光素酶活性差异极显著。软件分析结果显示,ATP5B基因启动子区域-763~-85bp存在多个重要转录调控元件。【结论】成功构建了7个系列缺失的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,且证实-763~-230bp为牛ATP5B基因的核心启动子区域。     

猪FAM213B基因mRNA和启动子的克隆及序列分析

【目的】获得猪FAM213B基因完整mRNA和启动子序列,研究猪FAM213B基因表达,为探讨母猪妊娠的建立和胚胎发育调控机制奠定基础。【方法】通过5'RACE和3'RACE技术,获得基因完整mRNA序列,分析不同物种该基因氨基酸序列相似性;通过PCR克隆启动子区,并通过双荧光素酶报告基因载体系统转染猪子宫内膜细胞,研究其转录活性。【结果】猪FAM213B基因mRNA全长808 bp,其中5'UTR、CDS区和3'UTR长度分别为67、609(含终止密码子)和132 bp(不含poly A序列),在17~106位氨基酸之间存在硫氧还蛋白折叠结构域;与猪FAM213B基因其他2个潜在转录本相比,三者都包含硫氧还蛋白折叠结构域,但蛋白三级结构存在较大差异;猪FAM213B氨基酸序列与山羊、牛和绵羊高度相似,相似性分别为94.03%、93.03%和91.54%。克隆获得2 261 bp(-2 231/+30)的基因启动子序列,将其连接至双荧光素酶报告基因载体,转染猪子宫内膜细胞,发现获得的启动子片段能够启动下游报告基因的转录,在启动子区存在潜在的典型NFκB等转录因子结合位点。【结论】本研究获得猪FAM213B基因转录本长度为808 bp,其蛋白存在硫氧还蛋白折叠功能结构域,其启动子序列(-2 231/+30)在猪子宫内膜细胞中具有较强的转录活性。     

山羊PRNP基因启动子转录活性研究

【目的】分析山羊PRNP基因启动子活性区域,旨在筛选调节朊蛋白表达水平的关键区域或转录因子,为阐明山羊PRNP基因的表达调控提供理论依据,并为从遗传学角度降低朊蛋白病的发生提供思路。【方法】以山羊PRNP基因序列（GenBank登录号：EU870890）为模板,设计特异性引物,扩增山羊PRNP基因5′侧翼区片段,并将扩增片段克隆至pEASY-T3载体,鉴定为阳性的克隆进行测序;利用生物信息学方法和在线工具进行启动子区域和转录因子结合位点的预测;利用缺失突变技术扩增启动子区不同长度的片段11个,并克隆至pEASY-T3载体后,鉴定为阳性的质粒和pGL3-Basic载体分别用限制性内切酶Mlu I和Bgl II进行酶切,并回收酶切产物;利用T4连接酶进行目的片段与pGL3-Basic连接,鉴定为阳性的荧光素酶报告基因重组质粒进行测序,并提取无内毒素质粒,用脂质体转染法瞬时转染至SH-SY5Y细胞,转染48h后,利用双荧光素酶检测试剂盒进行各缺失突变重组质粒在细胞内的启动活性检测。【结果】成功克隆了山羊PRNP基因5′侧翼区片段,长度为2 332 bp,且该片段含有预测的启动子活性区域、保守的motifs和多个转录因子的结合位点;成功克隆了11个含有不同长度启动子的片段,并与荧光素酶报告基因连接,并构建了目的片段与荧光素酶报告基因的重组质粒;转染时脂质体与DNA的比例为1﹕0.5,萤火虫荧光素酶载体与海肾荧光素酶比例为50﹕1;山羊PRNP基因5′侧翼区存在着核心启动子,启动子活性最强的区域为-519-+82 bp,且在-220-+59 bp这一区域存在着正调控元件,外显子1对启动子活性中起重要的调控作用;4个motifs可能为正调控元件结合位点;在强启动子活性区存在10个Sp1结合位点,2个AP-2 alpha结合位点和1个AP-1结合位点;山羊PRNP基因motif 3和motif 4分别预测为转录因子Foxp3和COE 1的结合位点。【结论】确定了山羊PRNP基因启动子的核心区域（-519-+82bp）,外显子1对启动子活性起重要的调控作用。     

HCV p7下调基因p7TP2启动子序列的克隆及转录活性检测

【目的】克隆p7TP2基因的启动子区域,并检测HCV p7TP2启动子的转录活性。【方法】通过分析确定p7TP2基因翻译起始密码子ATG上游1 203 bp至下游147 bp的基因组DNA序列作为启动子,克隆启动子片段并构建载体pCAT3-p7TP2-p和pGLB-p7TP2-p,转染HepG2细胞,应用CAT表达系统和双荧光素酶系统检测启动子活性。【结果】克隆了预测具有启动子活性的片段,成功构建了pCAT3-p7TP2-p和pGLB-p7TP2-p载体,转染pCAT3-p7TP2-p的HepG2细胞,CAT表达活性是转染pCAT3-Basic细胞的5.98倍;转染pGLB-p7TP2-p的HepG2细胞,双荧光素酶表达活性是转染pGLB细胞的9.67倍。【结论】克隆的p7TP2启动子序列与预测的序列一致,并且具有启动子转录活性。     

西农萨能羊乳腺脂肪酸合酶基因exon 9-15的克隆与序列分析

【目的】山羊FAS基因exon 9-15编码的乙酰/丙二酸单酰基转移酶（acetyl-CoA and malonyl-CoA transacylases,AT/MT）区域对山羊乳短、中链脂肪酸的合成起重要调控作用。本研究针对西农萨能羊乳腺FAS基因exon 9-15进行克隆和序列分析。【方法】以处于泌乳期28 d的西农萨能羊乳腺组织mRNA反转录的cDNA为模板,通过RT-PCR方法首次扩增出西农萨能羊乳腺FAS基因exon 9-15的cDNA序列全长及exon 8 的3′端和exon 16 的5′端部分cDNA序列（GenBank收录号为DQ 915966）,并对其进行了同源性分析和功能预测。【结果】克隆片段全长1 449 bp,其中包括exon 9-15共1 388 bp、exon 8的3′端9 bp和exon 16 的5′端52 bp,编码483个氨基酸,包含编码的AT/MT区域951 bp（454～1404 nt）;西农萨能羊乳腺FAS基因exon 9-15与牛（NM_001012669）,人（NM_004104）,大鼠（NM_017332）和鸡（NM_205155）核苷酸序列相似度分别为95%、85.7%、82.7%、73.2%,氨基酸相似度分别为92.9%、77.7%、82.3%、64.7%;exon 10较其它物种缺失1个氨基酸。【结论】克隆获得西农萨能羊FAS基因片段全长1 449 bp,外显子9-15大小分别为463、185、190、95、135、204和116 bp;核苷酸及氨基酸序列与牛相应序列的同源性均高于其它物种;AT/MT区域的活性位点在各物种间均为高度保守的丝氨酸,但西农萨能羊exon 10较其它物种缺失1个氨基酸,这可能对AT/MT区域的空间构象及其生理功能产生重要影响。本研究为西农萨能羊FAS基因cDNA全长克隆以及基因功能研究奠定了重要基础。     

犬CREBZF启动子对4种氨基酸缺失的应答效应

【目的】研究犬CREBZF启动子对4种氨基酸(谷氨酸、亮氨酸、赖氨酸和蛋氨酸)缺失的应答效应。【方法】通过PCR和双酶切方法,从犬全血基因组中扩增5′侧翼区1 767bp的DNA片段,对其进行克隆测序分析后,构建全长及系列包含不同长度CREBZF启动子的表达载体,用Quikchange试剂盒构建了CREBZF启动子定点缺失载体,转染MDCK细胞24h后,用双荧光素酶报告系统检测在氨基酸缺失条件下表达载体的双荧光素酶活性。【结果】扩增到了犬CREBZF 5′侧翼区1 767bp的启动子序列,并成功构建了包含不同长度CREBZF启动子的荧光素酶报告基因表达载体pGL3-ZF-A,pGL3-ZF-B,pGL3-ZF-C,pGL3-ZF-D,pGL3-ZF-E,pGL3-ZF-F;其中pGL3-ZF-A(-1 767→+1bp)能够应答4种氨基酸缺失;定点缺失结果显示,当缺失亮氨酸时,-1 227→-1 219bp序列(5′-ATTCACTCA-3′)的缺失可使CREBZF的转录活性完全丧失,该序列与已知的其他氨基酸应答元件(Amino acid re-sponse element,AARE)的同源性达89%。【结论】5′-ATTCACTCA-3′是犬CREBZF启动子中应答氨基酸应激必不可少的调控元件。     

美洲棉铃虫CYP321A1基因启动子区萤火虫荧光素酶报告基因载体的构建及活性测定

【目的】构建美洲棉铃虫细胞色素P450基因CYP321 A1启动子区萤火虫荧光素酶报告基因载体,为探索CYP321 A1基因的转录调控机制奠定基础。【方法】设计合成PCR引物,从美洲棉铃虫基因组DNA中扩增并克隆CYP321 A1基因的启动子区;将克隆的启动子片段插入载体pGL3-basic构建萤火虫荧光素酶报告基因载体p(-1 470/+64);用p(-1 470/+64)转染美洲棉铃虫脂肪体细胞系BCIRL-HzFB33,并用双荧光素酶报告基因检测系统分析该启动子活性。【结果】p(-1 470/+64)经双酶切、PCR鉴定及DNA测序分析鉴定准确无误;通过转染细胞和荧光素酶活性分析,证实所构建的重组载体p(-1 470/+64)可以反映CYP321 A1启动子活性;黄酮、花椒毒素处理极显著地增强了重组载体p(-1 470/+64)的荧光活性。【结论】成功构建了美洲棉铃虫细胞色素P450基因CYP321 A1启动子区萤火虫荧光素酶报告基因载体,CYP321A1启动子活性可以被植物次生物质黄酮、花椒毒素高度诱导。     

家兔β干扰素启动子质粒的构建及其启动子活性鉴定

通过家兔体内感染兔出血症病毒(RHDV)后发现体内干扰素-β(Interferon-β,IFN-β)基因表达水平明显降低。为体外研究RHDV感染宿主后IFN-β启动子的调控机制,首先以家兔肝细胞总cDNA为模板,利用PCR扩增IFN-β基因启动子区的序列,经测序确定全长为550 bp;预测软件分析,与人源IFN-β基因启动子的转录上调区域(positive regulation domain,PRD)高度同源;随后将启动子全长和一系列转录元件克隆至pGL6-Basic荧光素酶表达载体中,成功构建重组体报告基因质粒后,瞬转RK-13细胞,利用试剂盒检测荧光素酶的相对活性。结果显示,克隆的IFN-β基因启动子区和AP-1、IRF3、NF-κB和IRF7等转录元件具有显著的活性,为研究兔出血症病毒对宿主IFN-β基因的转录调控机制提供了有效的工具。     

FSHβ基因外显子2的多态性及其与两个山羊品种繁殖性能的相关性研究

 【目的】寻找与产羔数相关的遗传标记,为山羊高繁殖力标记辅助选择提供依据。【方法】根据绵羊FSHβ基因序列设计2对引物,采用 PCR-SSCP技术检测山羊FSHβ基因外显子2的多态性,利用最小二乘均数法对其与产羔数的关系进行分析,同时对多态位点的遗传方差进行分析,通过标记位点与产羔性状的遗传相关预测选择反应。【结果】在引物（P2）扩增片段中检测到1个多态位点,出现3种基因型（EE、EF和FF）。对于西农萨能奶山羊,在1～4胎和平均产羔数中,EE型个体产羔数显著高于EF和FF型个体(P＜0.05),EF型个体的第2胎和平均产羔数显著高于FF型个体(P＜0.05);对于波尔山羊,在2～3胎和平均产羔数中,EE型个体产羔数极显著高于EF和FF型个体(P＜0.01),EF型个体平均产羔数显著高于FF型个体(P＜0.05)。在西农萨能奶山羊和波尔山羊两个群体中,产羔性状的遗传主要受基因加性效应的影响。【结论】对于西农萨能奶山羊和波尔山羊,多态位点EE基因型可作为产羔性状上的标记基因型。     

Polymorphism of Exon 2 of FSHβ Gene and Its Relationship with Reproduction Performance in Two Goat Breeds

The objectives of the present study were to detect the polymorphism in follicle stimulating hormone beta （FSHβ） gene and investigate the relationship between FSHβ gene and high prolificacy in goats.According to the sequence of ovine FSHβ gene,two pairs of primers were designed to detect single nucleotide polymorphism of exon 2 of FSHβ gene in two goat breeds,Xinong Saanen dairy goat and Boer goat,by PCR-SSCP.The least square mean and genetic variance of different genotypes at polymorphic locus were analyzed,and the selection reaction was forecasted by genetic correlation between marker locus and genetic variance of litter size traits.There was one polymorphic locus occurring in exon 2 （P2） with three genotypes （EE,EF and FF）.In Xinong Saanen dairy goat,EE genotype had significantly higher （P 〈 0.05） litter size than EF and FF genotype in the first to fourth parity and average parity;EF genotype had significantly higher （P 〈 0.05） litter size than FF genotype in the second and average parity.In Boer goat,EE genotype had significantly higher （P 〈 0.01） litter size than EF and FF genotype in the second to fourth parity and average parity;EF genotype had significantly higher （P 〈 0.05） litter size than FF genotype in average parity.In Xinong Saanen dairy and Boer goat,the heredity of litter size was mainly influenced by genetic additive effect and the EE genotype is a favorable marker genotype for litter size in these two breeds.     

关中奶山羊Prm1基因的克隆及真核表达

【目的】研究雄性奶山羊Prm1基因的表达规律并克隆该基因,为奶山羊精子发生过程的研究提供分子基础。【方法】利用PCR技术从关中奶山羊睾丸组织中扩增出Prm1基因的全CDS序列,对其进行同源性比较和进化比较。同时用PCR、western blotting及免疫组化技术检测Prm1在不同年龄雄性关中奶山羊睾丸中的表达。将克隆出的奶山羊Prm1基因与pIRES-GFP载体连接构建重组真核表达载体,转染GC1细胞和人的脐带基质细胞检测Prm1基因的超表达情况。【结果】Prm1基因在成年奶山羊睾丸组织中的表达量很高,且只定位于精子头部,在其它时期的睾丸组织中基本不表达。同时扩增得到了关中奶山羊Prm1 基因CDS序列,与其它物种比对,发现其与许多物种具有较高的同源性,与牛的同源性高达97.4%,最后在GC1细胞和人的脐带基质细胞中进行了超表达。【结论】得到了关中奶山羊Prm1基因的表达规律及完整的CDS序列。     

青蒿鲨烯合酶cDNA的克隆与序列分析(英文)

[目的]对青蒿鲨烯合酶进行cDNA克隆,并进行其序列分析。[方法]根据GenBank上已发表的鲨烯合酶cDNA基因序列设计1对特异性引物,提取青蒿细胞总RNA,运用RT-PCR扩增出鲨烯合酶基因。将其与pMD19-T载体连接,并通过DNAman、NCBI Blast、ExPASy ProtParam等工具,对克隆片段序列进行分析。[结果]SS基因全长1257bp,编码418个氨基酸;同源性分析表明,青蒿SS基因序列与人参、积雪草、金铁锁、大豆、辣椒、百脉根、远志、玉米、褐家鼠、小鼠以及人相应序列的同源性分别为77.21%、76.11%、75.66%、74.62%、73.83%、74.46%、73.03%、64.39%、52.22%、50.51%和50.12%;氨基酸同源性分别为79.43%、79.00%、75.84%、79.43%、77.27%、77.03%、66.03%、40.65%、40.19%和40.09%。由SS基因翻译出来的蛋白质分子量为47.8394KDa,理论等电点为8.57,无信号肽。疏水性分析表明,在400~417区域疏水性较强。跨膜区分析表明有3处跨膜区域,分别为170～186位的17个氨基酸、282～305位的24个氨基酸、387～407位的21个氨基酸。通过NCBI的BLAST程序分析指出,该基因编码的氨基酸序列含有Trans_IPPS_HH的保守区域,也具有与Mg2+结合有关的活性中心——富含天门冬氨酸的区域(DXXDD)。2级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主。[结论]青蒿鲨烯合酶cDNA的成功克隆,为进一步研究SS基因结构、基因表达与调控提供了重要依据。     

青蒿鲨烯合酶cDNA的克隆与序列分析

[目的]对青蒿鲨烯合酶进行cDNA克隆,并进行序列分析。[方法]根据GenBank上已发表的鲨烯合酶cDNA基因序列设计1对特异性引物,提取青蒿细胞总RNA,运用RT-PCR扩增出鲨烯合酶基因。将其与pMD19-T载体连接,并对克隆片段序列进行分析。[结果]SS基因全长1257bp,编码418个氨基酸;同源性分析表明,青蒿SS基因序列与人参、积雪草、金铁锁、大豆、辣椒、百脉根、远志、玉米、褐家鼠、小鼠以及人相应序列的同源性分别为77.21%、76.11%、75.66%、74.62%、73.83%、74.46%、73.03%、64.39%、52.22%、50.51%和50.12%;氨基酸同源性分别为79.43%、79.00%、75.84%、79.43%、77.27%、77.27%、77.03%、66.03%、40.65%、40.19%和40.09%。[结论]青蒿鲨烯合酶cDNA的成功克隆,为进一步研究SS基因结构、基因表达与调控提供了重要依据。     

猪生长激素启动子的克隆及功能分析(英文)

[目的]克隆猪生长激素启动子,确定其启动子核心序列和主要的顺式作用元件。[方法]根据NCBI上公布的序列设计引物,PCR扩增了猪生长激素5’端-1821~+61bp的序列,并通过移步缺失的方法,获得9段长短不一的启动子序列,将其分别构建到双荧光素酶表达载体pGL3-basic上。通过重组质粒瞬时转染大鼠垂体瘤细胞(GH3)、猪髋动脉血管内皮细胞(PIEC)和猪肾细胞(PK15)和转染后细胞荧光素酶活性的测定,检测这些5’末端缺失质粒在垂体及非垂体细胞中的相对转录活性。[结果]成功扩增了猪GH基因5’上游启动区1882bp的片段并构建了9个pGL3-mGHpromoter报告基因载体;双荧光素酶报告基因检测系统证实插入报告基因载体中的启动子具有非常强的细胞特异性。[结论]猪生长激素特异性在垂体细胞中表达,其最小启动子位于-110bp以内,启动子区-218~-110bp和-429~-218bp间存在正向调控元件。     

“大通＂牦牛Lfcin基因克隆及生物信息学分析

乳铁蛋白素（Lactoferricin,Lfcin）是从乳铁蛋白（LF）上被胃蛋白酶水解下来的25个氨基酸残基的小肽,位于乳铁蛋白第二外显子,是乳铁蛋白的抗菌活性中心,其抗菌活性是LF的几百倍。Lfcin具有广谱抗菌活性,对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有效,同时具有抗真菌、抗病毒、抑制肿瘤细胞生长、参与免疫调节等多种生物学功能和维持动物肠道菌群正常生态稳定的功能,从而起到提高动物生产性能的作用。     

基于α-半乳糖苷酶基因为筛选标记的酿酒酵母诱导型表达载体的构建及应用

以α-半乳糖苷酶基因为筛选标记,构建GAL1诱导型启动子介导的酿酒酵母表达载体YGM-α-gal质粒,将枯草芽孢杆菌的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因克隆到此载体中,构建质粒YGMPA-α-gal,转化宿主酵母后,实现β-1,3-1,4-葡聚糖酶在酿酒酵母中的分泌表达.结果表明:在2%半乳糖诱导下,摇瓶发酵24h后分泌表达的β-葡聚糖酶活性达到411.9U爛mL-1,而在培养60h后,发酵液中α-半乳糖苷酶活性可达64.2U爛mL-1.说明α-半乳糖苷酶基因可用作酿酒酵母表达载体转化的有效筛选标记,为食品级酿酒酵母表达系统的构建提供了新选择.