牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因载体构建与活性检测

【目的】构建牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,并检测其在C2C12细胞系中的表达活性。【方法】从牛外周血中提取基因组DNA,通过PCR方法从牛基因组DNA中克隆获得牛ATP5B基因的5′端转录调控区的1 898bp目的片段,通过设计引物逐段缺失后获得7个亚克隆,将其纯化后经SmaⅠ和KpnⅠ双酶切与pGL3-Basic载体连接,连接产物转化感受态细胞DH5α,得到牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,经脂质体基因转染法转染C2C12细胞系后,检测7个重组质粒的荧光素酶活性;运用在线软件Gen-omatix和TFSEARCH对ATP5B启动子区序列进行分析。【结果】成功克隆获得7个系列缺失的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒pATP5B-1898、pATP5B-1607、pATP5B-1293、pATP5B-992、pATP5B-678、pATP5B-462和pATP5B-145;通过转染细胞和荧光素酶活性分析,可知构建的重组质粒均有启动子活性,且重组质粒pATP5B-678和pATP5B-462与空载体pGL3-Basic的荧光素酶活性差异极显著。软件分析结果显示,ATP5B基因启动子区域-763~-85bp存在多个重要转录调控元件。【结论】成功构建了7个系列缺失的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒,且证实-763~-230bp为牛ATP5B基因的核心启动子区域。     

牛ATP5B基因启动子与组织差异性表达研究

本研究旨在检测前期构建的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒在3T3L-1细胞系中的表达活性,检测ATP5B基因在不同组织中的差异表达情况。经脂质体法转染3T3L-1细胞系后,检测7个重组质粒的荧光素酶相对活性,结合生物信息学软件进一步确认牛ATP5B基因可能的核心启动子;利用试剂盒从秦川牛的16个不同组织提取RNA,反转录后,先检测cDNA,再设计ATP5B基因定量引物和1对β-actin内参引物,进行实时荧光定量反应,最后,结合软件比对不同物种的ATP5B基因近端启动子和氨基酸序列。结果,通过转染细胞和荧光素酶活性分析,统计学分析证实重组质粒pATP5B-462荧光素酶活性最高,软件分析所对应的启动子区域-547~-230bp存在TATA盒、CAAT盒、GATA盒、v-Myb、deltaE这些重要转录调控元件。牛的ATP5B基因组织表达谱结果分析显示,该基因在后腿肌和背最长肌中相对高水平表达,在睾脂、心、瓣胃、皱胃、大肠、小肠、背脂、肾和肝中相对中度表达,在脾、肺、盲肠、瘤胃和网胃中相对微量表达。氨基酸序列比对结果显示,牛ATP5B基因与山羊、绵羊、小鼠、猪和人的ATP5B基因的相似性较高,牛ATP5B基因编码的氨基酸序列与山羊和绵羊的相似性分别高达99%、98%,与人和小鼠的相似性均为96%,与猪的相似性为91%。本研究初步确认了牛ATP5B基因可能的核心启动子,并得到了牛ATP5B基因在16个组织的表达谱结果,软件比对基因序列的结果进一步表明,ATP5B基因是一个较为保守的基因,这为进一步研究牛ATP5B基因的转录调控机制及功能都奠定了基础。