家兔卵巢间质细胞的分离培养与形态观察

采用0.1% 型胶原酶和2.5g/L胰蛋白酶-0.2g/LEDTA,分别用热消化法和冷消化法消化分离家兔卵巢间质细胞,以探讨其体外培养条件和生长特点。结果表明,无论用热消化法还是冷消化法,0.1% 型胶原酶的消化效果均好于2.5g/L胰蛋白酶-0.2g/LEDTA的消化效果,前者的细胞活率在90%以上,可用于体外培养;经74μm滤网过滤后的卵巢组织分离培养出梭形和不规则形的间质细胞,且2种类型的细胞能在同一培养体系中贴壁生长。说明0.1% 型胶原酶可用于家兔卵巢间质细胞的分离。     

山羊腺垂体细胞的分离培养与鉴定

【目的】探讨山羊腺垂体细胞的分离和培养方法,为其体外分泌特性研究奠定基础。【方法】采集山羊腺垂体,分别用胰蛋白酶、胶原酶、胰蛋白酶和胶原酶混合、胰蛋白酶和透明质酸酶混合对其进行消化,所获细胞培养后采用免疫细胞化学法进行鉴定,评价细胞消化结果和腺垂体细胞的生长特性。【结果】山羊腺垂体组织在37℃条件下,以1 g/LⅣ型胶原酶和1 g/L透明质酸酶混合消化2.5～3 h,消化效果较好;所得细胞在培养24 h开始贴壁,72 h后细胞主要呈多角形或梭形,连接成片,培养6 d左右细胞即可铺满培养器皿的细胞生长面。免疫细胞化学鉴定结果显示,FSH阳性细胞胞质呈蓝色,PRL阳性细胞胞质呈蓝褐色;放射免疫分析法测定表明,分离、培养的腺垂体细胞具有激素分泌活性。【结论】采用筛选的消化和分离方法可获得山羊腺垂体细胞,所获腺垂体细胞体外培养体系,可用于体外研究腺垂体细胞的功能和内分泌调控作用。     

新生犊牛睾丸支持细胞的高效分离培养与鉴定

【目的】采用改良方法对犊牛睾丸支持细胞进行体外快速分离培养,以期建立一种简单快捷的支持细胞原代培养方法。【方法】采用1.0 g/L的Ⅳ型胶原酶和2.5 g/L的胰蛋白酶,对经分离曲细精管和组织剪碎2种方法处理的睾丸组织进行次第消化,比较2种方法对睾丸支持细胞分离效果的影响;采用福尔根染色法和免疫细胞化学方法鉴定睾丸支持细胞。【结果】睾丸组织采用分离曲细精管后进行酶消化的时间(8 min)较组织剪碎法(15min)短,并且前者消化所得有效细胞数(1.0×107)高于后者(0.81×107),两者具有显著差异(P0.05);福尔根染色和免疫细胞化学染色结果显示,分离细胞有卫星核小体存在,且细胞中ABP阳性表达,表明分离培养的细胞确为睾丸支持细胞。【结论】睾丸组织经曲细精管分离后进行胶原酶和胰蛋白酶次第消化,有助于快速高效分离睾丸支持细胞。     

鸡胚小肠上皮细胞的分离培养及其热应激效应

【目的】比较不同消化酶对鸡胚小肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IECs)的分离和培养效果及细胞的热应激能力,为后续研究提供依据。【方法】以15日龄鸡胚为研究对象,分别使用0.5 g/L胰蛋白酶、胶原酶Ⅰ与透明质酸酶联合及中性蛋白酶Ⅱ消化分离其小肠上皮细胞。培养不同时间后,观察IECs的生长状态,测定细胞生长活性;通过免疫荧光染色和免疫组化对所得IECs进行鉴定,确定最佳的消化酶。对优化所得鸡胚IECs于42℃分别进行2,3,4 h热应激处理,以37℃处理的IECs为对照,MTT法和流式细胞测定IECs的相对活力和凋亡率。【结果】细胞形态学观察发现,用胶原酶Ⅰ与透明质酸酶联合消化分离得到了大量小肠绒毛隐窝团块,易贴壁,细胞生长快;用0.5 g/L胰蛋白酶和中性蛋白酶Ⅱ消化分离得到的细胞数量少,贴壁慢。用3种酶消化方法分离的细胞生长曲线均呈"S"形,但用胶原酶Ⅰ与透明质酸酶联合消化分离的细胞生长曲线峰值较高,细胞活性强;联合消化所得IECs特异性标记抗原均为阳性,免疫荧光阳性率达(92.7±7.9)%,细胞膜质呈棕黄色,而对照组细胞膜质无着色。42℃下热应激3 h后细胞活力极显著下降,凋亡率为(35.96±1.57)%,极显著高于对照组的(0.67±0.02)%,可进行后续试验。【结论】采用胶原酶Ⅰ与透明质酸酶联合消化可得到IECs;42℃下处理3 h是构建IECs热应激模型的条件。     

消化法培养山羊乳腺上皮细胞

为了寻找更加有效的山羊乳腺上皮细胞分离纯化方法。用2 g/L胶原酶和0.5 g/L胰蛋白酶相结合的消化法培养山羊乳腺上皮细胞,2~3 d细胞铺满单层,形态如铺路石。所得细胞再经0.5 g/L胰蛋白酶/0.2 g/L EDTA纯化3~4次,得到比较纯净的山羊乳腺上皮细胞。细胞鉴定结果表明,所得到的细胞角蛋白染色呈阳性,阳性率大于90%,波形蛋白染色呈阴性,具有典型的上皮细胞特性。消化法适用于山羊乳腺上皮细胞的体外培养。     

4种小鼠肠上皮细胞分离培养方法的比较

【目的】比较4种小鼠肠黏膜上皮细胞(Intestinal epithelial cells,IECs)分离方法的分离效果,建立小鼠IECs的有效分离培养方法,获得小鼠IECs原代细胞,为后续研究做准备。【方法】分别采用组织块培养法、嗜热菌蛋白酶消化法、胶原酶Ⅺ和中性蛋白酶Ⅰ联合消化法以及胶原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ联合消化法共4种方法分离小鼠IECs并培养,通过细胞免疫组织化学法和细胞免疫荧光法对分离的IECs进行细胞特异性鉴定,比较4种方法的分离效果。【结果】组织块培养法所获IECs活力好,增殖能力强,但成纤维细胞污染较严重,细胞纯度低;胶原酶Ⅰ和中性蛋白酶Ⅵ分离法获得的IECs数量少且细胞增殖能力弱;嗜热菌蛋白酶消化法及胶原酶Ⅺ与中性蛋白酶Ⅰ联合消化法所获得的小鼠IECs纯度较高,原代培养时增殖能力稍弱于组织块培养法,但传代后增殖能力趋于稳定。通过细胞免疫组织化学法和细胞免疫荧光法对分离的细胞进行鉴定,结果表明,分离的细胞多数为小鼠IECs。【结论】嗜热菌蛋白酶消化法及胶原酶Ⅺ与中性蛋白酶Ⅰ联合消化法均适合肠道上皮细胞的分离和培养。     

家兔子宫平滑肌细胞的体外分离培养

【目的】研究家兔子宫平滑肌层细胞的体外培养和扩增方法。【方法】应用酶解消化法对新西兰大白兔的子宫平滑肌细胞进行体外分离和培养,并研究不同水平性腺激素对其生长的影响。【结果】酶解消化法可成功进行家兔子宫平滑肌细胞的体外培养和传代。子宫平滑肌细胞在体外的增殖受卵巢性腺激素的影响,100nmol/L雌二醇对其体外增殖有促进作用,而100nmol/L孕酮则有抑制作用。免疫组织化学结果表明,体外培养的子宫平滑肌细胞在激素作用下仍可维持其特性,在体外可传9~10代。【结论】建立了家兔子宫平滑肌细胞的体外培养和扩增方法,可为构建子宫三维结构提供充足的种子细胞。     

山羊输卵管上皮细胞的分离与培养

【目的】分离并培养山羊输卵管上皮细胞,研究其生长特性。【方法】采用胰酶、胶原酶及机械刮取方法分离输卵管上皮细胞并分析培养效果;选择免疫细胞化学染色对细胞进行鉴定;向培养液中添加下丘脑粗提物、胰岛素、EGF和血清,探讨其对输卵管上皮细胞体外培养的影响。【结果】胰酶对山羊输卵管上皮细胞的分离效果较差,胶原酶次之,机械刮取方法较好。机械刮取法分离的细胞以细胞团居多,接种后8~12 h开始贴壁生长,生长2~3d细胞呈现明显的铺路石形态。免疫细胞化学染色显示,细胞角蛋白阳性率在95%以上。上皮细胞培养体系中含少量血清及人EGF、胰岛素,能有效促进原代和传代输卵管上皮细胞的生长,以体积分数5%血清+EGF的培养效果较好。【结论】采用机械刮取法分离培养的输卵管上皮细胞,在体外可连续传到第8代,传代细胞活性强、纯度高,可为输卵管上皮细胞相关功能的研究提供材料。     

秦川牛胎儿骨骼肌卫星细胞的分离培养

【目的】探索胎牛骨骼肌卫星细胞分离、培养、鉴定及基因转染的方法。【方法】分别采用Ⅰ型胶原酶消化、Ⅰ型胶原酶与胰蛋白酶二步消化及链霉蛋白酶消化法对胎牛骨骼肌卫星细胞进行培养,比较了3种不同分离方法所得细胞数及其存活率的差异;利用差速贴壁法和Percoll密度梯度离心相结合的方法纯化骨骼肌卫星细胞,对纯化后的细胞进行myostatin基因RT-PCR以及结蛋白(Desmin)免疫细胞化学染色鉴定,最后通过电转染法对纯化的骨骼肌卫星细胞进行EGFP基因转染研究。【结果】3种消化培养方法中,以链霉蛋白酶消化法分离得到的胎牛骨骼肌卫星细胞数显著高于其它2种方法(P0.05),但细胞存活率较低(P0.05);而采用Ⅰ型胶原酶与胰蛋白酶二步消化法可以得到相对较高的细胞数及存活率。利用差速贴壁和Percoll密度梯度离心相结合的方法可以得到纯化的骨骼肌卫星细胞;电转染法适用于骨骼肌卫星细胞的基因转染。【结论】建立了胎牛骨骼肌卫星细胞分离、培养、纯化、鉴定及基因转染的方法,为通过转基因方法改良秦川牛产肉性能研究奠定了基础。     

孕早期家兔子宫内膜细胞的分离培养与形态观察

为探讨子宫内膜细胞的分离与体外培养条件、生长特点及其增殖过程,采用不同消化方法进行了孕早期家兔子宫内膜细胞的消化和分离培养试验。结果表明,多数情况下采用胰蛋白酶消化获得的细胞数量少且活率低于60%,而采用1g/L胶原酶 型消化获得的细胞数量多达1×106/cm3,且活率大于90%。经74μm(200目)滤网过滤分离培养出多角形和梭形2种形态的基质细胞及铺路石状的腺上皮细胞,并均能在体外培养和传代。     

大鼠骨髓干细胞的分离、培养和诱导生成内皮祖细胞的研究

目的探讨大鼠骨髓干细胞的体外分离、培养和诱导生成内皮祖细胞的的可行性,并检测其表型和功能。方法取大鼠长骨骨髓细胞,第3代细胞传代后加用终质量浓度10μg/L的血管内皮生长因子（VEGF）的细胞因子,培养3 d后行内皮细胞特异性成分鉴定。结果（1）免疫组化染色鉴定：P3代CD133呈中度阳性表现,CD34呈弱阳性表现;经VEGF诱导后表达明显增强。（2）流式细胞仪细胞计数鉴定：P3代CD133、CD34阳性细胞率分别为97.3%、55.5%;经VEGF诱导后CD133、CD34阳性细胞率分别为91.4%、78.6%。（3）P3代VEGF诱导后乙酰化低密度脂蛋白（ac-LDL）、荆豆凝集素（UEA）双染鉴定：经VEGF诱导的P3代细胞ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色阳性率（70.2±5.1）%,未经VEGF诱导后的P3代细胞ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色阳性率（20.4±3.8）%。（4）RealTime-PCR检测第3代VEGF cell和三代cell的内皮细胞特异性成分表达：P3 VEGF cell血管内皮生长因子受体2（VEGF-R2）浓度是P3cell的2.22倍。结论用贴壁筛选法和VEGF细胞因子培养大鼠骨髓干细胞可以获得较高纯度的内皮祖细胞（EPCs）,该细胞具有内皮祖细胞的特性,可用于进一步向内皮细胞分化的研究与应用。     

氨对悬浮培养幼仓鼠肾细胞(BHK-21)生长代谢的影响

【目的】研究在幼仓鼠肾细胞(BHK-21)悬浮培养过程中,不同浓度氨对其生长代谢的影响。【方法】用添加0,1.8,2.5,5.5,8.0和15.0 mmol/L氨的培养基培养BHK-21细胞,每隔12 h取样1次,用细胞计数仪进行细胞计数,测定细胞活力,采用AO/EB双染色法和Annexin V-FITC/PI流式细胞仪2种方法检测细胞的凋亡情况,同时测定细胞培养过程中葡萄糖、氨和乳酸浓度的变化。【结果】在BHK-21细胞连续培养过程中,当氨的添加浓度低于1.8 mmol/L时,其对细胞的生长几乎不产生抑制作用,细胞活性、细胞总数与对照组差异不显著,未出现细胞聚集成团现象;当氨添加浓度达到15.0 mmol/L时,BHK-21细胞直接进入死亡期;当氨的添加浓度为2.5~8.0 mmol/L时,氨对细胞生长的抑制作用由弱变强,这种抑制作用在细胞培养至24 h开始出现。另外,随着氨添加浓度的增加,葡萄糖的消耗量减少,细胞代谢产生的乳酸和氨降低。【结论】氨对悬浮培养的BHK-21细胞的生长和代谢有显著影响。     

一种有效分离及在体外扩增成年小鼠精原干细胞的方法

尝试建立一种简便有效的成年小鼠精原干细胞分离培养及扩增的方法。从单只成年小鼠的睾丸中经过两步酶消化法分离精原干细胞,并在去除间质细胞、纯化后的支持细胞饲养层上培养与扩增,获得稳定增殖的精原干细胞系。此方法可显著提高建系成功率,保证细胞系的单一基因型,显著降低体外培养精原干细胞的成本。为成体基因来源的转基因动物的制作和疾病模型的建立提供技术支持。     

鱼类干细胞育种技术回顾与展望

鱼类是优质动物蛋白的重要来源,其中养殖鱼类占重要地位,而通过选择育种、杂交育种等传统方法和分子辅助育种、基因编辑等新技术培育优良品种是鱼类养殖业健康持续发展的关键.近年来,鱼类干细胞技术特别是细胞移植和诱导技术快速发展,为鱼类优良品种培育提供了新的技术途径.介绍了鱼类干细胞育种的现状及应用,总结了鱼类干细胞育种技术面临...     

亚硒酸钠对人早幼粒白血病细胞（HL－60）的影响

以人早幼粒白血病细胞（ＨＬ－６０）为实验对象，研究了亚硒酸钠对细胞的影响。结果发现５．８μｍｏｌ／Ｌ亚硒酸钠可以抑制ＨＬ－６０细胞生长，但１１．６μｍｏｌ／Ｌ以上浓度时对细胞的毒性加重。未发现亚硒酸钠能诱导ＨＬ－６０细胞进行形态和功能分化。     

山羊胚胎心肌细胞分化发育的超微结构研究

利用透射电镜观察了山羊胚胎心肌细胞分化发育过程中超微结构的变化。结果表明 :2 6日龄的山羊胚胎心肌细胞内肌节初步形成。随着胚胎发育 ,心肌细胞的肌节逐步完善 ,心肌细胞内的线粒体数量逐渐增多 ,排列规则 ,线粒体嵴逐渐变密 ,心肌细胞之间的连接也随着胚胎的生长发育逐渐形成和加强 ;2 6日龄山羊胚胎心肌内可见粗面内质网 ;34日龄的山羊胚胎心肌细胞胞浆内可见肌浆网、肌膜下池、横小管和二联管已形成 ;山羊胚胎心肌细胞内糖原颗粒丰富 ,随着胚胎日龄的增长 ,胞质内散布的糖原颗粒呈减少的趋势 ,而肌丝之间的糖原颗粒呈增加趋势 ;2 6日龄的山羊胚胎心房肌内出现少量特殊颗粒     

免疫小鼠脾脏中抗原提呈细胞的快速分离

应用胶原酶消化脾脏、 Ｂ Ｓ Ａ 梯度离心富集低浮密度细胞和 Ｆ Ａ Ｃ Ｓ分选细胞法,自小鼠脾脏中分离出高纯度树突细胞、吞噬细胞和 Ｂ淋巴细胞。分离的 ３ 种细胞样品中分别含 ９７％ 树突细胞、９６％ 吞噬细胞和 ９９％ Ｂ淋巴细胞。而纯化前,树突细胞和吞噬细胞在低浮密度细胞中仅分别占 ６５％ 和 ３５％ , Ｂ 淋巴细胞占脾细胞的 ４２％ 左右。该程序简便、快速、准确,在一个工作日内可制备大量细胞, 并适用于其他淋巴组织中抗原提呈细胞的纯化。     

南方鲶SME－Ⅰ细胞系的建立及其生物学特性的研究

用半消化法和组织块法接种南方鲶晚期胚，经４０多代连续培养，建立了ＳＭＥ－Ⅰ鲶鱼细胞系。该细胞系为贴附性上皮样细胞。细胞内微丝束丰富，平行排列伸到伪足，但质膜下不很密集。细胞最适在含１５％～２０％小平血清的１６４０培养基中生长，适温２８～２９℃，ｐＨ６．５～７．２，群体倍增时间为５８．６ｈ，已增殖到１０￣８个的水平。细胞染色体数为正常二倍体２ｎ＝５８，但有不少异倍化细胞。该细胞系已可用于鱼类生物工程研究和进入细胞资源库保存。     

仔猪肠黏膜上皮细胞体外培养及其对小檗碱适应性的研究

为了体外分离培养和鉴定仔猪肠粘膜上皮细胞,探讨小檗碱对体外培养的仔猪肠粘膜上皮细胞的安全剂量。本试验取刚出生未吃初乳的仔猪小肠的回肠段,用胰蛋白酶和胶原酶Ⅳ进行消化处理,获得原代仔猪肠粘膜上皮细胞,用免疫组化法对培养的仔猪肠粘膜细胞进行鉴定,用MTT检测法测定硫酸小檗碱对仔猪肠粘膜上皮细胞的安全浓度。结果表明:免疫组化法分离培养的细胞膜呈棕黄色,为粘膜上皮细胞。硫酸小檗碱对体外培养的仔猪肠粘膜上皮细胞的安全浓度为20μmol/L。     

家兔子宫内膜细胞和平滑肌细胞的分离培养及鉴定

为了建立一种高效的子宫细胞分离培养方法,用酶消化、过滤、离心与差速贴壁纯化相结合的方法分离培养家兔子宫细胞,分别以上皮细胞角蛋白、波形蛋白、α-平滑肌肌动蛋白等为抗原的免疫荧光对分离培养的细胞进行鉴定,并采用流式细胞仪分析细胞纯度。结果表明,家兔子宫内膜上皮细胞培养24 h后大部分贴壁,培养3 d左右形成单层细胞集落,呈角蛋白阳性,细胞圆形或椭圆形,胞质呈红色,核呈蓝色,纯度达96%以上;子宫内膜基质细胞培养0.5 h后即有贴壁,培养2 d后呈单层细胞集落状生长,呈波形蛋白阳性,细胞多边形或梭形,胞质呈红色,核呈蓝色,纯度达95%以上;平滑肌细胞培养24 h后大部分贴壁,6~7 d融合成片,呈α-平滑肌肌动蛋白阳性,细胞大都长梭形,胞质呈红色,核呈蓝色,纯度达98%以上。说明该方法能够成功分离并得到高产量、高纯度、高增殖能力的子宫内膜细胞及平滑肌细胞。