褐飞虱一个新的海藻糖合成酶基因的特性、 发育表达及RNAi效果分析

背景 昆虫海藻糖合成酶基因是昆虫海藻糖合成的主要基因,大多数昆虫中只拥有一个海藻糖-6-磷酸合成酶（trehalose-6-phosphate synthase,TPS）基因,部分昆虫存在一个海藻糖-6-磷酸酯酶（trehalose-6-phosphate phosphatase,TPP）基因。前期研究发现褐飞虱（Nilaparvata lugens）中拥有两个TPS,对其功能研究发现TPS不仅能够调控海藻糖代谢,还可介导海藻糖酶调控几丁质合成与降解途径,控制昆虫的蜕皮过程。目的 通过对褐飞虱转录组测序分析获得了一个新的TPS,检测该基因在褐飞虱不同发育阶段的表达情况,探究该基因的功能与前期发现的两个TPS的区别。方法 对获得的新TPS基因序列采用克隆技术获得全长cDNA序列,经验证正确后,对其蛋白的一级、二级、三级结构及与其他昆虫的TPS进行比对分析,最后采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术测定3个不同TPS在褐飞虱不同发育阶段的表达,并采用RNA干扰（RNAi）技术抑制TPS3的表达。结果 在前期研究的基础上,克隆出一个新的TPS,并命名为TPS3。TPS3开放阅读框长度为2 352 bp,编码783个氨基酸,预测蛋白分子量为88.9 kD,等电点为5.47,具有亲水性结构。生物信息学分析表明,褐飞虱3个TPS蛋白具有较高的同源性,都具有TPS和TPP两个保守结构域及其他特征序列,并且α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲所占的比例较为接近。褐飞虱不同发育阶段3条TPS的相对表达量不同,TPS1的相对表达量从4龄0 h开始逐渐上升,至成虫阶段达到最高,TPS2的相对表达量从4龄末期开始明显上升且在整个5龄阶段都有较高的表达,TPS3的相对表达量在5龄末期和成虫初期较高。单独干扰褐飞虱TPS3 48 h后被干扰基因的相对表达量下降,dsTPS3能有效抑制TPS3的表达。结论 在褐飞虱中发现一个新的TPS（TPS3）,其与褐飞虱中已经报道的TPS1和TPS2具有较高的同源性。不同发育阶段表达结果表明,3个TPS在发育过程中行使的功能不同。RNAi能够有效抑制TPS3的表达并导致褐飞虱蜕皮障碍和翅发育畸形。     

褐飞虱丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Nlserpin2的克隆及其功能分析

【目的】 克隆鉴定褐飞虱（Nilaparvata lugens）丝氨酸蛋白酶抑制剂基因Nlserpin2,探明其表达模式和生物学功能。【方法】 基于褐飞虱转录组数据,利用PCR技术克隆Nlserpin2全长cDNA序列;利用生物信息学手段分析其核酸和蛋白序列特征;通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）技术检测其在褐飞虱不同发育时期（卵、1—5龄若虫和雌雄成虫）和初羽化雌成虫不同组织（脂肪体、肠道和卵巢）中的表达,以及病原真菌金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）侵染褐飞虱5龄若虫不同时间后的诱导表达模式;利用RNAi技术探明Nlserpin2基因沉默对褐飞虱5龄若虫存活率及抵御金龟子绿僵菌侵染能力的影响。【结果】 Nlserpin2 cDNA序列（GenBank登录号：KC355239）全长1 209 bp,编码402个氨基酸,含有serpin蛋白超家族所具有的典型serpin结构域和RCL区,且N端包含一段由27个氨基酸残基组成的信号肽。系统进化树分析表明,Nlserpin2与半翅目其他昆虫的serpin聚为一支,其中与白背飞虱（Sogatella furcifera）serpin亲缘关系最近。qRT-PCR分析表明,Nlserpin2表达具有明显的时空特异性,其在褐飞虱成虫中的表达量显著高于其他龄期,且在雄成虫中表达量最高;卵和低龄若虫（1—3龄）中Nlserpin2的表达量显著低于高龄若虫（4—5龄）,其中3龄若虫期最低;Nlserpin2在褐飞虱雌成虫肠道、脂肪体和卵巢中均有表达,且肠道中表达量显著高于脂肪体和卵巢。金龟子绿僵菌诱导2 d和3 d后Nlserpin2的表达量显著上调,但随着诱导时间的增加,Nlserpin2表达量呈回稳趋势。RNAi分析结果显示,显微注射dsNlserpin2可显著抑制Nlserpin2的表达水平。干扰Nlserpin2后褐飞虱5龄若虫的存活率以及对金龟子绿僵菌侵染的抵御能力均显著降低。与对照组相比,Nlserpin2干扰的褐飞虱在金龟子绿僵菌侵染5 d和8 d后的校正存活率分别下降了28.4%和31.0%,且均达到显著水平。【结论】 Nlserpin2在褐飞虱防御病原真菌侵染过程中发挥重要作用,可作为应用RNAi技术防控褐飞虱的潜在靶标和褐飞虱高毒力病原真菌遗传改良的资源基因。     

双价RNA干扰载体的构建及dsRNA体外饲喂褐飞虱的研究

RNA干涉作为一种重要基因沉默技术,已广泛用于昆虫基因功能的研究。通过人工饲喂或显微注射dsRNA介导RNAi在许多昆虫中取得了成功。为利用RNAi技术进行褐飞虱防治研究,本试验通过重组PCR,获得了编码V-ATPase D亚基和编码V-ATPase H亚基基因片段的融合基因,在此基础上构建了该融合基因发夹结构的RNAi表达载体,通过体外合成dsRNA喂食褐飞虱若虫后导致褐飞虱体内目标基因的表达下降和死亡率的增加。因此双价RNAi载体的构建为利用RNA沉默技术进行植物抗飞虱研究奠定了基础。     

褐飞虱GSK-3调控糖原与海藻糖代谢的潜在功能

【目的】昆虫胰岛素信号途径能够介导糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase 3,简称GSK-3或GSK3）调控体内糖原及海藻糖等糖代谢过程,从而控制昆虫的各项生命活动。论文旨在探究糖原合成酶激酶在褐飞虱（Nilaparvata lugens）体内对糖原与海藻糖代谢的调控作用。【方法】首先,基于GSK-3的cDNA编码序列,利用ExPASy工具翻译GSK-3氨基酸序列,预测蛋白分子量大小及等电点（pI）;然后利用SignaIP4.1Server对其信号肽进行分析。其次,以笔者实验室饲养的褐飞虱为研究对象,从4龄开始,每12 h取材,取至成虫48 h。利用Trizol法提取褐飞虱总RNA,根据反转录试剂盒合成第一链DNA,以18S作为内参基因,通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测褐飞虱GSK-3在不同龄期mRNA水平上的相对表达量。然后利用RNAi技术,向褐飞虱体内显微注射双链RNA(dsRNA)抑制GSK-3,以注射dsGFP的褐飞虱作为对照组。注射后48 h利用qRT-PCR技术检测GSK-3的表达情况,确定抑制效果。另外,取注射后48 h虫体,分别测定褐飞虱体内海藻糖、葡萄糖、糖原含量及海藻糖酶（trehalase,TRE）活性变化。最后采用qRT-PCR检测胰岛素信号通路胰岛素受体基因(insulin receptor,InR)、类胰岛素多肽基因(insulin-like peptides,Ilps)及海藻糖代谢途径TRE、海藻糖合成酶基因(trehalose-6-phophate synthase,TPS)、糖原磷酸化酶基因(glycogen phosphorylase,GP)、糖原合成酶基因(glycogen synthase,GS)中相关基因的表达,分析GSK-3在胰岛素信号通路及海藻糖代谢途径中的调控作用。【结果】褐飞虱GSK-3开放阅读框为1 914 bp,编码637个氨基酸;预测蛋白分子量为69.25 kD,等电点为9.15,为偏碱性蛋白,无信号肽结构,序列高度保守。发育表达模式结果显示GSK-3在不同发育阶段表达不一致,5龄若虫蜕皮前后低表达。GSK-3的dsRNA注射后48 h,与对照组dsGFP相比,GSK-3表达极显著下降,表明RNA干扰效果明显。糖原含量和两类海藻糖酶活性显著下降,而海藻糖含量显著上升,推测糖原和葡萄糖转化为海藻糖,作为其生理活动的能量来源。qRT-PCR检测发现,当GSK-3表达抑制后48 h,TRE1-2的表达量显著下降,而TRE1-1和TRE2的表达量极显著下降。另外,2个TPS基因、GS以及GP的表达量均极显著下降;胰岛素信号通路的2个InR基因和4个Ilps基因的表达同样被抑制,间接表明InR能够调控GSK-3的表达。【结论】褐飞虱GSK-3低表达后能够通过调控胰岛素信号通路及海藻糖代谢途径相关基因表达来调控糖原及海藻糖代谢。相关研究结果有助于更加全面地探索褐飞虱等昆虫糖原合成酶激酶调控海藻糖及糖类物质平衡的潜在分子机理。     

褐飞虱组蛋白H3与H2A基因启动子克隆与序列分析

褐飞虱是对水稻危害最严重的害虫之一,目前缺少对褐飞虱内源高效启动子的研究。以褐飞虱的组蛋白H3与H2A基因为研究对象,通过已知的果蝇H3与H2A序列搜寻Genbank上褐飞虱表达序列标签(expressed sequence tags,简称EST)数据库,从而获得同源序列来设计嵌套引物。然后通过染色体步移的交错式热不对称PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,简称Tail-PCR)技术获得H3与H2A ATG前侧翼序列,分别为1 664、538 bp。PLACE软件在线分析TATA框、CAAT框、GATA框。为外源基因在褐飞虱细胞内高效表达以及褐飞虱转基因相关研究奠定基础。     

褐飞虱看家基因启动子克隆与序列分析

为获得组成型表达启动子,以褐飞虱的看家基因肌动蛋白(Acting1)与甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)为研究对象,以Genbank上褐飞虱Actin1mRNA序列设计嵌套引物,通过灰飞虱GAPDH mRNA序列搜寻褐飞虱EST数据库中的同源序列设计嵌套引物,并以设计的嵌套引物通过Tail-PCR技术对褐飞虱Actin 1与GAPDH基因ATG前侧翼序列进行扩增。结果表明:通过染色体步移的Tail-PCR技术获得Actin1与GAPDH基因ATG前侧翼序列,长度分别为2 878bp和1 196bp。BDGP数据库与PLACE软件在线分析获得核心启动子序列及TATA框、CAAT框和GATA框元件。     

白背飞虱海藻糖酶Treh-2基因克隆及生物信息学分析

利用同源克隆及RACE方法,从白背飞虱Sogatella furcifera中克隆获得海藻糖酶基因(Treh-2)全长cDNA序列(GenBank登录号:JX204291),该基因全长为2 065 bp,包含73 bp 3,UTR和150 bp5,UTR,开放阅读框(ORF)为1 842 bp,编码613个氨基酸.该基因预测蛋白分子质量为70.45 ku,等电点为5.65,有5个预测糖基化位点,有1个信号肽结构.进化分析结果显示,白背飞虱海藻糖酶Treh-2与其他昆虫海藻糖酶Treh-2同源性较高,与灰飞虱相比,同源性为95％,与褐飞虱相比较,同源性为93％.海藻糖酶Treh-2基因克隆和比较分析为进一步深入研究白背飞虱迁飞能力与能量代谢具有重要意义.     

白背飞虱海藻糖酶Treh-2基因克隆及生物信息学分析

利用同源克隆及RACE方法,从白背飞虱Sogatella furcifera中克隆获得海藻糖酶基因(Treh-2)全长cDNA序列(GenBank登录号:JX204291),该基因全长为2 065 bp,包含73 bp 3,UTR和150 bp5,UTR,开放阅读框(ORF)为1 842 bp,编码613个氨基酸。该基因预测蛋白分子质量为70.45 ku,等电点为5.65,有5个预测糖基化位点,有1个信号肽结构。进化分析结果显示,白背飞虱海藻糖酶Treh-2与其他昆虫海藻糖酶Treh-2同源性较高,与灰飞虱相比,同源性为95%,与褐飞虱相比较,同源性为93%。海藻糖酶Treh-2基因克隆和比较分析为进一步深入研究白背飞虱迁飞能力与能量代谢具有重要意义。     

Q型烟粉虱化学感受蛋白基因BtabCSP1的克隆与分析

【目的】克隆Q型烟粉虱（Bemisia tabaci）化学感受蛋白基因,分析其序列特征和表达特性,为深入研究该类基因功能奠定基础。【方法】根据桃蚜化学感受蛋白OS-D2a（ABM5558）的氨基酸序列,借助生物信息学搜索烟粉虱EST序列拼接了1个烟粉虱化学感受蛋白基因（BtabCSP1）,以烟粉虱mRNA为模板,采用RT-PCR扩增克隆烟粉虱化学感受蛋白cDNA。采用半定量RT-PCR对不同发育阶段的烟粉虱样品中BtabCSP1的表达模式进行研究。【结果】BtabCSP1完整阅读框全长为2 626 bp,包含2个外显子和1个内含子,编码131个氨基酸残基,其中含有1个CX6CX18CX2结构域,为化学感受蛋白的典型特征。BtabCSP1在供试样品中均有表达,并且在2龄、3龄和伪蛹阶段表达量更高。聚类分析结果表明,烟粉虱与果蝇、桃蚜等物种遗传关系较远,化学感受蛋白基因在物种进化过程中较为活跃。【结论】从Q型烟粉虱若虫中克隆了1个化学感受蛋白基因 BtabCSP1,该基因在烟粉虱不同发育阶段中均能表达,推测其对烟粉虱的生长发育具有重要的调控作用。     

两个褐飞虱海藻糖转运蛋白基因的结构及调控海藻糖代谢功能

【目的】海藻糖是昆虫中的主要血糖物质,在昆虫的发育及生理活动中发挥重要功能。其中,海藻糖转运蛋白（Tret）在将海藻糖从其生成组织（例如脂肪体）运输到其消耗组织的过程中起着重要作用。本研究通过分析褐飞虱（Nilaparvata lugens）两条Tret1的序列结构,进一步抑制NlTret1的表达,探讨这两个NlTret1在褐飞虱体内的生物学功能。【方法】以褐飞虱两条Tret1序列为研究对象,利用生物信息学技术分析其蛋白结构以及与其他昆虫之间的同源性。采用RNAi（RNA interference）技术将合成的外源dsRNA（double-stranded RNA）注射到实验室饲养褐飞虱种群体内,抑制其体内NlTret1的表达,分别在注射48 h后取材,抽取总RNA并用反转录试剂盒合成第一链cDNA,采用qRT-PCR（quantitative real-time PCR）技术检测dsNlTret1的干扰效果以及RNAi后褐飞虱体内海藻糖代谢通路中相关基因的表达,最后测定葡萄糖、海藻糖和糖原含量以及海藻糖酶活性。【结果】生物信息学分析表明,NlTret1-like X1和NlTret1-2 X1的开放阅读框长度分别为1 920和1 578 bp,分别编码639和525个氨基酸,预测蛋白分子量分别为69.29和58.71 kD,等电点分别为8.32和8.36;NlTret1-like X1和NlTret1-2 X1的二级结构主要包含螺旋和卷曲;保守结构域分析显示它们均属于MFS家族。进化分析结果显示,不同昆虫的Tret1蛋白具有较高的同源性,且褐飞虱与其他半翅目昆虫具有较近的亲缘关系;与注射dsGFP组相比,注射靶标基因的dsRNA后均能够显著沉默本基因的表达;褐飞虱体内糖原、葡萄糖在注射dsNlTret1-like X1和dsNlTret1-2 X1后,其含量均无显著变化,然而不同于注射dsNlTret1-2 X1组,在注射dsNlTret1-like X1后褐飞虱体内海藻糖含量极显著升高;干扰NlTret1-like X1 48 h后褐飞虱体内TPS1、TPS2、TRE1-1、TRE1-2和TRE2的表达均极显著下调;而干扰NlTret1-2 X1 48 h后褐飞虱体内TPS1、TPS2和TRE1-1的表达虽也极显著下降,但TRE1-2和TRE2极显著上调;在注射dsNlTret1-like X1后,试虫可溶性海藻糖酶和膜结合型海藻糖酶的活性均极显著降低,而在注射dsNlTret1-2 X1后无显著变化。【结论】褐飞虱的两个Tret1在不同组织间发挥着不同的功能,其中NlTret1-like X1在特异性转运海藻糖参与能量供应中起到更为显著的作用。研究结果有助于探索Tret1在昆虫或无脊椎动物中调控海藻糖代谢平衡的调节机制,可为将来通过调控血糖平衡来控制褐飞虱等害虫提供理论依据。     

胡敏酸吸附重金属Cu2+ Pb2+ Cd2+的特征及影响因素

采用碱溶酸沉淀法提取腐殖质中的胡敏酸,研究了胡敏酸对Cu2+Pb2+Cd2+的吸附特征及作用机理.结果表明,在相同初始浓度下,胡敏酸对Cu2+的吸附强度要大于对Pb2+和对Cd2+的吸附.吸附强度顺序为Cu2+＞pb2+＞＞Cd2+.Langmuir、Freundlich和Temkin方程对Pb2+Cd2+的吸附呈显著关系,但其中Freundlich方程为最佳拟合方程;对Cu2+的吸附,Langmuir等温式拟合程度最高,Freundlieh方程其次,Temkin方程则不适合.pH是影响胡敏酸对Cd2+和Cu2+吸附的主要因素,而对Pb2+吸附的影响较小.总体上低pH值均不利于吸附剂对重金属离子的吸附,随着pH值的增加(pH=2～8),不论吸附量还是吸附率都呈上升趋势.通过红外光谱表征反应物,结果表明,胡敏酸与Pb2+Cd2+的结合点主要发生在羧基和酚羟基之间,而Cu2+与胡敏酸的结合除了在羧基和酚羟基之间外,更多地发生在羧基和羧基之间.     

盐酸2-芳基-4-羟乙基-2-吗啉醇的合成及表征

6-甲氧基-2-(2-溴丙酰基)萘、a-溴-3-氯苯丙酮、a-溴-4-苄氧基苯丙酮和a-溴-4-苄氧基苯戊酮分别与二乙醇胺于50℃搅拌反应1h，合成相应的2-(6-甲氧基-2-萘基)-3-甲基-4-羟乙基-2-吗啉醇、2-(3-氯苯基)-3-甲基-4-羟乙基-2-吗啉醇、2-(4-苄氧基苯基)-3-甲基-4-羟乙基-2-吗啉醇、2-(4-苄氧基苯基)-3-丙基-4-羟乙基-2-吗啉醇，2-芳基-4-羟乙基-2-吗啉醇经氯化氢酸化得其盐酸盐，收率58．3％～89．8％．其结构经^1HNMR，^1H-^1H COSY，IR，MS确证．     

Pb~(2+)、Cd~(2+)、Ni~(2+)复合污染对茶树的影响研究

通过正交试验设计研究了溶液培养条件下Pb2+、Cd2+、Ni2+复合污染对茶树生长的影响以及茶树对Pb2+、Cd2+、Ni2+的吸收积累特性。结果表明,复合污染条件下,茶树表现出失水萎蔫、中下部叶片异常脱落和失绿黄化等受害症状。各元素在茶树体内的分布积累规律:Pb表现为吸收根>主根>主茎>枝条>叶片>新梢;Cd表现为主根或吸收根>主茎>新梢>枝条>叶片;Ni则表现为主根或吸收根>主茎>新梢>枝条或叶片。Ni2+、Cd2+在茶树体内的移动性均强于Pb2+。复合污染条件下,某一元素在茶树体内的积累量除受元素本身的性质影响外,还受到该元素的环境浓度、共存元素的性质与浓度的影响,并随茶树体部位不同,其影响顺序和作用结果也不同。     

双氧水对鼻咽癌细胞生长特性的影响及其机制的初步研究

目的:观察H2O2对人低分化鼻咽癌细胞(CNE-2Z)生长、增殖能力的影响,并探讨其可能机制。方法:用M TT及平板克隆形成实验、W estern B lot等检测H2O2诱导CNE-2Z后增殖能力、EGR-1、p53、p16、Cyclin D1的表达。结果:不同浓度H2O2可不同程度地抑制CNE-2Z细胞的生长增殖能力,同一时间点各实验组细胞抑制率相比差异有统计学意义,抑制率与H2O2浓度间表现出明显的剂量-效应关系。平板克隆形成实验的抑制率较M TT更明显。CNE-2Z无EGR-1、p16蛋白表达,可见p53、Cyclin D1蛋白表达;诱导培养后EGR-1、p53、Cyclin D1蛋白表达明显增加。结论:一定浓度的H2O2能抑制CNE-2Z细胞生长,其作用可能与EGR-1及p53蛋白表达增强有关;Egr-1基因在CNE-2Z中具有可诱导性,在肿瘤治疗中有一定的应用前景。     

Cu2+、Zn2+、Pb2+对雨生红球藻生长的影响

以MAV为基本培养基,研究了重金属离子Cu2+、Zn2+、Pb2+对雨生红球藻生长的影响,同时用正交实验研究了各金属的交互作用.结果发现与其它藻相比,雨生红球藻对三种重金属离子尤其是Pb2+的忍耐力较大,促进其生长的适宜Cu2+、Zn2+、Pb2+浓度相对较高,分别为10-3～10-5mg·L-1,10-1～10-3mg·L-1,5～10mg·L-1.正交实验结果表明,三种金属的共同作用可降低对藻的毒性,表现在其最优水平组合(A3B2C4)较单因子实验结果有所提高,分别为Cu2+10-4mg·L-1,Zn2+10-1mg·L-1,Pb2+20mg·L-1.     

白介素2基因与猪圆环病毒2型ORF_2基因真核双表达质粒的构建

应用基因重组技术,构建猪圆环病毒2型ORF2基因与白介素2基因(IL-2) 的真核双表达载体并将其转染CHO细胞,通过RT-PCR、间接ELISA、Western-blot、间接免疫荧光检测(IFA) 等方法验证基因的表达情况.结果表明:成功构建了猪圆环病毒2型ORF2基因和IL-2基凶的真核双表达质粒pIRES-ORF2-IL-2,该质粒可在体外同时表达ORF2和IL-2.     

漂白过程H_2O_2分解及其抑制模拟

应用量气法对 H2 O2 在不同漂白条件下的分解动力学特征进行研究 .分析了影响 H2 O2 分解的各种因素和微观机制     

柑桔皮渣提取液对H2O2的清除作用研究

研究了柚皮、甜橙皮渣、红桔皮的水、70%乙醇、正丁醇、乙酸乙酯提取液对H2O2的清除作用.结果表明: 柚皮、甜橙皮渣、红桔皮的水提液对H2O2具有较强的清除作用,IC50分别相当于2.8 g,12.0 g和4.0 g鲜皮.柚皮70%乙醇提液的IC50为5.0 g..甜橙皮渣、桔皮的乙醇提液,上述皮渣的正丁醇、乙酸乙酯提液均对H2O2基本无清除作用.     

H2CN2和CaCN2对酿酒葡萄萌芽开花及成熟期的影响

试验于2001年10月-2002年8月在攀枝花进行。处理药剂及其浓度为16.7?CN2、0.5%~2.0%H2CN2、0.5%~2.0%H2CN2 1%吐温80;处理时期为12月25日、1月10日、1月25日。最佳处理时间是1月10日;最佳处理组合是1.0%H2CN2 1.0%吐温80,霞多丽、佳美、梅尔诺、黑虎香分别提前萌芽16、13、11、4d;提前成熟17、13、14、6d;提高萌芽率4%、12%、17%、9%;芽眼成枝率提高40%、29%、37%、12%;提高果枝率为9%、8%、28%、4%,提高结果系数7%、7%、37%、3%。不同品种对处理反应有差异,对照黑虎香有药害现象。     

Cu^2＋和Cd^2＋对条斑紫菜丝状体生长和生理的影响

分别用不同浓度的Cu^2＋和Cd^2＋处理条斑紫菜丝状体,测定其叶绿素a含量、过氧化物酶（POD）活性以及可溶性蛋白含量随时问变化的情况。结果表明,随着Cu^2＋和Cd^2＋浓度的增加,除Cu^2＋0．1mg／L浓度组外,其他各浓度组对条斑紫菜丝状体叶绿素a含量、POD活性和可溶性蛋白含量的影响。基本上表现为先上升后下降的时间效应关系,且同一重金属离子浓度越大越早出现下降。