低温β-半乳糖苷酶的分离纯化

[目的]分离纯化低温β-半乳糖苷酶。[方法]采用硫酸铵沉淀、凝胶色谱和离子交换色谱对低温菌株Rahnella aquatilis sp.14-1在摇瓶条件下的所产低温β-半乳糖苷酶进行了纯化,并对提纯的酶进行了酶学性质的研究。[结果]摇瓶发酵液经过超声波破碎细胞得到粗酶液体,用硫酸铵分级沉淀,Sephadex G-25凝胶层析和DEAE-cellulose离子交换色谱分离纯化得到低温β-半乳糖苷酶,用SDSPAGE检测显示电泳单一区带,纯化的酶分子量为60 kD。[结论]研究可为低温β-半乳糖苷酶的开发应用提供参考依据。     

重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的纯化及部分酶学性质研究

[目的]研究重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的性质。[方法]由重组大肠杆菌制备重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶发酵液,经乙醇分级沉淀和DEAE-650M离子交换层析分离纯化后进行SDS-PAGE纯度鉴定,最后分析纯化后重组酶的酶学性质。[结果]SDS-PAGE分析表明纯化后得到了较纯的重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶,比活力达13 437 U/mg,纯化倍数为19.85倍,回收率为20.60%,分子量约30 kDa。纯化后重组酶的最适pH值为6.0,pH值4.5~6.0较稳定;最适温度为50℃,40~50℃较稳定;Cu2+和Fe2+对其活力有显著的抑制作用,Mg2+、Zn2+和Mn2+对其活力有抑制作用,比较适合在啤酒酿造上使用。[结论]该研究为重组β-1,3-1,4-葡聚糖酶的工业化应用奠定了基础。     

2-羟基-4-甲基苯甲酸的合成

选择丙酮为起始原料,与甲酸乙酯进行缩合反应得到第一步反应产物甲酰丙酮;再与乙酰乙酸乙酯缩合合成目标化合物2-羟基-4-甲基苯甲酸.将终产物通过红外光谱、质谱、核磁共振进行检测,综合分析各波谱的检测结果,并与标准图谱进行比较,确定所合成产物为2-羟基-4-甲基苯甲酸.在产物的分离纯化上用pH梯度分离法,简化了合成工艺,得到了较高的产率.     

从发芽咖啡豆中分离纯化α-半乳糖苷酶的研究

[目的]研究从发芽咖啡豆中分离纯化α-半乳糖苷酶。[方法]通过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换色谱和Sephacry1 S-200-HR凝胶过滤色谱等分离纯化技术,从发芽咖啡豆中分离纯化a-半乳糖苷酶。SDS-PAGE用来分析该酶的纯度和分子量。[结果]经过3步分离纯化之后,发芽咖啡豆α-半乳糖苷酶的比酶活达到191.50 nkat/mg,纯化倍数为23.18倍。与绿咖啡豆α-半乳糖苷酶相比,发芽咖啡豆α-半乳糖苷酶的比酶活较高,但产率和总的提取率都较低。SDS-PAGE分析结果表明,该酶出现单一谱带,分子量为3 8805 D。[结论]发芽咖啡豆α-半乳糖苷酶产量和总提取率的提高有待进一步的研究。     

河田鸡与艾维茵肉鸡睾丸N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的特性比较

河田鸡和艾维茵肉鸡的睾丸,经硫酸铵分级沉淀、DEAE-32离子交换柱层析,获得比活力为54.84 U.mg-1,纯化倍数为8.86的河田鸡睾丸N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)制剂.艾维茵肉鸡睾丸NAGase经Sephacry S-300凝胶过滤层析柱进一步纯化,获得比活力为171.50 U.mg-1,纯化倍数为19.8倍的NAGase制剂.以对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-NAG)为底物,研究酶催化底物水解的反应动力学.结果表明:河田鸡和艾维茵肉鸡睾丸NAGase的最适pH分别为5.6、5.7,最适温度分别为55、50℃;NAGase分别在pH为3.0-9.2、4.0-9.2及温度为10-60、10-30℃下能保持稳定;NAGase酶促反应动力学均符合米氏双曲线方程,测得米氏常数(Km)分别为0.223、0.319 mmol.L-1,最大反应速度(Vm)分别为9.438、6.238μmol.L-1.m in-1;NAGase催化pNP-NAG反应的活化能分别为85.74、73.47 kJ.mol-1.     

麻疯树种子β-1,3葡聚糖酶的优化提取及其部分性质分析

用NaCl浓度、pH值和 (NH4)2SO4饱和度三因子优化麻疯树种子中β-1,3葡聚糖酶粗酶的提取条件.结果表明,麻疯树种子在pH 7.0的条件下用含1 mol*L-1 NaCl的5 mmol*L-1磷酸缓冲液和用60 %～80 %饱和度的(NH4)2SO4沉淀后提取得到的β-1,3葡聚糖粗酶总酶活和经纯化的β-1,3葡聚糖酶总酶活均高于所试其它条件,也高于前人的研究约2倍.纯化的β-1,3葡聚糖酶经酶学性质和稳定性测定,其最适作用温度为 40～50 ℃,最适pH为7;在30～55 ℃以及pH 6～8 范围内最稳定.理化性质分析表明,该酶具特有的紫外吸收光谱、荧光光谱和氨基酸组成.通过Western 杂交的方法检测到β-1,3葡聚糖酶仅存在于种子中而在根、茎、叶中未见分布.     

山麻鸭睾丸和肝脏中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分离提取及其性质的比较

山麻鸭的睾丸和肝脏经硫酸铵分级沉淀分离、DEAE-32离子交换柱层析,获得的肝脏N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase,EC3.2.1.52)比活力为85.30 U.mg-1,纯化倍数为10.48.睾丸NAGase再进一步通过Sephacryl S-300凝胶过滤纯化,获得的NAGase比活力为5537.00 U.mg-1,纯化倍数为59.20.睾丸NAGase经聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳,出现单一蛋白带,测定等电点pI为5.05.以对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-NAG)为底物研究酶催化底物水解的反应动力学.结果表明:山麻鸭睾丸和肝脏NAGase的最适pH分别为5.70和5.60,酶在pH为3.00-8.43时较稳定,而pH>8.43时很快失活;酶的最适温度分别为45和60℃,当温度为80℃时酶完全失活.睾丸NAGase在40℃下处理30 min,酶活力保持稳定;而肝脏NAGase在30℃下处理30 min,酶活力保持稳定,酶催化pNP-NAG水解反应遵循米氏方程,睾丸和肝脏NAGase水解pNP-NAG的Km分别为0.17和0.21 mmol.L-1,Vm分别为8.82和7.25μmol.L-1.min-1,活化能分别为57.57和79.47 kJ.mol-1.     

绿豆饮料制备中α-淀粉酶解工艺优化研究

[目的]以绿豆为原料,研究α-淀粉酶对绿豆粉酶解工艺.[方法]以离心沉淀率作为指标,通过对料液比、酶解时间、加酶量进行单因素试验和正交试验设计,测定饮料沉淀率以确定酶解绿豆饮料的最佳工艺参数.[结果]结果表明:料液比1∶11,酶解时间110 min,温度65℃,中温α-淀粉酶添加量200 U,绿豆谷物饮料酶解效果最佳,在该条件下离心沉淀率为29.68％.[结论]酶解后饮料的沉淀率降低,产品口感爽滑,稳定性较好.     

十四碳酸2-硝基苯肼衍生物对照品的制备

为测定柱前衍生HPLC分析脂质中脂肪酸组成的衍生率,制备了十四碳酸2-硝基苯肼衍生物(Myristic acid 2-nitrophenylhydrazine,MANPH)对照品.以吡啶为催化剂,在1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐为偶联剂下,十四碳酸与2-硝基苯肼反应,衍生为十四碳酸2-硝基苯肼衍生物,采用硅胶柱层析和重结晶对衍生产物进行分离纯化,通过质谱和1H-NMR进行结构鉴定,通过薄层色谱检测和HPLC进行纯度检测,结果显示分离纯化获得了MANPH对照品,纯度为99.81%,符合化学对照品的相关要求.     

β-葡萄糖苷酶纯化及酶学性质研究

研究了来源于曲霉No.5.1的β-葡萄糖苷酶的纯化和酶学性质。粗酶液经硫酸铵沉淀、DEAE-chitopearl和Sephadex G-100柱层析得到纯β-葡萄糖苷酶,SDS-PAGE凝胶电泳显示一条带,测得分子量为67.5 kD。该酶最适反应pH6.0,最适反应温度为60℃,在80℃以下、pH3.0~9.0酶活力相对稳定。K 、Na 、Mg2 和Zn2 对酶有激活作用,而Ag 和Fe2 对酶具有明显的抑制作用。该酶对纤维二糖和水杨素的水解能力最强,水解水杨素的Km值为3.09 mmol/L。     

燕麦β-葡聚糖的分离纯化及分子量范围

从燕麦β-葡聚糖的分离、纯化方法和β-葡聚糖的分子量范围的测定方法等方面对国内外燕麦β-葡聚糖的研究进展进行了综述,并且介绍了目前分离纯化过程中研究认为的最佳方法和手段,以期为今后我国燕麦β-葡聚糖的研究工作提供参考.     

牛奶β-酪蛋白和大豆β-伴球蛋白双抗制备及夹心ELISA快速定性检测技术的建立

采用牛奶β-酪蛋白和大豆β-伴球蛋白分别免疫BALB/c小鼠,4次免疫后,通过脾脏细胞杂交瘤技术及间接酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)筛选制备单克隆抗体,同时分别制备兔抗β-酪蛋白和β-伴球蛋白多克隆抗体;通过棋盘滴定法,初步确定单克隆抗体和多克隆抗体的最佳工作浓度,建立双抗夹心ELISA用于乳品掺假以及牛奶、大豆过敏原成分的快速定性检测.结果表明:通过免疫和杂交瘤技术分别获得了抗β-酪蛋白和β-伴球蛋白的单克隆抗体,纯化后2种抗体的效价均达到1∶1×107,通过免疫兔制备的2种多克隆抗体经纯化后效价在1∶2×105左右;所建立的双抗夹心ELISA方法的最低检测限为15ng/mL,与其他物种的蛋白不发生交叉反应,具有良好的特异性.这为建立乳品掺假及过敏原成分快速检测奠定了基础.     

芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶的分离纯化及特性研究

以芽孢杆菌作为试验材料,采用硫酸铵分级沉淀、DEAE-52离子交换层析、Sephadex G-100凝胶过滤方法分离纯化β-葡萄糖苷酶,并测定了其部分酶学性质。结果表明:该酶以水杨酸苷为底物时,最适pH值为7.0,最适温度为50℃,是一种中性酶,具有较好的热稳定性。金属离子对酶活性影响较大,其中Fe2+对酶的激活作用最为明显,而K+对酶有明显的抑制作用。     

Bacillus subtilis LC-9产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶学性质与催化特性研究

[目的]系统研究Bacillus subtilis LC-9所产β-1,3-1,4-葡聚糖酶的酶学性质,探讨其在催化应用上的可行性。[方法]采用两步阴离子交换层析法对B.subtilis LC-9发酵液中的β-1,3-1,4-葡聚糖酶进行纯化,用SDS-PAGE检测其纯度,研究纯酶的酶学性质及该酶对β-葡聚糖和地衣多糖的降解特性,并采用TLC法检测其水解液中糖的成分。[结果]从自行筛选的糖苷酶产生菌B.subtilis LC-9的发酵液中经两步纯化,得到电泳纯的β-1,3-1,4-葡聚糖酶,其比活力达3 502 U/mg,表观分子量为28 kDa;酶的最适反应pH和温度分别为6.5和45℃,且在45℃下稳定;该酶催化地衣多糖的Km值和Vmax分别为4.13 mg/ml和1 238μmol/min/mg,催化大麦β-葡聚糖的Km值和Vmax分别为3.84 mg/ml和1 427μmol/min/mg;该酶降解大麦β-葡聚糖产生寡聚糖,最终产物主要为三糖和四糖,而降解地衣多糖终产物主要为三糖。[结论]从Bacillus subtilis LC-9发酵液中纯化获得了电泳纯的β-1,3-1,4-葡聚糖酶,性质研究表明该酶是专一性的β-1,3-1,4-葡聚糖酶,有望用于啤酒、饲料等领域。     

微波辐射合成2-苯基-1H,1＇H-2＇,5-双苯并咪唑

采用微波辅助,以3,4-二氨基苯甲酸和苯甲醛为原料,合成了2-苯基-1H,1′H-2′,5-双苯并咪唑.探讨了物料比、微波输出功率、微波辐射时间和催化剂PPA与HCl比例对反应产率的影响.结果表明,第1步较佳反应条件为3,4-二氨基苯甲酸∶苯甲醛＝1.0∶1.2,微波输出功率320 W,间歇辐射30 min;第2步较佳反应条件为5-(2-苯基-1H-苯并咪唑)甲酸∶邻苯二胺＝1.0∶1.1,PPA/HCl=1∶1,微波输出功率500 W,间歇辐射15 min.该方法具有原料消耗少、操作简单、反应条件温和、易纯化、对环境无污染、产率高的优点.     

3-乙氧基-4-乙氧羰基苯乙酸的合成研究

[目的]探讨合成3-乙氧基-4-乙氧羰基苯乙酸的方法。[方法]4-甲基水杨酸经溴乙烷烷基化得到2-乙氧基-4-甲基苯甲酸乙酯,再在二异丙胺锂（LDA）,六甲基磷酰胺（HMPA）和CO2共同作用下在苄位进行羧基化得到目标产物。[结果]得到27 g白色粉末状终产物,熔点74～76℃,产率为73%,经1H NMR和MS鉴定为3-乙氧基-4-乙氧羰基苯乙酸。[结论]该合成方法路线较短,操作简单,易于纯化,适合于工业化生产。     

2种阴离子交换柱对α-葡萄糖苷酶的分离纯化效果

【目的】比较Q-Sepharose Fast Flow和DE-52 2种阴离子交换柱对1株脂环酸芽孢杆菌Alicycloba-cillus contaminans发酵产生的α-葡萄糖苷酶的分离纯化效果,为α-葡萄糖苷酶的规模化生产提供技术支持。【方法】采用硫酸铵分级沉淀法对发酵液中的蛋白质进行沉淀,以分离纯化后的蛋白质含量和酶活为指标,对2种阴离子交换柱的分离纯化效果进行评价。【结果】经过Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱分离得到的α-葡萄糖苷酶有1个酶活吸收峰,最大酶活为6.99×103 U,在这个吸收峰内蛋白质的含量稳定在26.25μg/mL左右;经过DE-52阴离子交换层析柱分离,α-葡萄糖苷酶的酶活范围较大,最大酶活为5.56×103 U,在酶活吸收峰内,蛋白质含量为21.25～232.5μg/mL,变化范围较大。【结论】Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱对α-葡萄糖苷酶的分离效果优于DE-52层析柱。     

重组白细胞介素-2高效纯化方法建立

依次通过离子交换法、凝胶过滤法纯化重组白细胞介素-2(IL-2)粗品,利用SDS-PAGE电泳和hIL-2 Elisa kit检测纯化后重组IL-2的纯度和浓度。结果表明,纯化后的重组IL-2纯度和浓度高。本纯化方法简单、稳定、纯化效果好,可为重组IL-2的生产工艺提供技术支持和依据。     

来源于假单胞菌4-硝基酚降解基因簇中的偏苯三酚1,2-双加氧酶基因克隆和功能鉴定

通过富集培养的方法从农药厂废水曝气池的活性污泥中筛选到了一株既具有甲基对硫磷降解活性又可以有效降解4-硝基酚的高效菌株1-7,经16S rDNA鉴定为假单胞菌（Pseudomonas sp.）。根据4-硝基酚降解相关基因保守区设计简并引物扩增小片段,再应用TAIL-PCR克隆得到偏苯三酚1,2-双加氧酶基因dio1,基因全长873 bp,编码290个氨基酸,酶蛋白理论分子量为32.8 kDa。 doi1基因在E. coli BL21中过量表达,并通过Ni-NTA亲和层析纯化,结果表明该酶具有正常的生物学活性,证明了假单胞菌1-7可以通过偏苯三酚途径降解4-硝基酚。初步探讨了假单胞菌1-7的4-硝基酚降解机制。     

药物中间体2-氯-4-氨基吡啶的合成研究

以2-氯吡啶为原料,采用“一锅法”经N-氧化、混酸硝化制得2-氯-4-硝基吡啶-N-氧化物,产率为85.8％;产物进一步还原得到2-氯-4-氨基吡啶,产率为86.7％.通过熔点测试、红外分析、MS、元素分析等手段对合成的化合物表征,结果表明所得的产物结构正确.