灰葡萄孢BcKMO在病菌生长、发育和致病过程中的功能

【目的】明确灰葡萄孢BcKMO在病菌生长、发育和致病过程中的功能,为阐明该基因调控灰葡萄孢生长、发育和致病的分子机理奠定基础,并为灰霉病的防治提供理论依据。【方法】利用生物信息学方法,对BcKMO及其编码产物进行分析。扩增BcKMO的编码区,与pBARKS1-eGFP载体连接,构建基因的表达载体pBARKS1-BcKMO-eGFP;利用PEG介导的原生质体转化方法,转化BcKMO的T-DNA插入突变体BCG183的原生质体;利用PCR、Southern blotting和real-time PCR技术,对所获得转化子进行鉴定;对野生型菌株BC22、突变体BCG183和回复突变体BCG183/BcKMO的表型（菌落形态、菌丝形态、生长速度、产孢量等）和致病力进行分析。【结果】BcKMO编码犬尿氨酸单氧酶（kynurenine 3-monooxygenase,KMO）,含有单氧酶FAD的保守结构域和4个类似芳香环羟化酶（Aromatic-ring hydroxylase-like）的基序,与核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）的Rossmann卷曲NAD(P)(+)-结合蛋白（Rossmann-fold NAD(P)(+)-binding proteins,gi156049701）和从线嘴壳（Ophiostoma piceae）的FAD依赖性氧化还原酶（FAD-dependent oxidoreductase,gi512192943）同源性较高。成功构建了BcKMO的表达载体pBARKS1-BcKMO-eGFP,利用PEG介导的转化方法,转化突变体BCG183的原生质体,获得了草胺膦抗性的转化子;利用PCR、Southern blotting和real-time PCR技术鉴定转化子,获得了BcKMO的回复突变体BCG183/BcKMO。对突变体BCG183和回复突变体BCG183/BcKMO的表型进行了分析,发现BCG183突变体的生长速率减慢,不产生分生孢子和菌核,菌丝纤细;回复突变体和野生型菌株的生长速率、菌丝形态基本一致,均产生分生孢子和菌核。致病力分析发现,BCG183突变体在芸豆叶片和黄瓜叶片上的致病力均较野生型和回复突变体明显增强。【结论】灰葡萄孢BcKMO正调控病菌的生长、发育,负调控病菌的致病力。     

玉米大斑病菌聚酮体合成酶基因 StPKS 功能分析

 【目的】利用RNA干扰技术初步探讨玉米大斑病菌聚酮体合成酶基因（StPKS）的功能。【方法】本试验将玉米大斑病菌StPKS基因片段连接到pSilent-1载体中,构建StPKS基因的RNA干扰载体pSilent-StPKS1-2。通过聚乙二醇介导的方法转入玉米大斑病菌野生型菌株01-23的原生质体,利用潮霉素筛选得到转化子,采用半定量RT-PCR方法分析转化子StPKS基因的表达情况,显微观察转化子与野生型菌丝形态的差异。【结果】本研究构建的StPKS基因RNA干扰载体对沉默该基因表达是有效的,经潮霉素抗性筛选,得到了30株阳性转化子,对其中5株黑色素积累下降、菌落颜色变浅的转化子进行了半定量PCR分析发现,5株转化子的StPKS基因表达量均有所下降;显微观察发现5株转化子的菌丝形态很不规则,发生了膨大、变形、分枝等现象。【结论】StPKS基因在DHN黑色素合成途径中起作用,其表达量下降会减少黑色素的产生,试验同时发现该基因与菌丝形态密切相关。     

棉花黄萎病菌VdHP1的克隆及功能分析

【目的】明确棉花黄萎病菌(大丽轮枝菌Verticillium dahliae)中一个新基因(VdHP1)的功能,为解析棉花黄萎病菌的致病机制以及棉花黄萎病的防治提供依据。【方法】以大丽轮枝菌野生型菌株V592的基因组DNA和cDNA为模板,对VdHP1全长进行克隆并测序;利用逆转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分别对棉花根系诱导不同时间VdHP1的表达量及V592菌株不同组织中VdHP1的表达量进行测定;构建针对VdHP1的敲除载体、互补载体和过表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化筛选VdHP1基因敲除突变体、互补菌株和过表达菌株;以野生型菌株V592为对照,对VdHP1基因敲除突变体及互补菌株的菌落及菌丝形态进行观察,并对微菌核量、产孢量及致病力进行测定;通过RT-qPCR测定其他致病力相关的基因在VdHP1基因敲除突变体及过表达体菌株中的表达情况。【结果】VdHP1全长为862 bp,预测编码蛋白含268个氨基酸,与GenBank中已注释的基因没有任何的序列相似性。野生型菌株V592受棉花根系诱导6—12 h时VdHP1表达水平显著上调,表明VdHP1在大丽轮枝菌侵染早期发挥作用。VdHP1在分生孢子中的表达量显著高于在菌丝和微菌核中的表达量,表明VdHP1在大丽轮枝菌不同组织中的表达具有差异性。与野生型菌株V592相比,VdHP1基因敲除突变体产孢量和产孢梗显著减少,菌丝分支呈螺旋状,对棉花的致病力明显下降。与侵染钉形成相关基因(VdCrz1、VdNoxB、VdPls1)、分泌蛋白释放相关基因(VdSep5)及分生孢子产生相关基因(Vdpf、VdSge1、VGB、VdPLP、VdCYC8、VdNLP1、VdNLP2)在VdHP1基因敲除体中的相对表达量显著下调,在过表达菌株中上调;而与黑色素合成相关基因(VdCmr1、VdSho1、VdLAC、VdPKS1)在VdHP1基因敲除突变体中则显著上调,在过表达菌株中下调。【结论】VdHP1与大丽轮枝菌分生孢子和产孢梗的产生有关,参与大丽轮枝菌致病;VdHP1对与侵染钉形成、分泌蛋白释放及分生孢子产生相关基因的表达具有正调控作用,对黑色素合成相关基因的表达具有负调控作用。     

HIGS-SsCCS转基因拟南芥的菌核病抗性鉴定

【目的】菌核病是由核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)引起的一类真菌病害,核盘菌寄主范围广泛,严重危害多种作物的品质。本研究利用寄主诱导基因沉默(HIGS)的方法在寄主中诱导核盘菌致病相关基因的沉默从而增强寄主的菌核病抗性,为菌核病抗病育种提供新的思路。【方法】铜锌超氧化物歧化酶是一种重要的抗氧化剂,以核盘菌铜锌超氧化物歧化酶铜伴侣基因(copper chaperone for copper/zinc superoxide dismutase,SsCCS)为靶基因,通过生物信息学分析该基因的结构特点,并利用MEGA6.0软件构建系统发育树;通过分别比对拟南芥及核盘菌基因组,选择特异的干扰片段进行扩增;采用农杆菌介导的浸花序法,将HIGS载体转入拟南芥Col-0,通过DNA鉴定以及标记筛选出稳定的HIGS-CCS转基因拟南芥;选取4—5周龄的HIGS-CCS转基因拟南芥植株叶片接种核盘菌野生菌株1980,于接种24 h后统计病斑面积,分析转基因株系的菌核病抗性;通过qRT-PCR分析核盘菌侵染转基因植株过程中SsCCS的表达情况;同时在接种6、12、24 h后利用DAB染色的方法检测转基因植株与核盘菌互作过程中H2O2的积累。【结果】生物信息学分析结果表明,SsCCS(SS1G_00102)全长为1 010 bp,编码序列长759 bp,共编码253个氨基酸,该蛋白分子质量为27 176.96 Da,等电点(PI)为5.04,与灰霉病菌BcCCS(EDN25358)亲缘关系最近,氨基酸同源性达到87%,与拟南芥AtCCS(AT1G12520.1)亲缘关系较远;通过与核盘菌以及拟南芥基因组比对,选择314 bp特异干扰片段,成功构建SsCCS的HIGS表达载体,转化拟南芥。T1及T2代转基因拟南芥接种核盘菌24 h后的病斑面积均小于野生型拟南芥。从T2代中获得3个稳定表达的T3代HIGS-CCS转基因拟南芥株系:HIGS-CCS-5、HIGS-CCS-8、HIGS-CCS-13;与野生型拟南芥相比,转基因拟南芥在接种核盘菌24 h后,病斑面积显著减小46%—61%;qRT-PCR结果显示核盘菌在侵染转基因植株过程中,SsCCS的表达量显著低于侵染野生型拟南芥。DAB染色结果表明,在侵染过程中,转基因拟南芥植株中H2O2的积累明显少于野生型拟南芥,ROS水平降低。【结论】利用HIGS方法在拟南芥中干扰核盘菌SsCCS的表达能够显著提高拟南芥的抗病性,研究结果为油菜等农作物菌核病抗病改良提供了参考。     

咪鲜胺锰盐防治油菜菌核病的潜力研究

【目的】研究比较核盘菌对咪鲜胺锰盐和其余3种杀菌剂的敏感性,探讨咪鲜胺锰盐防治油菜菌核病的潜力,筛选菌核病防治新药剂。【方法】实验室测定不同杀菌剂对核盘菌菌丝生长和菌核萌发的抑制作用及其保护作用和治疗作用,田间评价其防治油菜菌核病的潜力。【结果】核盘菌对杀菌剂咪鲜胺锰盐高度敏感,而对多菌灵、多·酮和菌核·锰锌敏感性稍差。咪鲜胺锰盐抑制核盘菌菌丝生长的抑制中浓度(EC50)为0.02mg·L-1。浓度为20mg·L-1的咪鲜胺锰盐可以延缓核盘菌菌核萌发出菌丝。浓度为0.5g·L-1咪鲜胺锰盐对菌核萌发成子囊盘百分率的抑制率达82.9%。咪鲜胺锰盐对油菜菌核病兼有保护作用和治疗作用,可以抑制核盘菌的侵染以及侵染后病斑的扩展。咪鲜胺锰盐在田间条件下对油菜菌核病的防效达88.1%。【结论】咪鲜胺锰盐是一种很有潜力的油菜菌核病防治药剂。     

苹果树腐烂病菌菌丝蛋白双向电泳体系的建立

【目的】建立苹果树腐烂病菌菌丝蛋白双向电泳体系,鉴定不同致病力材料的差异表达蛋白,为从蛋白质组学角度揭示苹果树腐烂病菌致病机理奠定基础。【方法】以苹果树腐烂病菌野生型03-8菌丝为材料,从蛋白提取方法、IPG胶条长度及胶条的pH范围3个方面对双向电泳体系进行优化,并利用该优化体系对苹果树腐烂病菌野生型03-8和致病力丧失突变体X900的菌丝蛋白进行双向电泳分析和比较,对二者的差异表达蛋白进行鉴定和分析。【结果】采用TCA/丙酮法-SDS/酚蛋白抽提法及17cm pH 4.0~7.0IPG胶条,对苹果树腐烂病菌菌丝蛋白进行双向电泳可以得到理想的蛋白图谱。利用该体系对苹果树腐烂病菌野生型菌株03-8及其致病力丧失突变体菌株X900的菌丝总蛋白进行双向电泳分析发现,2个菌株共存在27个差异表达蛋白点,其中有15个显著差异表达蛋白点;质谱分析结果表明,突变体X900中缺失的2个蛋白点4633和8518分别为丝氨酸苏氨酸蛋白激酶和假想蛋白,其他13个显著差异表达蛋白点分别为1个微管蛋白、1个线粒体内膜转移酶亚基、1个丙酮酸脱羧氧化酶、1个腺苷高半胱氨酸激酶、2个压力诱导的磷蛋白、1个己糖磷酸肌醇激酶、1个热激蛋白和5个假想蛋白。GO分析表明,该差异蛋白主要参与能量代谢、胁迫应答、细胞结构组成和未知功能。【结论】建立了适合苹果树腐烂病菌菌丝蛋白的双向电泳体系,并通过该体系分析获得了不同致病力材料的一系列差异表达蛋白。     

STK1基因对山梨醇高渗胁迫下玉米大斑病菌菌丝生长和发育的调控

【目的】明确STK1基因在山梨醇高渗胁迫条件下对玉米大斑病菌菌丝生长和发育的调控作用。【方法】将野生型菌株(WT)与STK1基因敲除突变体(KO)分别接种在不同山梨醇浓度的葡萄糖-蛋白胨(DPA)培养基上,对比其生长速度、菌落形态、菌丝形态的差异变化;并通过油红O染液进行菌丝细胞脂肪染色,观察脂类物质沉积的形态学变化。【结果】山梨醇高渗胁迫显著抑制了野生型菌株(WT)的菌落生长速度,但1.0 mol/L山梨醇对STK1基因敲除KO菌株的生长有显著的促进作用,这种促进作用随着山梨醇浓度的增加而迅速降低,山梨醇浓度增加至1.5~2.0mol/L时,菌落生长速度受到显著抑制,并且抑制程度显著高于WT菌株。显微观察菌丝细胞内容物,发现山梨醇高渗胁迫后,KO菌株的颗粒状物明显少于WT菌株。利用油红O染色观察菌丝细胞的脂类物质沉积情况,发现在山梨醇高渗胁迫条件下,KO菌株的脂滴数量远远少于WT菌株。【结论】山梨醇胁迫具有与盐胁迫不同的渗透调节机制,STK1基因可能通过调节脂类物质的合成及分布调控对山梨醇高渗透胁迫的调节。     

链格孢菌苹果致病型的ATMT转化体系的建立

【目的】链格孢菌（Alternaria alternate）苹果致病型是苹果上的重要致病菌,可以侵染苹果叶片和果实。论文旨在建立农杆菌介导的链格孢菌苹果致病型高效稳定的分子转化体系,为在分子水平上研究链格孢苹果致病型病菌的致病机制提供技术支持。【方法】质粒pKO1-HPH是以pCAMBIA1300骨架为基础构建的穿梭质粒,含有潮霉素抗性基因,并在其多克隆位点上插入了绿色荧光蛋白基因,这个质粒在大肠杆菌和农杆菌细胞中都能够稳定地复制繁殖。将质粒pKO1-HPH采用冻融法转化到农杆菌菌株AGL1中,然后与链格孢苹果致病型菌株XP-1的分生孢子在诱导培养基上共培养进行基因转化,转化子在含有潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上进行筛选;在含有50 μg·mL^-1潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上检测转化子细胞中抗性基因在转化子中的表达情况;用荧光显微镜检测绿色荧光蛋白基因在转化子细胞中的表达情况。在初步确认可以将绿色荧光蛋白和潮霉素B磷酸转移酶基因转入链格孢苹果致病型菌株中后,对菌落培养时间、转化前分生孢子的预处理方法对转化效率的影响进一步优化。转化子的稳定性采用分生孢子5次继代培养后,能否在含有潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上稳定生长来检测;采用PCR方法检测绿色荧光蛋白外源基因和潮霉素B磷酸转移酶基因是否存在于转化子基因组中;用Southern杂交检测外源基因在转化子基因组中插入的拷贝数;在苹果果实和叶片上接种检测转化子致病性的变化。【结果】将100 μL孢子悬浮液（含10⁵孢子）涂布于马铃薯-胡萝卜-琼脂平板上菌落培养36-48 h后,链格孢苹果致病型菌株XP-1可以产生足量的孢子用于农杆菌介导的分子转化。将分生孢子用无菌水洗下,在4℃处理6 h,再与含质粒pKO1-HPH的农杆菌进行诱导共培养,转化子在含有50 μg·mL^-1潮霉素的马铃薯-葡萄糖-琼脂培养基上进行筛选,转化效率较好,10⁷个分生孢子转化可获得约200个转化子。转化子经过5次继代培养,对潮霉素B的抗性没有改变。特异性引物PCR检测表明外源基因能够成功地整合到供试菌株的基因组中;Southern杂交表明外源基因多以单拷贝形式随机插入到链格孢苹果致病型菌株XP-1细胞的基因组中;转化子的菌丝和分生孢子在荧光显微镜下可以观察到明显的绿色荧光,说明荧光蛋白基因在菌丝及孢子中均能够成功表达。通过部分转化子的致病性试验,筛选获得数个在苹果果实和叶片上致病性都显著降低的菌株。【结论】建立了农杆菌介导的链格孢菌苹果致病型稳定高效的分子转化体系,为进一步开展此病菌与其寄主的分子互作研究打下基础。     

不同地区向日葵核盘菌菌株的多样性研究

对来自我国不同地区的12个核盘菌菌株进行培养特性、菌核萌发及致病力的研究表明:各菌株在生长速度、菌丝扩展方向、菌核排列方式、菌核产量及致病力等方面存在着明显差异,这与各菌株的地理来源有一定的相关性,但亦有差异.来自新疆的12号菌株菌丝呈扇形扩展,生长速度最慢,菌核在培养基上零散分布,致病力最弱,不同于其它所有菌株.来自吉林和云南的菌株生长速度快,致病力强.各菌株的致病力与其生长速度趋于一致.对各菌株转代培养物及菌核后代的培养特性比较结果说明它们的分化特性是稳定的.以ITS1和ITS4为引物对12个菌株的rDNA ITS区进行了PCR扩增,4种限制性内切酶(AluI,HhaⅠ,MspI,HaeⅢ)酶切,结果表明各菌株间的酶切图谱基本相同,在供试的向日葵核盘菌菌株中不存在限制性酶切片段长度多态性.     

水稻纹枯病菌pTHPR1转化子的生物学特性

构建了根癌农杆菌介导的水稻纹枯病菌遗传转化系统,并获得了一批pTHPR1转化子。为明确这些转化子的生物学特性,在转化子库中抽取10个经过验证的转化子,从温度、pH值、碳源、氮源和光照5个方面比较了它们与野生型菌株(GD-118)在生长速度、菌落颜色、菌核颜色和菌核数量的差异。结果表明:在25℃和35℃且pH值为5.0、7.0、8.0时,以葡萄糖和半乳糖为碳源、以甘氨酸为氮源且完全黑暗的条件下培养,转化子与野生型菌株的菌丝生长速度有明显差异,有些转化子菌丝生长速度明显快于野生型菌株,有些转化子菌丝生长速度则明显慢于野生型菌株;在10℃和35℃且pH值为4.0、5.0、6.0时,以葡萄糖为碳源、以硝酸钠和硝酸钾为氮源且完全黑暗的条件下培养,转化子与野生型菌株的菌核数量和颜色均有明显差异。     

灰葡萄孢产孢相关基因BC1G_03293功能的初步研究

据灰葡萄孢菌丝发育和菌核形成时期的RNA-seq数据,挑选出在这2个时期表达量差异较大的基因BC1G__03293进行基因功能的研究。结果发现,BC1G__03293在菌核发育时期表达明显上调,表达量比菌丝生长时期上调了70倍以上。该基因编码的蛋白质含有229个氨基酸,N端包含信号肽,但不含有任何已知保守结构域。通过同源重组的方法得到了BC1G__03293的敲除转化子ΔBC1G__03293-2和ΔBC1G__03293-4,并运用农杆菌转化技术得到了互补转化子ΔBC1G__03293-2-C2和ΔBC1G__03293-2-C3。BC1G__03293基因敲除后生长、致病及菌核形成等表型无明显变化,但敲除转化子的分生孢子产量显著下降,仅为野生型菌株B05.10分生孢子产量的45%,并且BC1G__03293基因互补可使敲除转化子的产孢量得到明显恢复。结果说明BC1G__03293基因与灰葡萄孢的分生孢子形成相关。     

油菜菌核病菌秋季与春季萌发菌株生物学特性的比较

通过室内和田间试验,观察并比较采自湖北省咸宁市核盘菌秋季萌发菌株与春季萌发菌株的生物学特性。结果表明:9个秋季萌发菌株(aSs-1至aSs-9)和9个春季萌发菌株(sSs-1至sSs-9)在菌丝生长速率、菌核产量、菌核大小和对油菜的致病力等方面均无显著差异(P0.05);室内和田间菌核的萌发均受菌核形成温度和诱导菌核萌发温度的影响,高温形成的菌核易于萌发;核盘菌秋季萌发菌株和春季萌发菌株在菌核萌发特性方面存在明显差异。     

蛋白激酶A催化亚基VdPKAC1对菌丝型大丽轮枝菌V07DF2培养性状及致病力的调控

【目的】通过同源重组敲除技术,解析菌丝型大丽轮枝菌中蛋白激酶A催化亚基基因VdPKAC1在调控微菌核发育、产孢及其致病力方面的作用。【方法】利用Invitrogen公司的Gateway®技术构建VdPKAC1的同源重组敲除质粒。该质粒的潮霉素抗性基因盒两端分别为靶标基因5′和3′端各1 kb的DNA序列。通过农杆菌AGL-1的介导,将该质粒的T-DNA区域整合到来源于棉花的菌丝型大丽轮枝菌V07DF2菌株中。从6个随机选择的含有潮霉素抗性基因片段的转化子中,通过靶标基因的PCR检测,获得了5个VdPKAC1基因敲除突变体。经过Southern杂交检测,选择了3个敲除突变体材料（2B5、C5和HH2）进行突变表型的观察和分析。在液体PDB培养7 d后观察敲除突变体与野生型菌株的黑色素产生情况;在固体PDA培养28 d后,观察敲除突变体与野生菌株的菌丝生长和休眠结构形成情况。此外,利用棉花根提取物对液体Cazpek-Dox培养7 d的各菌株分别进行诱导处理,在处理24、72 h后分别统计分生孢子数量,以此对敲除突变体和野生菌株的分生孢子产生能力进行评估。最后,将孢子浓度为1×107个/mL的突变体和野生菌株的分生孢子液灌根接种2叶期的棉花,测定其致病力。【结果】Southern杂交结果表明,在上述5个敲除突变体中,只有2B5和C5两个菌株为T-DNA单拷贝插入,而其他菌株均存在T-DNA异位整合的情况。在PDA培养条件下,3个敲除突变体（2B5、C5和HH2）与野生型相比具有黑色素合成增加,气生菌丝更加发达的特点。其中,敲除突变体2B5和C5在平板培养条件下还形成了野生型菌株没有的、与典型微菌核形态不同的深褐色“链状休眠菌丝体结构”。在棉花根提取物的诱导处理下,3个敲除突变体产生的分生孢子数量少于野生型菌株。另外,致病力分析结果表明,敲除突变体材料仍然具有一定的致病力,但却显著弱于野生菌株V07DF2。【结论】在大丽轮枝菌中,通过蛋白激酶A介导的环腺苷酸信号途径控制多种重要性状,而VdPKAC1是这一途径中的重要成员。以前的报道证实,VdPKAC1负调控微菌核的数量,而本研究利用菌丝型菌株V07DF2在PDA培养基上不产生微菌核的这一特性,通过同源重组原理敲除该负调控基因,成功获得可以在PDA上产生休眠结构的菌丝型大丽轮枝菌菌株的突变体。这些突变体材料将为大丽轮枝菌微菌核发育信号途径及其调控基因的发掘提供平台和基础。     

利用绿色荧光蛋白报告基因标记研究麦根腐平脐孺孢对小麦根和叶片的侵染

【目的】利用绿色荧光蛋白标记研究麦根腐平脐孺孢（Bipolaris sorokiniana,引起小麦根腐病和叶枯病）对小麦根系和叶片的侵染过程,建立直观、非破坏性研究病原菌-植物互作的体系。【方法】采用农杆菌介导法将gfp导入麦根腐平脐孺孢菌株Bs-1中,对转化子进行荧光表达、PCR验证、遗传稳定性、生长特性和胞外酶代谢分析。选用与野生型菌株表现相近的转化子Bs-GFP研究麦根腐平脐孺孢对小麦品种矮抗58根和叶片的侵染过程。【结果】转化子Bs-GFP的菌丝和分生孢子表达明亮的绿色荧光,利用基因特异标记扩增证明gfp被整合到真菌的基因组中。对GFP标记菌株Bs-GFP的遗传稳定性和生长特性分析表明,gfp在转化子中能稳定地遗传,菌落的生长速度和胞外酶代谢与野生型菌株相比没有显著差异。菌株Bs-GFP可以在小麦的地下和地上部分引起病症,而且与野生型菌株Bs-1在小麦植株根系和茎基部组织定殖的数量（即CFU值）相近。【结论】利用农杆菌介导方法获得表达绿色荧光的麦根腐平脐孺孢菌株可以直观地观察病原菌对寄主的侵染过程,研究结果有助于更好地解析麦根腐平脐孺孢与小麦以及其它禾谷类寄主之间的互作。     

棉花黄萎病菌VdHP1的克隆及功能分析

【目的】明确棉花黄萎病菌（大丽轮枝菌Verticillium dahliae）中一个新基因（VdHP1）的功能,为解析棉花黄萎病菌的致病机制以及棉花黄萎病的防治提供依据。【方法】以大丽轮枝菌野生型菌株V592的基因组DNA和cDNA为模板,对VdHP1全长进行克隆并测序;利用逆转录实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分别对棉花根系诱导不同时间VdHP1的表达量及V592菌株不同组织中VdHP1的表达量进行测定;构建针对VdHP1的敲除载体、互补载体和过表达载体,通过农杆菌介导的遗传转化筛选VdHP1基因敲除突变体、互补菌株和过表达菌株;以野生型菌株V592为对照,对VdHP1基因敲除突变体及互补菌株的菌落及菌丝形态进行观察,并对微菌核量、产孢量及致病力进行测定;通过RT-qPCR测定其他致病力相关的基因在VdHP1基因敲除突变体及过表达体菌株中的表达情况。【结果】VdHP1全长为862bp,预测编码蛋白含268个氨基酸,与GenBank中已注释的基因没有任何的序列相似性。野生型菌株V592受棉花根系诱导6—12 h时VdHP1表达水平显著上调,表明VdHP1在大丽轮枝菌侵染早期发挥作用。VdHP1在分生孢子中的表达量显著高于在菌丝和微菌核中的表达量,表明VdHP1在大丽轮枝菌不同组织中的表达具有差异性。与野生型菌株V592相比,VdHP1基因敲除突变体产孢量和产孢梗显著减少,菌丝分支呈螺旋状,对棉花的致病力明显下降。与侵染钉形成相关基因（VdCrz1、VdNoxB、VdPls1）、分泌蛋白释放相关基因（VdSep5）及分生孢子产生相关基因（Vdpf、VdSge1、VGB、VdPLP、VdCYC8、VdNLP1、VdNLP2）在VdHP1基因敲除体中的相对表达量显著下调,在过表达菌株中上调;而与黑色素合成相关基因（VdCmr1、VdSho1、VdLAC、VdPKS1）在VdHP1基因敲除突变体中则显著上调,在过表达菌株中下调。【结论】VdHP1与大丽轮枝菌分生孢子和产孢梗的产生有关,参与大丽轮枝菌致病;VdHP1对与侵染钉形成、分泌蛋白释放及分生孢子产生相关基因的表达具有正调控作用,对黑色素合成相关基因的表达具有负调控作用。     

斜卧青霉转录调控蛋白Hac1过表达菌株的构建

【目的】以增强型绿色荧光蛋白为报告基因,构建斜卧青霉转录调控蛋白Hac1激活形式基因(Hac1i)随机插入过表达菌株和非激活形式基因(Hac1u)原位插入过表达菌株,并初步观察Hac1基因的2种不同编码蛋白在菌丝内部的运动情况,为进一步研究转录调控蛋白Hac1的功能奠定基础。【方法】分别克隆ptrA筛选标记、gpdA启动子、Hac1i编码区、eGFP编码区及终止子,利用融合PCR融合克隆片段,构建Hac1i随机插入表达盒;再分别克隆Hac1上游臂及编码区、eGFP编码区及终止子、ptrA筛选标记、Hac1下游臂序列,融合克隆片段,构建Hac1u原位插入表达盒。将2种表达盒分别转化斜卧青霉原生质体,通过吡啶硫胺素筛选标记、PCR扩增等检测获得阳性转化子,荧光显微镜观察融合蛋白的表达及运动情况。【结果】成功构建了Hac1i基因随机插入表达盒和Hac1u基因原位插入表达盒,利用原生质体转化将2种表达盒转入宿主斜卧青霉菌株,经PCR初步验证,得到了阳性转化子。阳性转化子在麸皮培养基上培养2~4d后,可在菌丝内部清晰观察到强烈的绿色荧光信号,表明融合蛋白在菌丝体内得到了正确表达。【结论】成功构建了Hac1i基因随机插入和Hac1u基因原位插入菌株。     

不同交配型拟轮枝镰孢菌荧光蛋白标记菌株的构建

【目的】构建不同交配型的拟轮枝镰孢菌(Fusarium verticillioides)荧光蛋白标记菌株,为研究拟轮枝镰孢菌的侵染、定殖、有性生殖等提供基础材料。【方法】通过聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)介导的原生质体转化法分别将荧光蛋白基因eGFP和mCherry导入不同交配型的拟轮枝镰孢菌FvLNF15-11和FvSHF19-37菌株,并比较荧光标记菌株与野生型菌株间的生长特性、有性生殖和致病力差异。【结果】经PCR检测获得了带有荧光标记的菌株,激光共聚焦显微镜观察表明eGFP基因和m Cherry基因分别在FvLNF15-11和FvSHF19-37菌株的分生孢子和菌丝中成功表达。与野生型菌株相比,荧光标记菌株的生长发育、子囊壳形成和致病力均无明显差异。【结论】构建了拟轮枝镰孢菌不同交配型eGFP和m Cherry荧光标记菌株,不仅为研究拟轮枝镰孢菌在寄主体内的侵染、定殖等提供了材料,也为研究该菌的有性生殖过程积累了基础。     

HIGS-SsCCS转基因拟南芥的菌核病抗性鉴定

【目的】菌核病是由核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）引起的一类真菌病害,核盘菌寄主范围广泛,严重危害多种作物的品质。本研究利用寄主诱导基因沉默（HIGS）的方法在寄主中诱导核盘菌致病相关基因的沉默从而增强寄主的菌核病抗性,为菌核病抗病育种提供新的思路。【方法】铜锌超氧化物歧化酶是一种重要的抗氧化剂,以核盘菌铜锌超氧化物歧化酶铜伴侣基因（copper chaperone for copper/zinc superoxide dismutase,SsCCS）为靶基因,通过生物信息学分析该基因的结构特点,并利用MEGA6.0软件构建系统发育树;通过分别比对拟南芥及核盘菌基因组,选择特异的干扰片段进行扩增;采用农杆菌介导的浸花序法,将HIGS载体转入拟南芥Col-0,通过DNA鉴定以及标记筛选出稳定的HIGS-CCS转基因拟南芥;选取4—5周龄的HIGS-CCS转基因拟南芥植株叶片接种核盘菌野生菌株1980,于接种24 h后统计病斑面积,分析转基因株系的菌核病抗性;通过qRT-PCR分析核盘菌侵染转基因植株过程中SsCCS的表达情况;同时在接种6、12、24 h后利用DAB染色的方法检测转基因植株与核盘菌互作过程中H₂O₂的积累。【结果】生物信息学分析结果表明,SsCCS（SS1G_00102）全长为1 010 bp,编码序列长759 bp,共编码253个氨基酸,该蛋白分子质量为27 176.96 Da,等电点（PI）为5.04,与灰霉病菌BcCCS（EDN25358）亲缘关系最近,氨基酸同源性达到87%,与拟南芥AtCCS（AT1G12520.1）亲缘关系较远;通过与核盘菌以及拟南芥基因组比对,选择314 bp特异干扰片段,成功构建SsCCS的HIGS表达载体,转化拟南芥。T₁及T₂代转基因拟南芥接种核盘菌24 h后的病斑面积均小于野生型拟南芥。从T₂代中获得3个稳定表达的T₃代HIGS-CCS转基因拟南芥株系：HIGS-CCS-5、HIGS-CCS-8、HIGS-CCS-13;与野生型拟南芥相比,转基因拟南芥在接种核盘菌24 h后,病斑面积显著减小46%—61%;qRT-PCR结果显示核盘菌在侵染转基因植株过程中,SsCCS的表达量显著低于侵染野生型拟南芥。DAB染色结果表明,在侵染过程中,转基因拟南芥植株中H₂O₂的积累明显少于野生型拟南芥,ROS水平降低。【结论】利用HIGS方法在拟南芥中干扰核盘菌SsCCS的表达能够显著提高拟南芥的抗病性,研究结果为油菜等农作物菌核病抗病改良提供了参考。     

马铃薯StSUT2基因在烟草中过表达提高其耐盐性

【目的】为明确马铃薯蔗糖转运蛋白(SUT2)对盐胁迫的响应,本研究对StSUT2的功能进行初探。【方法】通过同源克隆技术得到马铃薯StSUT2基因并进行生物信息学分析,使用荧光定量PCR技术检测马铃薯青薯9号不同器官中SUT2基因在盐胁迫下表达量的变化,随即构建表达载体并遗传转化烟草,测定转基因烟草在盐胁迫下脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量的变化。【结果】①马铃薯StSUT2基因CDS长度为1818 bp,编码605个氨基酸;系统进化树分析表明,马铃薯StSUT2与番茄亲缘关系最近。②马铃薯StSUT2基因可被盐胁迫诱导,其中根、茎中的表达量在胁迫8 h最大,而叶中的表达量在4 h最大。③构建表达载体pJAM1502-StSUT2并转化烟草,经PCR和qRT-PCR鉴定,获得6株转基因植株,并选取表达量最高者进行后续实验。④盐胁迫下测定野生型与过表达植株中脯氨酸、可溶性蛋白以及可溶性糖含量发现,过表达植株中脯氨酸、可溶性蛋白以及可溶性糖含量均高于野生型。【结论】StSUT2可能会通过提高渗透性物质含量来增强植物的耐盐性。     

核盘菌和三叶草核盘菌的生态特性与致病性比较

在调查核盘菌和三叶草核盘菌发生为害的基础上，以核盘菌菌株Ｒａｐ－１和三叶草核盘菌菌株ＣＭＶ－２为代表，比较了温度及降雨等因子对菌丝生长及菌核萌发的影响。在１５￣２８℃下Ｒａｐ－１菌丝生长较ＣＭＶ－２快，但在８℃下则相反；Ｒａｐ－１菌核在自然条件下萌发期间的温度较ＣＭＶ－２菌核萌发时温度高，两者菌核萌发呈现出明显的先后秩序。春季降雨的波动导致２种核盘菌的菌核萌发出现波动。离体致病性测定结果表明，核盘