苹果树腐烂病菌染色质重塑因子Vmles4的功能研究

染色质重塑因子INO80是一类由多亚基构成的遗传学调控因子，调控多种DNA代谢，在基因的表达中发挥着重要的调控功能。但其在苹果树腐烂病菌（Valsa mali）中是否存在及其生物学功能并不清楚，为此，本研究从病菌基因组中分析鉴定到INO80的一个亚基基因Vmles4，利用qRT-PCR技术分析了Vmles4在病菌侵染过程中的表达模式，利用Double-joint PCR技术和PEG介导的原生质体转化方法进行了基因敲除，然后对3个突变体的营养生长及致病力进行测定和分析，并对病菌的非核糖体肽合成酶基因VmNRPS12及VmNRPS14在突变体中的表达进行定量分析。结果表明：Vmles4在侵染初期的表达显著上调，接种后6 h上调表达6.2倍。敲除突变体的生长速率平均降低28%且菌丝生长稀疏，在富士苹果品种（Malus domestic cv. Fuji）叶片和枝条上的致病力分别降低到22.5%和27.5%，VmNRPS12及VmNRPS14基因在Vmles4突变体侵染苹果枝条24 h后的表达量分别下调86.5%和50%；综上所述，Vmles4正调控腐烂病菌的营养生长、致病力以及次级代谢合成酶基因VmNRPS12和VmNRPS14的表达。     

苹果树腐烂病菌菌丝蛋白双向电泳体系的建立

【目的】建立苹果树腐烂病菌菌丝蛋白双向电泳体系,鉴定不同致病力材料的差异表达蛋白,为从蛋白质组学角度揭示苹果树腐烂病菌致病机理奠定基础。【方法】以苹果树腐烂病菌野生型03-8菌丝为材料,从蛋白提取方法、IPG胶条长度及胶条的pH范围3个方面对双向电泳体系进行优化,并利用该优化体系对苹果树腐烂病菌野生型03-8和致病力丧失突变体X900的菌丝蛋白进行双向电泳分析和比较,对二者的差异表达蛋白进行鉴定和分析。【结果】采用TCA/丙酮法-SDS/酚蛋白抽提法及17cm pH 4.0~7.0IPG胶条,对苹果树腐烂病菌菌丝蛋白进行双向电泳可以得到理想的蛋白图谱。利用该体系对苹果树腐烂病菌野生型菌株03-8及其致病力丧失突变体菌株X900的菌丝总蛋白进行双向电泳分析发现,2个菌株共存在27个差异表达蛋白点,其中有15个显著差异表达蛋白点;质谱分析结果表明,突变体X900中缺失的2个蛋白点4633和8518分别为丝氨酸苏氨酸蛋白激酶和假想蛋白,其他13个显著差异表达蛋白点分别为1个微管蛋白、1个线粒体内膜转移酶亚基、1个丙酮酸脱羧氧化酶、1个腺苷高半胱氨酸激酶、2个压力诱导的磷蛋白、1个己糖磷酸肌醇激酶、1个热激蛋白和5个假想蛋白。GO分析表明,该差异蛋白主要参与能量代谢、胁迫应答、细胞结构组成和未知功能。【结论】建立了适合苹果树腐烂病菌菌丝蛋白的双向电泳体系,并通过该体系分析获得了不同致病力材料的一系列差异表达蛋白。