盾壳霉菌株Chy-1抗真菌物质的基本特性研究

为了明确重寄生真菌盾壳霉Coniothyrium minitans产生的抗真菌物质(antifungal substances,简称AFS)的基本特性,本文从盾壳霉MCD培养物滤液的抑菌谱、热稳定性、酸碱稳定性及紫外线照射稳定性4个方面展开研究。研究结果表明,盾壳霉AFS对核盘菌Sclerotinia sclerotiorum、三叶草核盘菌S.trifoliorum、小核盘菌S.minior等10种真菌菌丝生长具有较强的抑制作用。AFS具有较强的热稳定性,盾壳霉MCD培养物滤液经120℃处理30 min后,对核盘菌仍具有抑菌活性(抑菌率为49.5%)。不同环境pH对AFS的抑菌活性具有不同的影响,pH值为7,AFS对核盘菌菌丝生长抑制活性最强。此外,环境pH也影响AFS的稳定性,在较宽的pH值范围内(1~14),尤其是在酸性条件下(pH 1~6),AFS活性稳定(抑菌率为81.1%~76.4%);AFS对紫外线照射具有一定的稳定性。盾壳霉抗真菌物质对外界环境具有很好的稳定性,这对于应用盾壳霉的抗真菌物质来防治油菜菌核病是非常有利的。     

草莓褐斑病的病原鉴定及其生物学特性观察

采用柯赫氏法和ITS DNA序列分析对草莓褐斑病的病原进行确认和鉴定。结果表明:草莓褐斑病病原在病叶及PDA培养基上均可产生分生孢子器及分生孢子;分生孢子器球形、黑色,分生孢子梗瓶梗状,具分枝;分生孢子卵圆形至纺锤形、透明、单细胞,大小为(5.7～7.3)mm×(2.0～3.0)mm;根据病菌形态,确定该病原菌为昏暗拟茎点霉Phomopsis obscurans(Ellis Everh.)B.Sutton。生物学特性观察结果表明:该病原菌菌丝生长和产孢的最适温度为25～30℃,生长和产孢最适pH值为6,光照对菌丝生长和产孢均有促进作用。     

灰葡萄孢产孢相关基因BC1G_03293功能的初步研究

据灰葡萄孢菌丝发育和菌核形成时期的RNA-seq数据,挑选出在这2个时期表达量差异较大的基因BC1G__03293进行基因功能的研究。结果发现,BC1G__03293在菌核发育时期表达明显上调,表达量比菌丝生长时期上调了70倍以上。该基因编码的蛋白质含有229个氨基酸,N端包含信号肽,但不含有任何已知保守结构域。通过同源重组的方法得到了BC1G__03293的敲除转化子ΔBC1G__03293-2和ΔBC1G__03293-4,并运用农杆菌转化技术得到了互补转化子ΔBC1G__03293-2-C2和ΔBC1G__03293-2-C3。BC1G__03293基因敲除后生长、致病及菌核形成等表型无明显变化,但敲除转化子的分生孢子产量显著下降,仅为野生型菌株B05.10分生孢子产量的45%,并且BC1G__03293基因互补可使敲除转化子的产孢量得到明显恢复。结果说明BC1G__03293基因与灰葡萄孢的分生孢子形成相关。     

从盾壳霉中克隆耐碱相关的基因Ⅰ——突变体的筛选

试验主要是从盾壳霉中克隆耐碱柑关基因，找到耐碱突变体，了解盾壳霉耐碱功能基因。采用基因标签法生成众多突变体，然后在预先确定好的一定碱性pH值PDA培养基上筛选功能基因缺失或不能正常表达的突变体，对于获得的突变体提取DNA，利用Tail—PCR技术扩增目的片段，利用获得的阳性克隆片段为探针．采用同位素示踪法分离目的基因。     

栀子叶斑病及其病原的鉴定

首次报道在栀子(Gardenia jasminoides)上存在由拟盘多毛孢属真菌引致的叶斑病。从湖北省长阳县采集到栀子叶斑病病害标本,并利用柯赫氏法则证实该病由真菌GJ-1菌株所引致;根据GJ-1菌株的形态学特征和ITS序列的分析、比较,证实GJ-1菌株属于拟盘多毛孢属(PestalotiopsisSteyaert)真菌;GJ-1菌株的ITS序列与P.gracilis的ITS同源性达100%,因此推定它属于P.gracilis。     

利用油菜秸秆培养重寄生菌盾壳霉分生孢子

研究了油菜秸秆作为基质培养植物病原菌核盘菌的重寄生菌盾壳霉分生孢子,并从盾壳霉分生孢子萌发及其抑制核盘菌菌核子囊盘萌发等方面评价了所获得的盾壳霉分生孢子的质量。结果表明:盾壳霉野生菌株Chy-1和Zs-1,以及Chy-1的突变菌株SV-5-2(抗杀菌剂vin-clozolin)可以利用油菜秸秆为基质进行培养,有利于3个菌株的菌丝生长、分生孢子器及分生孢子的产生,分生孢子产量可达2·4×109~3·4×109个孢子/g干秸秆。水分含量和发酵时间影响盾壳霉分生孢子产量。在接种量为5×105个孢子/g干秸秆的条件下,以干秸秆中含水量为3~6ml/g,在20℃下发酵12d较为适宜。水琼脂平板试验表明:在20℃下培养48h,盾壳霉分生孢子的萌发率达到90%以上。将油菜秸秆基质培养的盾壳霉分生孢子接种于土壤中,无论是夏季试验,还是秋季试验,对核盘菌菌核萌发及存活具有显著的抑制作用。2003年夏季,4·0×106个孢子/m处理其核盘菌菌核萌发数比对照减少26·3%;秋季该处理比对照减少57·1%~88·0%。     

草酸对重寄生真菌盾壳霉分生孢子萌发和菌丝生长的影响

 本文研究了草酸对核盘菌的重寄生真菌盾壳霉(Coniothyrium minitans)分生孢子萌发和菌丝生长的影响。结果表明:草酸对盾壳霉分生孢子萌发没有明显促进作用,在酸碱性非缓冲基质(水琼脂)和酸碱性缓冲基质中,抑制盾壳霉分生孢子萌发的最低浓度分别为150和700μg/mL。在马铃薯葡萄糖琼脂培养基中,当草酸浓度为100~2000μg/mL时,盾壳霉菌丝能够生长,且浓度为300~500μg/mL的草酸对盾壳霉的菌丝生长具有明显的促进作用。在以草酸为唯一碳源的合成培养基中,在酸碱性非缓冲的条件下,当草酸浓度为100~2000μg/mL时,盾壳霉菌丝能够生长,且草酸浓度为500μg/mL时对盾壳霉菌丝生长具有促进作用,而当草酸浓度为2500μg/mL时,盾壳霉菌丝则停止生长。在酸碱性缓冲的合成基质中,草酸浓度为100~4000μg/mL时,盾壳霉菌丝能够生长,且草酸浓度为1500~2500μg/mL时对盾壳霉菌丝生长具有促进作用。在含草酸钙的混浊培养基(以草酸为唯一碳源)上,盾壳霉菌落区域形成了透明圈。上述结果说明盾壳霉能忍耐一定浓度的草酸而进行分生孢子萌发及菌丝生长,且这种真菌可能对草酸分子具有分解作用。     

盾壳霉控制油菜菌核病菌再侵染及其叶面存活动态的研究

 本文评估了施于油菜(Brassica napus)叶片上的盾壳霉(Coniothyrium minitans)控制油菜菌核病菌再侵染能力,探讨了其作用机理,并测定了盾壳霉分生孢子在油菜叶面上的存活动态。结果如下:叶面上的盾壳霉对油菜菌核病菌的初侵染影响较小,但在高剂量(> 10⁶孢子/ml)时可以控制病斑的扩展。所有供试剂量的盾壳霉均可不同程度地控制再侵染。盾壳霉分生孢子可在叶面病部迅速萌发,48 h和72 h时孢子萌发率分别为51%和95%,而在健康叶面上6 d未能检测到萌发的孢子。自携带盾壳霉的叶面病部不能分离到核盘菌,表明叶面上的盾壳霉已寄生并破坏了核盘菌再侵染菌丝。自油菜叶面上分离到的盾壳霉菌落数随时间延长而降低,但其分生孢子至少可以在叶面上存活28 d。这即表明,在叶面上适时适量地添加盾壳霉可以控制油菜菌核病的为害。     

利用原生质体再生恢复核盘菌菌株Ep—1PN毒性的研究

分析了６９个随机挑选的核盘菌弱毒菌株Ｅｐ－１ＰＮ原生质体再生后代的生长速度、菌 落形态和毒性。结果表明：其中的３５个再生后代在ＰＤＡ平板上均匀扩展,形成典型的核盘菌菌落,生长速度大于１８ｍｍ／ｄ。在离体莴苣杆上,这些后代的培养物引起较大的病斑。当它们同亲合性菌株Ｅｐ－１ＰＮＡ１８３在ＰＤＡ平板上接触时没有发现Ｅｐ－１ＰＮＡ１８３菌落发生异常变化,说明这些后代已失去了Ｅｐ－１ＰＮ的弱毒因子,恢复了正