奶牛乳腺炎源大肠杆菌中耶尔森菌强毒力岛相关基因的检测及序列分析

【目的】研究奶牛乳腺炎源大肠杆菌中耶尔森菌HPI携带情况及其与O血清型的关系,并对部分菌株的相关基因序列进行分析。【方法】从中国北京、内蒙古、甘肃、四川、重庆、云南、贵州等7个省市部分地区1 260份临床型和隐性奶牛乳腺炎奶样中分离得到190株大肠杆菌,对分离菌株进行耶尔森菌强毒力岛核心区irp2基因、fyuA基因及HPI毒力岛在大肠杆菌染色体中插入位置的鉴定,分析HPI毒力岛的携带情况及其与分离菌株O血清型之间的关系。【结果】190株大肠杆菌分离株中,irp2基因阳性率为26.31%（50/190）,fyuA基因阳性率为18.94%（36/190）。50株HPI+分离株中检出asn_tRNA_intB 基因32株,阳性率为64%（32/50）。本试验克隆的irp2基因(273 bp）、fyuA基因(1 071 bp）、asn_tRNA_intB基因(1 512 bp）均与已发表序列高度同源,同源性分别在97.1%、98.2%、97.2%以上,且其HPI毒力岛大多位于大肠杆菌染色体的asn_tRNA位点上。【结论】耶尔森菌HPI在奶牛乳腺炎源大肠杆菌中广泛流行分布,但也存在差异,而不同血清型菌株携带HPI的倾向性可能只与特定的血清型有一定的关系。     

金黄色葡萄球菌粘附素Fnbp A功能区基因的克隆和原核表达

【目的】克隆和表达奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌纤连蛋白连接蛋白A(Fnbp A)的功能基因。【方法】采集奶牛急性乳腺炎乳样,分离金黄色葡萄球菌,提取其DNA作为模板,利用设计合成的特异性引物,对金黄色葡萄球菌进行FnbpA功能基因的PCR扩增。回收目的基因并连接到T载体,鉴定后进行测序,然后将FnbpA基因连接到pET-32a(+)质粒中,经鉴定后转化大肠杆菌BL21感受态细胞,IPTG诱导后采用SDS-PAGE分析蛋白质的表达情况。【结果】PCR产物经电泳成像,仅金黄色葡萄球菌在1.7 kb处出现特异性条带,测序发现其与GenBank公布的FnbpA序列的同源性为98%;蛋白诱导表达SDS-PAGE分析发现,在80 ku处出现特异性条带。【结论】试验成功地克隆到FnbpA基因,并在大肠杆菌中获得高效表达,蛋白量为33.4%,为进一步研究金黄色葡萄球菌粘附素基因工程疫苗奠定了基础。     

生牛乳中高黏液型肺炎克雷伯菌耐药、毒力及生物被膜形成能力分析

【目的】评估分离自生牛乳及其环境中高黏液型肺炎克雷伯菌(hypermucoviscous Klebsiella pneumoniae,hmKP)的生物被膜形成能力及耐药毒力风险,对其可能引起的潜在风险提出警示,进而为肺炎克雷伯菌(KP)的科学防治提供理论参考。【方法】采用药敏纸片法鉴定32株hmKP产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)表型,以半定量结晶紫法检测其生物被膜形成能力,并通过PCR对hmKP携带的耐药基因和毒力基因进行检测分析。【结果】从32株hmKP中共鉴定出ESBLs阴性菌株(non-ESBLs-KP)24株(占75.00%)、ESBLs阳性菌株(ESBLs-KP)8株(占25.00%),均可形成生物被膜,其中,10株具有强生物被膜形成能力,17株具有中等生物被膜形成能力,5株表现为弱生物被膜形成能力。在10株具有强生物被膜形成能力的hm KP中有7株来自生牛乳样本,且ESBLs-KP中具有强生物被膜形成能力的菌株检出率(37.50%)高于non-ESBLs-KP中的检出率(29.17%)。所有hmKP至少携带4种以上的耐药基因,其耐药风险排序依次为四环素类=氨基糖苷类>β-内酰胺类>磺胺类>喹诺酮类>氯霉素类,其中ESBLs-KP均携带8种以上的耐药基因;32株hmKP共表现出30种基因谱类型,无明显的优势耐药基因谱类型。在32株hmKP中共检出wabG、fimH、mrkD、entB和ybtS等5种毒力基因,其中,wabG、entB、fimH和mrkD基因检出率均为100.00%,ybtS基因检出率为21.88%,未检出rmpA和iutA基因;存在2种毒力基因谱型(fimH-mrkD-wabG-entB和fimH-mrkD-wabG-entB-ybtS),二者的区别在于是否携带ybtS基因;虽然ESBLs-KP和non-ESBLs-KP间在毒力基因检出率方面无显著差异(P>0.05),但ESBLs-KP中的ybtS基因检出率高于non-ESBLs-KP。【结论】生牛乳中hmKP存在高毒力和多重耐药风险,是临床KP感染的主要潜在来源,建议居民切勿直接饮用生牛乳,且相关部门应加强对牛乳中hmKP的耐药及毒力监测,兼顾其分布规律,以便对其潜在风险进行精准防御。     

猪源肠外致病性大肠杆菌的分离鉴定及致病性

【目的】从临床病死仔猪体内分离肠外致病性大肠杆菌,研究猪群中流行菌株的毒力基因分布、耐药性、致病性情况.【方法】病死仔猪肠外组织分离大肠杆菌,然后进行16S rDNA PCR测序鉴定、种系发育分群、毒力基因检测、抗菌药物的药敏试验、小鼠致病性试验、全基因组测序验证.【结果】共筛选到30株猪源肠外致病性大肠杆菌,其中A群4株、B1群15株、B2群5株、D群6株;毒力基因检测结果发现vaT、iutA、kpsMII、hlyD基因检出率分别为70.0%、33.33%、23.33%、20.0%;药敏试验结果显示:菌株都对多粘菌素B较敏感,对氨苄西林、林可霉素、杆菌肽以及利福平的耐药率为100%;获取了Ex-P27菌株基因组序列图谱,构建了该菌株基因组圈图.【结论】肠外致病性大肠杆菌分离株主要分布在B1群,对氨苄西林、林可霉素、杆菌肽以及利福平均耐药,为指导猪源肠外致病性大肠杆菌的防治与临床用药提供依据.     

乳样中金黄色葡萄球菌的靶向分离及其致临床型乳腺炎的风险分析

【目的】研究奶牛养殖场中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)的分离效率,快速评估分离株致临床型乳腺炎的风险。【方法】使用葡萄球菌选择培养基结合CHROM SA显色培养基对乳样中的SA进行靶向分离,经斯皮尔曼等级相关系数分析,建立定量测定分泌性溶血素评价SA毒力的方法。【结果】对采集的64份临床型乳腺炎、157份隐性乳腺炎和213份健康乳样进行SA分离,从中分别分离出27株、21株和17株SA菌;对应样本分离株中,溶血素分泌量≥1 500 VH50 U/mL(强毒力)的菌株分别为9株(33.3%)、1株(4.8%)和2株(11.8%)、溶血素分泌量在1 000~1 500 VH50 U/mL(中等毒力)的菌株1株(4.8%)、13株(61.9%)和4株(23.5%)、溶血素分泌量<1 000 VH50 U/mL(弱毒力)的2株(11.8%)、7株(33.3%)和11株(64.7%)。临床型乳腺炎的发生与感染溶血素分泌量≥1 000 VH50 U/mL(中、强毒力)菌株呈正相关(ρ=1,P=0.006 9),与感染溶血素分泌量<1 000 VH50 U/mL(弱毒力)菌株呈负相关(ρ=-1,P=0.10)。【结论】靶向分离方法提高了SA分离效率,可真实反应奶牛养殖场中SA感染率;定量测定溶血素可用于SA毒力评价,根据中、强毒力菌株的感染情况可以初步预测临床型奶牛乳腺炎发生风险,配合临床药物敏感性试验有可能提高SA性临床型乳腺炎的治愈率,减少耐药株的扩散。     

拟南芥Dof1基因原核表达载体的构建及应用

【目的】构建拟南芥转录因子Dof1基因的原核表达载体,进行原核表达并制备其蛋白抗体。【方法】利用RT-PCR方法从拟南芥中克隆转录因子Dof1基因,将其连接到原核表达载体pET-32a(+)上,构建重组原核表达载体pET32a(+)-Dof1,经酶切鉴定和测序验证后将其转化至大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导后,纯化重组蛋白,以分离到的重组蛋白为抗原免疫小鼠制备抗血清,检测植物中Dof1蛋白表达水平。【结果】成功构建了拟南芥转录因子Dof1基因的原核表达载体pET32a(+)-Dof1,在28℃、1mmol/L IPTG诱导6h的大肠杆菌中可高效表达分子质量约为42ku的重组蛋白,其分泌到细胞质中,不形成包涵体;Western-blotting检测结果证明,制备的抗血清有较好的抗原-抗体识别反应。【结论】成功实现了Dof1基因的原核表达,制备出的重组蛋白Dof1多克隆抗体可用于植物Dof蛋白表达水平的检测,可为Dof1基因的进一步研究奠定基础。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点的克隆及原核表达载体的构建

 【研究目的】对猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点进行克隆和原核表达载体的构建。【方法】参考GenBank上公布的TGEV S基因A抗原位点序列,应用Primer6.0设计一对含酶切位点的引物,用于RT-PCR扩增A抗原位点目的片段,将扩增产物连接于paesy-T克隆载体上构建克隆载体,用EcoR I和Xhol I对表达载体PET-32a（+）和重组质粒进行酶切,将酶切产物亚克隆至PET-32a（+）多克隆位点上,连接、转化至BL21(DE3),构建A位点的原核表达载体,并对阳性重组质粒进行酶切、PCR和测序鉴定。【结果】所扩增的目的片段的大小为534bp,与原核表达载体连接后,经核苷酸及推导的氨基酸序列分析表明,该基因与其它猪传染性胃肠炎病毒相应基因具有很高的同源性,说明成功地构建了TGEV S 基因A抗原位点的原核表达载体。【结论】TGEV S 基因A抗原位点原核表达载体的成功构建,填补了中国国内单独针对此位点进行研究的空白,也为TGEV诊断方法的建立提供良好的技术基础。     

河南省猪肠外致病性大肠杆菌毒力因子的检测及分布

为探讨河南省猪肠外致病性大肠杆菌的毒力因子及分布情况,试验设计16对引物,分别扩增猪肠外致病性大肠杆菌及其15个毒力因子,2017年1—12月从河南省猪场采集的各种组织病料148份中分离鉴定出52株猪肠外致病性大肠杆菌,进行了小鼠毒力试验和15个毒力因子的扩增。结果表明,河南省猪肠外致病性大肠杆菌感染率较高,分离株均对小鼠有毒力,ompA,traT基因在所有分离株中都含有,其次为fimH,iutA,vat,iroN基因,最少的是usp,kpsMTⅢ基因;分离株含有的毒力基因最多10个,其次为9个,最少的仅含2个。     

石河子垦区集约化奶牛场子宫炎主要病原菌的分离鉴定

【目的】为了解石河子垦区奶牛子宫炎主要致病菌感染情况,本研究采集石河子垦区4个集约化奶牛场的103头患有子宫炎的奶牛,分离病原菌及鉴定。【方法】利用子宫内取样器(专利号:ZL201420335941.6)采集患病奶牛子宫内粘膜或粘液样本206份,通过显微镜检查、细菌培养及分离、生化鉴定等方法进行病原学研究。【结果】结果显示,分离出8种病原菌共408株,其中葡萄球菌198株(占48.53%)、链球菌109株(占25.49%)、大肠杆菌85株(占20.83%)。从感染数据看,石河子垦区奶牛子宫炎以混合感染为主。【结论】石河子垦区集约化奶牛场子宫炎主要病原菌是葡萄球菌、链球菌和大肠杆菌。通过对该地区的奶牛子宫炎内致病菌的分离鉴定,为石河子垦区奶牛子宫炎的预防和治疗提供参考。     

牛布鲁氏菌毒力基因Virb8间接ELISA检测方法的建立与应用

【目的】布鲁氏菌virb8蛋白是布鲁氏菌的重要毒力因子,本研究拟构建含布鲁氏菌Virb8基因的原核表达载体,利用纯化蛋白作为包被抗原,建立检测牛布鲁氏菌血清抗体的间接ELISA方法（iELISA）。【方法】根据GenBank中的牛型布鲁氏杆菌Virb8序列,设计一对引物,以布鲁氏菌疫苗株S2全基因组DNA为模板扩增Virb8的基因,将目的基因克隆入PEASY-T3,经测序正确后,与载体pET-32a(+)连接,构建重组表达质粒pET-32a-Virb8,转化E.coli BL21(DE3),诱导表达融合蛋白pET-32a-Virb8,经SDS-PAGE及Western-blot分析鉴定后,采用Ni-NTA Spin Kit纯化目的蛋白,利用所建立的iELISA方法对235个临床奶牛血清样本进行检测,并与虎红平板凝集实验进行比较。【结果】成功构建了含Virb8的表达载体,经多次对表达条件的优化,大量表达了目的蛋白,建立的iELISA方法具有稳定、灵敏的特点,与虎红平板凝集试验的符合率可达97.02%。【结论】所建立的iELISA方法是一种有效的牛布鲁氏菌病血清学诊断的方法,为进一步研究其免疫原性和抗感染保护作用奠定了基础。     

万寿菊病虫害的发生与防治措施

万寿菊又名金盏花、臭芙蓉 ,千寿菊、蜂窝菊 ,属菊科万寿菊属一年生草本植物。黑龙江省八五三农场人工栽培万寿菊主要是取其花朵作为提取黄色素的原料。在正常条件下 ,种植万寿菊可实现公顷产鲜花 2 2 .5t以上、产值可达 135 0 0元左右、利润可达6 0 0 0元左右 ,经济效益较好。     

产销通路的建立及招商引资意见

针对大陆农业发展存在的不足有必要建立产销通路 ,并提及物流在流通环节的重要性。最后就大陆各地的招商引资提出了意见     

磷肥对黄秋葵生长与产质量及植株氮磷钾吸收的影响

采用田间试验的方法,研究不同施磷量对黄秋葵生长、产量、品质及植株氮磷钾含量的影响。结果表明,施磷能显著提高黄秋葵株高、茎粗及叶数等生长发育指标(P0.05)。施磷处理黄秋葵产量高于不施磷处理,随施磷量的增加,产量先增加后下降,当P_2O_5施用量为50 kg/hm~2时增产幅度最大。施磷还提高了黄秋葵可溶性糖、V_C及黄酮等品质指标,以P_2O_5施用量为25~50 kg/hm~2时品质较好。适量施磷也有利于黄秋葵植株氮磷钾含量的提高。因此,综合产量及品质等指标,黄秋葵较适宜的施磷量为50 kg/hm~2。     

水稻病虫害专业化统防统治工作的成效与主要措施

介绍了水稻病虫害专业化统防统治工作的成效、主要措施和今后发展的策略,以期为兴宁市水稻病虫害统防统治提供参考。     

秸秆切碎灭茬机的设计与试验

针对双轴击切式破碎秸秆和根茬所存在的问题，本文提出单轴压切原理和非等长刀切碎模型，并对秸杆切碎灭茬机的关键参数进行了优化设计。该机田间试验表明切碎率达91．4％，根茬破碎率达86．5％。该机的应用必将促进一年两熟平作旱区保护性耕作技术的发展。     

苦荞的成分功能研究与开发应用

苦荞具有丰富的营养价值 ,它既能食用 ,又能防病、治病 ,为许多其它主要食物所不及。我国有丰富的苦荞资源 ,对苦荞的深入研究和开发应用有利于改善和提高人们的食物结构 ,同时也有助于促进贫困山区的脱贫致富。本文就苦荞的营养价值、药用价值和开发应用等方面的问题进行了阐述     

药食同源蒲公英的开发应用研究现状与展望

蒲公英是一种多年生草本药食同源植物,其富含黄酮、萜类、多糖、绿原酸、果胶等化合物,在临床药用上具有清热解毒、消肿散结、利尿通淋的功效;同时,蒲公英含有多酚、维生素、矿物质、有机酸、生物碱等活性物质,具有很好的保健食用价值。文章从药食同源的角度对蒲公英的加工应用进行了综述,以期为后续蒲公英的综合开发利用提供参考。     

农业科技自主研发的实践与思考

从新农村建设对农业科技自主研发的要求着手,阐述了笔者对农业科技自主研发的认识与思考.在此基础上,提出了农业院校在彰显办学特色过程中如何着力科技创新、不断提高自主科技研发的能力与水平,进一步为新农村建设提供智力支撑的对策思考.     

干旱和温度胁迫对大蒜生理生化特性及病毒LYSV和OYDV积累的影响

【目的】探明干旱和温度胁迫对大蒜病毒积累的影响.【方法】采用qRT-PCR等方法对干旱和温度胁迫下大蒜叶片生理生化特性以及LYSV和OYDV两种病毒的积累量进行测定.【结果】干旱和温度胁迫下,叶绿素含量、净光合速率和气孔导度显著低于对照(土壤含水量20%,温度22℃),对可溶性蛋白质、可溶性糖和脯氨酸含量以及SOD活性呈现不同程度的影响;干旱胁迫下,LYSV和OYDV的积累量均随着胁迫程度的增加显著增加,在10%土壤含水量下,LYSV和OYDV分别达到8.60×106和6.54×106;温度胁迫下,低温4℃显著阻止了LYSV和OYDV的积累,高温35℃也对LYSV的积累量(1.78×106)起阻碍作用,而对OYDV的积累量(5.00×106)起促进作用.【结论】干旱和温度对大蒜LYSV和OYDV积累的影响不尽相同,对于其影响机制还需进一步的研究.     

《机械原理》与《机械设计》实验教学改革实践

《机械原理》和《机械设计》两门课程的实验教学在培养学生的综合设计、创新设计能力等方面,有其他课程不可替代的重要作用,针对两门课程传统实验教学中存在的问题,提出了以独立设课为中心的实验教学改革和实践方案,取得了显著的效果。