小鼠子宫内膜上皮细胞体外培养方法比较

为探讨适用于小鼠子宫内膜上皮细胞的培养方法,对胰蛋白酶消化法、胰蛋白酶消化+刮取法、Ⅰ型胶原酶消化法、Ⅰ型胶原酶消化法+刮取法、子宫翻转组织块培养法5种方法进行了比较研究.结果表明,胰蛋白酶消化法获得的上皮细胞数量稀少,活力低,生长速度缓慢;刮取法+胰蛋白酶消化法、胶原酶消化法、刮取法+Ⅰ型胶原酶消化法获得的细胞数量较单纯胰蛋白酶消化法多,但达不到研究所需的要求;子宫翻转组织块培养法获得的上皮细胞活力强,生长速度快,纯度高,比较适宜小鼠子宫内膜上皮细胞的原代培养.     

人工神经网络优化酶法制备马氏珠母贝 低聚肽的工艺研究

以马氏珠母贝全脏器为原料,采用胃蛋白酶、胰蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶模拟消化道酶解的方式制备低聚肽,先通过胃蛋白酶酶解获得初产物,在此基础上利用人工神经网络对胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶的双酶酶解过程进行模拟预测,对其酶解工艺进行优化.试验结果表明,通过人工神经网络预测获得小肠消化蛋白酶双酶酶解的优化工艺条件为:复合酶添加量4 500 U/g(m 胰蛋白酶∶m胰凝乳蛋自酶=6∶1)、料水比1∶2(W/V)、酶解时间3.5 h,在此条件下制备的低聚肽(200～2 000 u)得率达55％以上.通过优化的工艺条件制备的低聚肽可获得较高的得率,能够为马氏珠母贝全脏器低聚肽的开发利用奠定基础.     

红豆草胰蛋白酶抑制剂的部分性质

通过胰蛋白酶偶联的Sepharose 4B亲和柱,从红豆草茎叶中分离纯化出一种胰蛋白酶抑制剂,对其抑制剂的抑制活力、摩尔抑制比和抑制活性中心等进行研究.结果表明:红豆草胰蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶具有抑制作用,红豆草胰蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶的摩尔抑制比为1∶2;用氨基酸修饰法,进一步证明红豆草胰蛋白酶抑制剂的两个活性中心分别是精氨酸残基和赖氨酸残基.     

亲和层析纯化猪胰蛋白酶的研究

采用猪胰蛋白酶的天然抑制剂－鸡卵类粘蛋白作为配基合成亲和吸附剂，从猪胰脏的粗提液中，通过亲和层析直接获得高纯度的胰蛋白酶。此法具有操作简便、产品纯度，比活力和获得率高等优点。     

红肉菠萝蜜种子胰蛋白酶抑制剂的分离纯化及其特性

采用阴离子交换层析和凝胶过滤层析方法,从海南红肉菠萝蜜种子中分离纯化得到胰蛋白酶抑制剂,命名为AHTI.结果表明:该蛋白有抑制胰蛋白酶水解小肽底物的活性作用,由相对分子质量分别约为28.8 kD和16.4 kD的亚基组成的多聚体.AHTI具有稳定的胰蛋白酶抑制活性,对胰蛋白酶的抑制活性与其浓度成正比,AHTI对温度、pH的耐受性较强,2种因素对其胰蛋白酶抑制活性影响较小.     

双酶法提取肌肽的工艺研究

以牛肉为原料,采用胃蛋白酶、胰蛋白酶双酶法提取肌肽。结果表明,通过正交试验获得的最佳提取工艺为:胃蛋白酶用量为2.0%,其酶解时间为7 h;胰蛋白酶用量为2.0%,其酶解时间为4 h。     

酶制备牡蛎蛋白水解物的抗氧化活性和功能特性分析

为比较分析木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶3种不同酶水解牡蛎获得的蛋白产物抗氧化活性和功能特性,本文采用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶3种不同酶水解牡蛎蛋白获得水解物,并分别测定它们在不同pH值下的溶解度、乳化性以及不同浓度水解物的还原能力、DPPH自由基清除率和Fe~(2+)螯合能力。结果表明,3种酶水解物都有较高的溶解度(P0.01),胰蛋白酶产生的水解物溶解度最高,94.8%(P0.05);水解物溶解度和乳化活性指数在pH值为4时显著降低(P0.05)。牡蛎蛋白质水解产物的还原能力、DPPH自由基清除能力和金属螯合活性随浓度的增加而增强,其中胰蛋白酶和胃蛋白酶的水解物抗氧化能力较强(P0.01)。3种蛋白酶水解牡蛎蛋白可获得抗氧化活性强、溶解度高的水解物,并受浓度和pH值的影响,它们的水解物可作为一种潜在的抗氧化功能多肽利用。     

三种酶制备牡蛎蛋白水解物的抗氧化活性和功能特性分析

目的：比较分析木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶三种不同酶水解牡蛎获得的蛋白产物抗氧化活性和功能特性。方法：采用木瓜蛋白酶、胃蛋白酶和胰蛋白酶三种不同酶水解牡蛎蛋白获得水解物,并分别测定它们的在不同pH下的溶解度、乳化性以及不同浓度水解物的还原能力、DPPH自由基清除率和Fe^{2 +}螯合能力。结果：表明三种酶水解物都有较高的溶解度(p＜0.01),胰蛋白酶产生的水解物溶解高度达94.8％(p＜0.05)；水解物溶解度和乳化活性指数在pH4显著降低(p＜0.05)。牡蛎蛋白质水解产物的还原能力、DPPH自由基清除能力和金属螯合活性随浓度的增加而增强,其中胰蛋白酶和胃蛋白酶抗氧化能力较强(p＜0.01)。结论：三种蛋白酶水解牡蛎蛋白可获得抗氧化活性强、溶解度高的水解物,并受浓度和pH的影响,它们的水解物可作为一种潜在的抗氧化功能多肽利用。     

苏云金芽孢杆菌Cry1Ac原毒素、毒素制备及其对棉铃虫的毒力测定

对提取苏云金芽孢杆菌Cry1Ac原毒素与活化毒素的制备方法进行了改进,经牛胰蛋白酶作用后用等电点沉淀法和纯化法获得毒素.对样品进行SDS-PAGE分析,并测定其对棉铃虫初孵幼虫的毒力.结果表明制备的Cry1Ac原毒素和毒素降解较少,杀虫活性高.     

低胰蛋白酶抑制剂全豆豆浆的研制

[目的]研制低胰蛋白酶抑制剂全豆豆浆.[方法]利用中性蛋白酶和复合超微粉碎技术制备低胰蛋白酶抑制剂全豆豆浆,创新性地在打浆时加入中性蛋白酶,并研究了打浆豆水比、打浆温度、蛋白酶添加量、酶解时间对豆浆水解度和胰蛋白酶抑制剂钝化率的影响,并利用正交试验进行了工艺优化.[结果]试验表明,豆水比1∶7、水解温度50℃、酶用量16 μl/g、酶解时间20 min可钝化90％以上的胰蛋白酶抑制剂.添加豆浆质量3％的β-环糊精可以掩蔽酶解后豆浆的苦味.[结论]研究可为低胰蛋白酶抑制剂全豆豆浆的工业化生产提供参考.     

A Study on Heat Resistance and Initial Characterization of Protease Inhibitors in Porcine Colostrum

Porcine colostrum was separated into the acid-soluble fraction (SF) and casein fraction (CF) by acidifying followed by centrifuge. SF was further separated by liquid chromatography and anisotropic membrane filtration. Capacities of the SF or CF of porcine colostrum, to inhibit trypsin and chymotrypsin activity and to inhibit the epidermal growth factor (EGF) degradation in pig small intestinal contents, were determined under different heat treatments. The study showed that trypsin inhibitors in porcine colostrum survived heat treatments of 100℃ water bath for up to 10 min, but exposure to boiling water bath for 30 min significantly decreased the inhibitory activity. Compared with the trypsin inhibitors, the chymotrypsin inhibitors were more heat-sensitive. SF was more heat-sensitive than CF. Separation of the SF of porcine colostrum by liquid chromatography and anisotropic membrane filtration revealed that the porcine colostrum protease inhibitors, those had the capacity to inhibit the trypsin-chymotrypsin activity and enhanced the stability of EGF in the gastrointestinal(GI) lumen of weaned pigs, existed mainly in SF, milk-derived, were a group of heat-labile small proteins with molecular weight of 10 000-50 000.     

黑眶蟾蜍皮肤白蛋白的纯化及胰蛋白酶抑制活性

[目的]探讨黑眶蟾蜍皮肤白蛋白的纯化及胰蛋白酶抑制活性。[方法]通过离子交换层析和凝胶过滤层析,从黑眶蟾蜍皮肤中得到其白蛋白,命名为BufomA-skin。65nmol／L的BufomA-skin分别与30nmol／Ltrypsin在25℃不同保温时间（0．25—24h）下测定胰蛋白酶抑制活性,计算剩余酶活力。[结果]BufomA-skin为单链蛋白,分子量约为66．7kDa。但在非还原状态下,50～66kDa条带呈弥散样。该蛋白有抑制胰蛋白酶水解小肽底物的活性,但对其他丝氨酸蛋白酶如凝血酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶及枯草杆菌蛋白酶无抑制。BufomA-skin与胰蛋白酶保温24h后,胰蛋白酶活性无恢复。[结论]黑眶蟾蜍皮肤白蛋白具有稳定的胰蛋白酶抑制活性,在黑眶蟾蜍防御天敌捕食的过程中发挥重要作用.     

猪精原干细胞体外培养条件的优化

以出生后1～5 d的长白公猪为主要研究对象,采用两步酶消化法获取睾丸细胞悬液,用Percoll不连续密度梯度法对猪精原干细胞(PSSCs)进行纯化,以碱性磷酸酶(AP)染色鉴定;利用MTT法检测2种细胞因子——胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)和白血病抑制因子(LIF)对PSSCs发育的影响.结果表明:用Percoll不连续密度梯度法获得的PSSCs占睾丸总细胞数的(8.19±0.83)%,AP染色的阳性率为(87.47±2.90)%,表明该方法可有效获取PSSCs;MTT法检测表明,20 ng.mL-1 GDNF+1 000 U.mL-1 LIF的组合添加对PSSCs体外增殖的效果最好.     

A Study on the Inhibitory Potency of Protease Inhibitors in Porcine Colostrum

Porcine colostrum and milk were separated into the acid-soluble fraction (SF) and casein frac-tion (CF) by centrifuge. Trypsin and chymotrypsin inhibitory capacity in porcine colostrum, milk and theircomponents were determined by incubating bovine trypsin or chymotrypsin in a medium. The inhibition of in-sulin-like growth factor Ⅰ (IGF-Ⅰ) and epidermal growth factor (EGF) degradation in pig small intestinal con-tents by porcine colostrum was measured by incubating iodinated IGF-Ⅰ or EGF. Degradation of labeled IGF-Ⅰor EGF was determined by monitoring the generation of radioactivity soluble in 30% trichloroacetic acid(TCA). The results showed that porcine colostrum had high levels of trypsin and chymotrypsin inhibitory ac-tivity and increased the stability of IGF-Ⅰ and EGF in pig intestinal contents. The SF was higher in inhibitorypotency than CF. The present study revealed that the protease inhibitors in porcine colostrum, milk-derivedand colostrum-specific, existed mainly in SF.     

猪繁殖与呼吸综合症GP5蛋白的纯化与免疫活性分析

1材料与方法1．1表达菌及试剂猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）6P-1-GP5表达质粒由该实验室保存。Novagen蛋白纯化试剂盒、硝酸纤维素膜（NC膜）均购自华美公司;弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自Sigma公司;辣根酶标记兔抗猪IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司;其他常规试剂均由国内生产。试验用豚鼠由中国农业科学院兰州兽医研究所实验动物厂提供,体重400-500g,共8只。     

甘蓝型油菜Kunitz蛋白酶抑制剂的异源表达与理化特征分析

利用毕赤酵母表达系统首次克隆表达了一个油菜籽来源的Kunitz蛋白酶抑制剂基因(RTI;rti),分离纯化后对该抑制剂进行了理化特征分析.结果显示:在摇瓶发酵水平,重组RTI诱导表达水平达到628 mg·L-1,抑制剂比活性达到69.6 TIU·mg-1蛋白;重组RTI在30～90℃可保持70％以上抑制活性,在pH 2...     

聚乙二醇对猪凝血酶的化学修饰及其效果分析

利用亲和层析法,从粗酶中纯化得到猪凝血酶.采用活化的单甲氧基聚乙二醇对凝血酶进行了共价修饰,以此修饰酶为研究对象,进行了凝血酶在修饰前后的主要酶学性质的比较研究.结果表明,凝血酶经mPEGl修饰后,Km有所增加,pH和盐离子浓度的稳定性、热稳定性以及抗胰蛋白酶的水解能力均有所增强.     

大鼠骨骼肌卫星细胞培养的研究

[目的]探讨在体外条件下骨骼肌卫星细胞纯化、培养、鉴定的方法及确定其生物学特性。[方法]取新生大鼠的小腿肌肉,采用肌组织块和肌细胞培养两种方法。分别用胰蛋白酶对培养中的肌组织块和肌细胞进行消化,采用离心及差速贴壁法纯化,得到更高纯度的大鼠骨骼肌肌卫星细胞,进行体外原代骨骼肌和传代骨骼肌的细胞培养。传至第2代后,用分化培养基诱导分化,观察骨骼肌细胞各个阶段的形态特征并拍照。[结果]此方法分离的细胞成活率较高,体外生长、增殖良好。在分化培养基条件下,细胞分化良好,可融合成肌管。[结论]该实验成功探讨了新生大鼠骨骼肌卫星细胞的分化能力并建立了卫星细胞纯化方法,适用于开展细胞移植和肌组织工程方面的研究。     

猪繁殖与呼吸综合症GP5蛋白的纯化与免疫活性分析(英文)

[Objective] The purification and immunocompetence of GPS protein in porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) were analyzed in this study, which provided basis for establishing the corresponding serological method. [Method] The recombinant expression plasmid pGEX-6P-5 was transformed into BL21 and expressed after being induced with IPTG. The solubility analysis of expression products was carried out, and then the recombinant protein was purified for SDS-PAGE identification and Western-blot analysis. Finally, the recombinant antigen was used in the immune experiment of guinea pigs. [Result] The target protein content accounted for 30% of the total cells protein content according to the chromatography scanning, and the purity of target protein after purification reached 80%. The purified protein was analyzed by Western-blot and immune experiment of guinea pigs, and the results showed that the expressed protein had good reactionogenicity and immunogenicity. [Conclusion] This study provides materials for further studies on the function between PRRSV ORF5 gene and its editing protein, which also lays a foundation for porcine reproductive and respiratory syndrome virus genetic engineering products.     

重组猪干扰素α的纯化工艺研究

[目的]研究重组猪干扰素α的纯化工艺,为进一步研究该蛋白的分子结构及rPoIFN-α标准品的制备奠定基础。[方法]将含重组菌E.coliBL21诱导表达后得到的粗制rPoIFN-α,分别用2种方案进行纯化。方案1,依次用GST亲和层析法、DEAE阴离子交换法及分子筛法层析三步法进行纯化;方案2,依次用GST亲和层析和分子筛法层析两步法进行纯化。纯化结果用SDS-PAGE及Western-blot进行纯度检测及鉴定。[结果]诱导表达后的表达产物经SDS-PAGE检测,发现在45Kd分子量处有目的条带,Western-blot检测有特异性条带。通过两步法纯化后的rPoIFN-α纯度达96%,蛋白得率为42.8%,三步纯化纯度为98.8%。[结论]两步法得到的蛋白纯度非常接近三步法,但与三步法相比工艺更为简单方便。