RT-PCR检测菊花B病毒的研究

根据菊花B病毒(CVB)的外壳蛋白基因序列设计、合成引物,以感病组织和健康组织总RNA为模板,进行cDNA合成和PCR扩增,结果从感病组织中扩增出与预期的776bp大小一致的目标片段,而健康组织无此扩增产物;将PCR产物插入pGEM-T载体克隆并测序,序列分析表明与CVB的相应序列同源性达到85%;将感病组织总RNA以10 x梯度稀释成不同浓度,测出RT-PCR检测CVB的灵敏度为10-4x;PCR产物克隆作为RT-PCR反应的阳性对照,解决了毒源保存和传播的问题,从而建立了CVB快速、灵敏、准确的RT-PCR鉴定和检测技术.     

利用RT-PCR检测黄瓜上的西瓜花叶病毒

根据西瓜花叶病毒2号(WMV-2)的外壳蛋白基因序列设计、合成引物,以感病组织和健康组织总RNA为模板,含WMV-2外壳蛋白基因的质粒DNA为阳性对照,进行cDNA合成和PCR扩增。结果从感病组织中扩增出与预期的382 bp大小一致的目标片段,而健康组织无此扩增产物。对2002和2003年采集的98份黄瓜病毒病样本进行了同样的RT-PCR检测,结果表明98份材料中77．55％检测到WMV-2。     

黄瓜上烟草花叶病毒的RT-PCR检测

根据烟草花叶病毒TMV的外壳蛋白基因序列设计、合成引物,以感病组织和健康组织总RNA为模板进行cDNA合成和PCR扩增,对2002年采集的75份黄瓜病毒病样本进行了检测,结果从感病组织中扩增出与预期的425bp大小一致的目标片段而健康组织无此扩增产物;29份材料检测到TMV,检出率达38.67%。     

马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）的RT-PCR检测

以感染PSTVd的马铃薯试管苗及块茎和健康的试管苗及块茎为材料，应用韩国INTRON生物化学制药公司生产的PSTVd检测试剂盒提取试管苗及块茎这2种不同材料的mRNA，以此为模板，进行cDNA合成及PCR扩增，从感病组织扩增到一段长度为360bp的特异PCR扩增产物，而健康试管苗无此扩增产物。试剂法可对马铃薯不同材料进行PSTVd检测，60分钟内即可分离出mRNA，整个诊断时间为4h，方法简便、快捷、灵敏度高，可作为马铃薯种薯生产早期PSTVd诊断及引进品种的快速、有效检测手段。     

RT-PCR检测菊花B病毒的研究

根据菊花B病毒（CVB）的外壳蛋白基因序列设计、合成引物,以感病组织5和健康组织总RNA为模板,进行cDNA合成和PCR扩增,结果从感病组织中扩增出与预期的776bp大小一致的目标片段,而健康组织无此扩增产物;将PCR产物插入pGEM-T载体克隆并测序,序列分析表明与CVB的相应序列同源性达到85％;将感病组织总RNA以10x梯度稀释成不同浓度,测出RT－PCR检测CVB的灵敏度为10^-4x;PCR产物克隆作为RT－PCR反应的阳性对照,解决了毒源保存和传播的问题,从而建立了CVB快速、灵敏、准确的RT－PCR鉴定和检测技术。     

RT－PCR方法检测番茄环斑病毒的研究

根据番茄环斑病毒（TomRSV）外壳蛋白基因序列设计的引物P1，P2，用感病及健康组织总RNA为模板，进行RT-PCR试验，结果从感病组织中扩增出了470bp的目的片段，而健康组织中无此扩增带。摸索各项实验条件，建立了RT-PCR检测番茄环斑病毒（TomRSV）的方法。     

番茄根结线虫病抗病基因Mi的CAPS标记及检测

研究利用特异引物对2份抗病纯合材料(基因型Mi/Mi)和2份感病纯合材料(基因型mi/mi)进行PCR扩增,抗、感材料均产生750 bp的PCR扩增片段,纯合抗病和杂合抗病材料的PCR产物存在Taq I酶切位点,酶切后分别产生了570 bp和180 bp以及750 bp、570 bp和180 bp的片段,而感病材料的扩增产物无此酶切位点,酶切后仍为750 bp的片段。利用该标记对4份番茄杂交种进行检测,其中2份杂交种表现为杂合抗病型,另2份杂交种表现为纯合感病型。利用该标记对其中一个表现为杂合抗病的杂交种50份F2代单株进行检测,抗感遗传的分离比符合3∶1。说明该分子标记的这一抗病基因属于单基因控制的质量性状遗传位点。     

应用分子生物学方法快速检测烟草环斑病毒

根据烟草环斑病毒(tobacco ringspot virus)CP基因序列,设计并合成了特异性RT-PCR扩增引物,对烟草环斑病毒和非烟草环斑病毒的感病植物组织样本进行了PCR扩增反应。结果,烟草环斑病毒的感病植物组织样本的PCR产物均出现1 760 bp的特异性扩增条带,而非感病植株组织样本均未出现扩增条带,证明该合成引物具有烟草环斑病毒鉴定特异性。将提取的烟草环斑病毒总RNA做梯度稀释,测定该检测体系的敏感度,结果可检出烟草环斑病毒RNA模板最低浓度为234 pg/μl。研究表明,分子生物学测定具有特异性强、灵敏度高、快速准确的特点,可应用于烟草环斑病毒检疫的快速检测。     

南芥菜花叶病毒分子生物学快速检测方法的研究

根据南芥菜花叶病毒(Arabis mosaic Nepovirus)CP基因序列,设计并合成了特异性RT-PCR检测引物,对南芥菜花叶病毒和非南芥菜花叶病毒的感病植物组织进行了PCR扩增反应。结果,南芥菜花叶病毒的感病植物组织的PCR产物均出现364bp的特异性扩增条带,而非南芥菜花叶病毒均未出现扩增条带,证明这对引物具有南芥菜花叶病毒鉴定特异性。将提取的南芥菜花叶病毒总RNA做梯度稀释,测定该检测体系的敏感度,结果表明,此体系最低可检出南芥菜花叶病毒提取的RNA模板浓度为150pg/μL。     

百合上黄瓜花叶病毒的一步RT-PCR检测

根据黄瓜花叶病毒的外壳蛋白基因序列设计、合成引物,采用Trizol快速提取百合感病组织和健康组织的总RNA,运用RT-PCR两步法和一步法都可从感病组织中扩增出与预期的335 bp大小一致的目标片段,而健康组织无此扩增产物。两种方法相比,一步RT-PCR法特异性强、灵敏度高、省时经济、程序简单,达到了快速检测的目的。     

3种甜樱桃病毒PNRSV、PDV及LChV-2的多重RT-PCR检测方法的建立与应用

【目的】建立可同时检测李属坏死环斑病毒（Prunus necrotic ringspot virus,PNRSV）、李矮缩病毒（Prune dwarf virus,PDV）、樱桃小果病毒2（Little cherry virus-2,LChV-2）的多重RT-PCR检测方法。【方法】以复合感染3种病毒的甜樱桃病株叶片为材料,采用CTAB法提取样本总RNA,选用随机六聚体引物对植物样本总RNA进行反转录,所得cDNA作为多重RT-PCR的扩增模板。根据GenBank中PNRSV、PDV、LChV-2基因组序列共设计6对特异引物,分别通过单一RT-PCR和多重RT-PCR筛选出可用于同时检测3种甜樱桃病毒的引物组合。对多重RT-PCR的退火温度及循环数进行优化,以筛选出各引物组合的最适扩增条件。分别以单一感染PNRSV、PDV、LChV-2、复合感染3种病毒、单一感染樱桃病毒A（Cherry virus A,CVA）及甜樱桃无毒苗为样本,对多重RT-PCR引物的特异性进行分析。选取复合感染3种病毒的甜樱桃总RNA的反转录产物为初始模板,按照梯度稀释法依次将模板稀释为2、22、23、24、25倍,在相同PCR反应体系及反应条件下分别对各引物组合的灵敏度进行分析。多重RT-PCR的扩增条带经凝胶回收试剂盒回收纯化后连接至pMD18-T vector,克隆测序,以验证多重RT-PCR检测的准确性。并应用该方法对山东泰安地区甜樱桃生产园中间隔栽培的中国樱桃进行检测。【结果】筛选到2个可以应用的引物组合,组合1“PNRSV-S1/A1、PDV-S2/A2、LChV2-S1/A1”可分别特异性地扩增733、467、337 bp的片段。组合2“PNRSV-S1/A1、PDV-S3/A3、LChV2-S1/A1”可分别扩增得到733、265、337 bp的片段。扩增产物大小与预期相符。多重RT-PCR反应条件优化结果显示,在退火温度52℃、35个循环条件下,2个引物组合的检测效果均较为理想。特异性分析结果显示,2个引物组合均能特异性检测其各自的靶病毒。灵敏度分析结果显示,2个引物组合在cDNA的23×稀释液中仍能特异性扩增,但扩增条带的强度稍有差异,其对植物总RNA的反转录产物的最低检测浓度为107.9 ng•μL-1。克隆测序及序列分析表明,2个引物组合对各自靶病毒的检测结果可靠。应用该方法对9个中国樱桃样本进行检测,结果显示,测试样品均至少感染了2种病毒,其中5个样品复合感染了3种病毒,2个样品同时感染PDV和LChV-2,2个样品同时感染PNRSV和LChV-2。【结论】应用建立的多重RT-PCR检测方法可稳定、准确、灵敏的同时检测单一或复合侵染的3种甜樱桃病毒。     

改良RNA提取法及樱桃PDV和PNRSV的RT-PCR检测

介绍了一种从木本植物组织中获得高质量RNA的快速、简单和高效的核酸提取方法。该方法是基于核酸的二氧化硅捕获,避免了使用苯酚、氯仿等有机溶剂。利用该方法从樱桃组织中提取的总RNA用RT-PCR技术检测PDV,PNRSV均获得成功。从感病植株的一年生枝的叶片、韧皮部及芽组织中扩增出了预期的目的片段,即172和449bp,而健康组织中无此扩增带。该法提取的总RNA用于RT-PCR技术检测,其敏感性至少与商业出售的QiagenRNeasy提取试剂盒相当,但简单经济。     

乌鲁木齐地区马铃薯纺锤块茎类病毒的检测与序列分析

根据马铃薯纺锤块茎类病毒(PSTVd)基因序列设计合成1对引物,对新疆乌鲁木齐地区马铃薯田间感病植株进行一步法RT-PCR检测,扩增出251 bp大小的目标片段,而健康植株无此扩增产物。将目的片段克隆到pGM-T载体上并进行序列测定,构建系统进化树分析各分离物间的分子差异性。结果表明马铃薯纺锤块茎类病毒乌鲁木齐分离物与国内外已报道毒株的核酸序列同源性达93.6%~99.2%。     

进境大豆种子上菜豆荚斑驳病毒和大豆花叶病毒的多重RT-PCR检测

【目的】针对进境大豆种子上症状相似的菜豆荚斑驳病毒（Bean pod mottle virus,BPMV）和大豆花叶病毒（Soybean mosaic virus,SMV）,建立同时快速检测2种病毒的多重RT-PCR技术。【方法】根据GenBank公布的BPMV、SMV外壳蛋白基因序列,设计2对特异性引物,以复合感染BPMV、SMV的大豆种子为材料,提取dsRNA作为模板进行多重RT-PCR的引物浓度、退火温度和循环数的优化。利用优化建立的多重RT-PCR方法分别对健康大豆种子、BPMV、SMV及2种病毒复合感染的大豆种子进行检测,测定该方法的特异性。利用健康大豆种子提取的dsRNA,将从复合侵染BPMV、SMV大豆种子中提取的dsRNA按10倍梯度稀释,依次稀释为原液的10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5和10^-6倍作为模板,分别进行多重RT-PCR和单一RT-PCR扩增,测定灵敏度。多重RT-PCR扩增产物回收纯化后,连接于pMD18-T载体,进行克隆测序和序列比对,进一步验证该方法的可靠性。应用建立的多重RT-PCR方法对来自于美国、阿根廷、中国和巴西的疑似带病大豆种子进行检测,同时以单一RT-PCR检测进行验证。以BPMV、SMV抗体等体积混合液包被PCR管后再加入样品提取液或直接以样品提取液包被PCR管,将免疫捕获、试管捕捉和多重RT-PCR相结合,建立同时检测BPMV、SMV的多重一步IC-RT-PCR、多重一步TC-RT-PCR方法。【结果】多重RT-PCR的优化结果显示,最佳引物浓度为BPMV 0.4μmol·L^-1、SMV 0.4 μmol·L^-1,最佳退火温度为52℃,最佳循环数为35。特异性测定结果表明,多重RT-PCR能够从复合感染BPMV、SMV的大豆种子上同时扩增到大小约542、221 bp特异性目的条带,从单一感染BPMV的大豆种子上扩增到大小约542 bp特异性目的条带,从单一感染SMV的大豆种子上扩增到大小约221 bp特异性目的条带,而从健康大豆种子材料上未扩增出任何特异性条带。灵敏度测定结果表明,当dsRNA原液稀释至10^-3倍时,无论是多重RT-PCR,还是单一RT-PCR均未扩增出特异性目的条带,多重RT-PCR与单一RT-PCR的灵敏度相当,为10^-2倍dsRNA原液。多重RT-PCR扩增产物克隆测序和序列比对结果显示,BPMV、SMV所测的序列全长分别为542和221 bp,与预期大小完全相符,且与已报道的各病毒基因序列高度同源,证实了多重RT-PCR结果的可靠性。应用建立的多重RT-PCR方法分别对来自于4个国家的大豆种子样品进行检测,结果从3份美国大豆种子样品检出BPMV,1份美国大豆种子检出SMV,1份阿根廷大豆种子检出SMV,2份中国大豆种子检出SMV,该结果与单一RT-PCR验证结果一致,阳性符合率达100% 。建立的多重一步IC-RT-PCR、多重一步TC-RT-PCR方法能够从复合感染BPMV、SMV的大豆种子中成功扩增出2条特异性目的条带,而从健康大豆种子中未扩增出特异性目的条带。【结论】建立的多重RT-PCR检测方法为进境大豆种子上BPMV、SMV的快速检测提供了参考。     

安徽省水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的 分子检测和序列分析

近年来,水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)和南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)在安徽各稻区危害日益严重,生产上仅凭症状难以区分2种病毒。本研究建立的RT-PCR方法可以实现一次性检测和鉴定RBSDV和SRBSDV 2种病毒,根据RBSDV和SRBSDV S9保守序列设计3个引物,不仅可以从单独感染RBSDV或SRBSDV的水稻样本中分别扩增出1条大小不同的特异性条带,而且还可以从感染RBSDV和SRBSDV的混合水稻样本中一次性扩增出2条大小不同的特异性条带。从安徽省庐江县、郎溪县、怀宁县和宣州市4个地区水稻田采集表现明显矮缩病症状的水稻样本,RT-PCR检测结果表明,庐江和郎溪水稻样本受到RBSDV侵染,怀宁和宣州水稻样本受到SRBSDV侵染。选取庐江县、郎溪县、怀宁县和宣州市各1个水稻样本,利用RT-PCR扩增出特异性条带,再分别克隆和测序。序列分析表明,庐江、郎溪2个样本的核苷酸序列与RBSDV-Shandong和RBSDV-Zhjr S9部分片段序列相似性高达99.3%～99.8%,且与RBSDV的亲缘关系最近,说明庐江和郎溪样本感染的病毒是RBSDV的2个分离物;怀宁、宣州2个样本的核苷酸序列与SRBSDV-Shangdong和RBSDV-2 S9部分片段序列相似性高达99.5%,且与SRBSDV亲缘关系最近,说明怀宁和宣州样本感染的病毒是SRBSDV的2个分离物。     

广西甘蔗黄叶病调查及3种病毒基因型在广西的分布

[目的]探明甘蔗黄叶病在广西蔗区的发生情况,明确甘蔗黄叶病毒（SCYLV）基因型类型和地理分布,为甘蔗抗病育种和健康种苗生产提供科学依据.[方法]从广西蔗区采集不同品种（品系）显症或不显症甘蔗样品,采用特异引物（P1/P2）进行RT-PCR检测.甘蔗黄叶病病毒基因型鉴定采用3对特异引物BRA-PER-F/BRA-PER-R、REU-F/B-REVd和CUB-F/CUB-R进行RT-PCR鉴定.[结果]SCYLV RT-PCR检测结果,124个样品中有57个样品可扩增出大小约630 bp的目的条带,扩增产物与GenBank中已报道的SCYLV CP基因序列同源性达95％～99％.甘蔗黄叶病调查结果,124个样品中57个样品检测出SCYLV,感染率为46.0％.广西北部蔗区黄叶病感染最严重,SCYLV检出率为76.0％;桂西、桂中、桂南蔗区分别有50.0％、40.0％和36.8％的品种检出SCYLV;桂东蔗区SCYLV阳性检测率最低,为16.6％.在所调查的甘蔗品种中以柳城03-182、桂糖21、粤糖55和粤糖93-159感染SCYLV比较严重,主栽品种ROC22在柳城、宜州、钦州和金光农场均检测出阳性.病毒基因型调查结果,广西甘蔗黄叶病病毒基因型存在巴西-秘鲁（BRA-PER）、留尼汪岛（REU）和古巴（CUB）基因型等3种.主要以CUB型为主,占63.2％,除东部和西部蔗区外其他蔗区均有分布;其次是BRA-PER基因型,占56.1％,每个生态蔗区均有分布;REU基因型占5.3％,分布于柳州、凭祥、南宁蔗区.[结论]甘蔗黄叶病SCYLV已在广西各主要蔗区发生且蔓延,其病毒基因型存在3种且有不同程度分布.     

盐渍肠衣猪瘟病毒实验室检测的相关性研究

参考GenBank中发表的猪瘟病毒（CSFV）序列,设计一对CSFV特异性引物;从CSFV感染猪盐渍小肠中提取总RNA,经逆转录后进行PCR扩增,在盐渍小肠中成功扩增出与预期大小（168bp）一致的特异性条带,而正常猪和感染猪伪狂犬病病毒的猪小肠扩增结果均为阴性．用此方法对40例盐渍猪肠衣样本进行检测,结果与经典抗原检测方法（抗原捕获ELISA法）一致,而兔体交叉反应试验的阳性检出率为RT-PCR的66．7％,表明本RT-PCR技术能应用于盐渍猪肠衣的CSFV检测．     

用RT—PCR法对猪瘟病毒检测的研究

用异硫氰酸胍-酚-仿一步抽提法提取病料细胞总RNA并进行反转录，再以此产物为模板对CSFV可疑病料进行了PCR扩增。结果用CSFV特异性引物扩增能得到与设计片段大小相同的产物(272bp)，并且不扩增猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒的核酸；其敏感性要高于猪瘟荧光抗体染色法、猪瘟强弱毒酶标单克隆抗体染色法和电镜负染法，为临床上猪瘟的诊断提供了一个快速、有效的诊断方法。     

应用多重RT-PCR检测甘肃‘成县迟蒜’中的大蒜潜隐病毒和洋葱黄矮病毒

根据大蒜潜隐病毒(garlic latent virus,GLV)和洋葱黄矮病毒(onion yellow dwarf virus,OYDV)的外壳蛋白基因核苷酸序列分别设计2对特异性引物,在单重RT-PCR检测的基础上,建立同时检测GLV和OYDV的多重RT-PCR技术体系.结果表明:该方法可从带病的甘肃‘成县迟蒜’大蒜样品中扩增出GLV(849bp)和OYDV(571bp)的2条特异性片段.GLV扩增产物与GenBank中登录的其他分离物核苷酸同源性在90.00%～99.76%,OYDV扩增产物与其他分离物核苷酸的同源性为90.00%～98.00%.