奶牛乳房炎源性金黄色葡萄球菌分离株N_2的耐药性分析及其基因特征

以乳房炎源性金黄色葡萄球菌分离株N2为研究对象,采用纸片扩散法分析了耐药性,应用刚果红法检测了生物被膜形成能力,利用PCR法扩增了8种生物被膜形成基因和9种肠毒素基因。结果表明,金黄色葡萄球菌分离株N2具有广泛的耐药性,仅对苯唑西林高度敏感,具有较强的生物被膜形成能力,携带除bap外所有的被测生物被膜相关基因和sea、sec、seg、sei 4种肠毒素基因。结果表示金黄色葡萄球菌分离株N2可能存在多种侵袭方式,在临床上难以防治,为进一步以该菌株为研究材料进行相关研究奠定了基础。     

金黄色葡萄球菌生物被膜形成与生物被膜相关基因的调查研究

以分离自全国9个省（市、区）的102株奶牛乳房炎源性金黄色葡萄球菌为研究对象，应用刚果红法（congo red agar，CRA）和半定量黏附试验（semi quantitative adherence assay，SQAA）检测了生物被膜形成情况，应用PCR法检测了8种生物被膜相关基因分布情况。结果发现，携带7种基因的菌株占有绝对优势，其次是携带6种基因的菌株；最流行的基因组合是SigB－icaR－icaA－icaD－sarA－rbf－SasG，比例高达66．7％；北京、内蒙古、宁夏、甘肃、广西、上海等地生物被膜形成与生物被膜相关基因的分布高度一致。以上研究结果表明，多种生物被膜相关基因组合是奶牛乳房炎源性金黄色葡萄球菌流行的主要特点，生物被膜形成和生物被膜相关基因的分布在大多数地区表现高度一致性，rbf和SigB基因可能在金黄色葡萄球菌生物被膜形成和乳房感染过程中发挥着重要作用。本研究结果将为金黄色葡萄球菌性乳房炎的防治提供一定的科学参考。     

奶牛乳腺炎表皮葡萄球菌耐药性及生物被膜形成相关基因的研究

目的 在分离奶牛乳腺炎表皮葡萄球菌的基础上,分析表皮葡萄球菌的耐药性、生物被膜形成能力及生物被膜形成相关基因的特点,为研究表皮葡萄球菌生物被膜的形成及其毒力因子引起奶牛乳腺炎的发病情况及机制奠定基础。方法 通过K-B药敏纸片法对分离的表皮葡萄球菌进行敏感性检测,用刚果红平板法筛选被膜阳性菌,结晶紫染色法检测生物被膜形成能力,利用激光共聚焦显微镜(CLSM)观察和分析生物被膜的形成形态,应运PCR法对ica AB、ica A、ica B、ica C、icaR、aap、bap、fbe、atl E、sig B、sar A和agr基因进行扩增。结果 本实验采集了368份患奶牛乳腺炎的乳样,分离得到15株表皮葡萄球菌,产生物被膜阳性菌7株,检出率46.7%。分离株对青霉素的耐药性最高,对阿米卡星、头孢噻肟、林克霉素等的耐药性较强,但对环丙沙星和万古霉素的敏感性较高。形态学观察发现48 h时生物被膜厚度和结构更为复杂。bap、ica AB、aap、sar A、fbe、atl E、sig B和agr 8种基因在分离株中扩增出与预期大小一致的片段。结论 本实验结果表明表皮葡萄球菌是引起奶牛乳腺炎的一种主要致病菌,其生物被膜阳性菌株比例较高,阳性菌株的耐药性明显高于被膜阴性菌,同时atl E、sig B、agr和fbe 4种毒力因子均存在于生物被膜阳性菌中。     

奶牛源金黄色葡萄球菌新疆分离株生物被膜、肠毒素基因与毒力的检测及其相关性分析

【目的】检测奶牛源金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)新疆分离株生物被膜、肠毒素基因分布与毒力,分析其内在联系。【方法】采用微量滴定板测定法(MPA)、PCR方法和寇氏改良法分别测定164株S.aureus新疆分离株生物被膜(BF)形成能力、肠毒素基因分布、小鼠半数致死量(LD_(50))和脏器载菌量,观察其病理组织学变化。【结果】164株S.aureus BF阳性率为83.4%,以弱BF(BF~+)菌株为主;肠毒素基因检出率为96.3%,传统肠毒素see和新型肠毒素seg检出率最高,分别为57.3%和81.1%;强BF菌株(BF~(3+))LD_(50)要高于弱BF菌株(BF~+)和阴性菌株(BF~-),但其脏器载菌量低于BF~-菌株(P0.05)。【结论】奶牛源S.aureus新疆分离株BF阳性菌株所占比例较高,其肠毒素基因携带率也较高。毒力研究表明,S.aureus分离株BF~(3+)菌株脏器载菌量低于BF~-菌株(P0.05),且随着BF形成能力的增强毒力相应减弱。     

金黄色葡萄球菌肠毒素基因分布的研究

为了研究g型肠毒素基因(SEg)i、型肠毒素基因(SEi)在金黄色葡萄球菌菌株中的分布状况,本试验以分离自人化脓组织、生牛乳等8种不同来源的371株金黄色葡萄球菌菌株作为研究对象,利用PCR技术对肠毒素基因的分布进行检测。结果表明:267株金黄色葡萄球菌检出含有肠毒素基因,总检出率为71.97%。其中SEg基因的总检出率为67.93%,SEi基因的总检出率为57.68%。各来源间金黄色葡萄球菌肠毒素的检出率不同,且同一来源的菌株其SEg和SEi的检出率也不同,表明不同来源以及不同肠毒素的基因型在金黄色葡萄球菌中的分布存在差异。     

奶牛乳腺炎葡萄球菌生物被膜形成及相关基因分析

 【目的】研究临床分离的奶牛乳腺炎葡萄球菌生物被膜形成能力,相关基因的分布及二者之间的关系;【方法】利用通用硅胶片法培养葡萄球菌生物被膜,经充分洗涤后对生物被膜进行银染定性判断菌株形成生物被膜的能力,通过生物被膜菌落结晶紫染色法定量检测菌株生物被膜的形成能力,并用扫描电镜观察被膜结构,对葡萄球菌bap、icaAD、icaBC、sar、agr、sigB、clfaA、clfaB、fnbpA和fnbpB进行PCR扩增检测。【结果】 银染法定性结果显示137株葡萄球菌中有120株形成肉眼可见的生物被膜,生物被膜形成率为87.6%;结晶紫染色定量检测与硅胶粘附的有132株,不粘附的有5株。试验所用的137株葡萄球菌中,57株能扩增出bap基因;有43株和54株分别能扩增出icaAD和icaBC;有73株、49株和38株分别扩增出sigB、sar和agr;分别有76株和50株染色体中存在clfaA和clfaB;fnbpA和fnbpB分别在52株和26株菌株中扩增出。【结论】推测bap、sigB、sar、icaAD和icaBC基因是生物被膜形成的重要相关基因;agr及粘附素基因clfaA、clfaB、fnbpA和fnbpB对生物被膜形成的作用不明显。     

食源性金黄色葡萄球菌肠毒素基因的分布与时序性表达

【目的】研究食源性金黄色葡萄球菌各血清型肠毒素基因的分布,并进一步分析其时序性表达规律。【方法】针对51株各类食品中分离的金黄色葡萄球菌菌株,应用PCR技术对11种葡萄球菌肠毒素进行基因分型;提取细菌总RNA,以ftsZ和ropB作为内标基因,使用反转录荧光定量PCR研究各肠毒素基因在细菌生长周期中的表达水平变化。【结果】除see、ses和set外,其余8种肠毒素基因在51株食源性金黄色葡萄球菌菌株中均有检出,且sei和seg的检出率最高（27.45%）。各肠毒素基因在mRNA水平的时序性表达规律基本一致,均在对数后期达到峰值,随后快速下降。以内标基因为参照,同一菌株中不同肠毒素基因的相对表达量以及不同菌株中同一肠毒素基因的相对表达量均差异较大。【结论】本文系统研究了肠毒素基因在食源性金黄色葡萄球菌中的分布,并探究了肠毒素基因的时序性表达规律,对金黄色葡萄球菌毒力机制研究与食品质量安全控制具有参考意义。     

动物源金黄色葡萄球菌生物被膜形成能力与分子分型关系研究

[目的]调查产生生物被膜的金黄色葡萄球菌流行病学特征,探究生物被膜形成能力与分子型之间的相关性,为治疗动物金黄色葡萄球菌感染提供理论依据.[方法]以广东省兽药研制与安全评价重点实验室保存的98株金黄色葡萄球菌为研究对象,用结晶紫半定量法测定所有菌株生物被膜形成能力,将产膜菌株进行22种常见抗菌药的最小抑菌浓度测定,通过...     

内蒙古地区生牛乳中金黄色葡萄球菌产肠毒素特性及对特定抗生素耐性研究

了解生牛乳中金黄色葡萄球菌污染状况、产肠毒素特性及耐药性,为控制生乳中金黄色葡萄球菌的污染对乳制品食用安全具有重要意义.本研究从103份样品中分离鉴定出17株金黄色葡萄球菌,检出率16.50％,10株产肠毒素阳性,阳性率58.82％,经纸片法初筛得到10株相对耐红霉素、链霉素、青霉素、氨苄西啉的菌株,并对这10株菌进行了10种抗生素的敏感性试验,青霉素、氨苄西啉的耐药率分别达41.18％、35.29％,头孢噻肟钠、链霉素的耐药性为17.65％,红霉素、氧氟沙星、头孢唑啉、阿米卡星的耐药性为11.76％,环丙沙星耐药率为5.88％,并表现出多种耐药谱.     

人体表金黄色葡萄球菌超抗原毒素基因型系统分析

采用以4组反应管同时检测18种金黄色葡萄球菌超抗原毒素的多重PCR检测方法,对人体表面分离的金黄色葡萄球菌进行超抗原毒素基因系统分型。结果表明,在人体皮肤、头发及鼻腔中采集的682份样品中共分离到16株金黄色葡萄球菌,鼻腔中检出率最高,为4.35%(10/230);分离株超抗原毒素基因携带率高达81.25%,多数菌株同时携带1种以上基因;肠毒素基因携带率为56.25%,所有携带肠毒素基因的菌株都携带至少1种传统肠毒素,其中sea携带率最高,其次为sec,而see未检出。     

金黄色葡萄球菌分离株的菌膜测定及其影响因素

采用96孔细胞培养板法,对10株不同来源的金黄色葡萄球菌分离株的菌膜形成能力进行调查,并研究外部环境因素对金黄色葡萄球菌菌膜形成的影响。首先以金黄色葡萄球菌标准菌株ATCC6538为模式菌株,确定了亲水性细胞培养板、培养48 h为适宜的菌膜体外培养条件。在此条件下测定了10株分离株的菌膜形成量,并研究了不同培养温度（25~46℃）和不同营养条件（葡萄糖和氯化钠）对菌膜形成的影响。结果显示,体外培养条件下,金黄色葡萄球菌普遍可以形成菌膜,10株菌中仅1株为菌膜阴性,不同菌株菌膜形成能力差异较大;较高的培养温度有利于菌膜的形成,有3株菌在46℃时菌膜形成量达到最大;0.5%葡萄糖和1%氯化钠的添加可显著改变各菌株的菌膜形成,葡萄糖倾向于促进临床分离株菌膜形成量的增加,而氯化钠倾向于促进食品分离株菌膜形成量的增加。这一结果,可以为实际环境中菌膜的预防及控制提供指导和方向,同时也说明金黄色葡萄球菌的菌膜形成存在着不同的调控模式。     

RT-PCR检测金黄色葡萄球菌肠毒素A基因

金黄色葡萄球菌是引起细菌性食物中毒的重要病源菌之一,尤其是肠毒素。国内外由金黄色葡萄球菌肠毒素引发的食物中毒屡屡发生。目前,国内检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素仍采用传统的方法,其操作繁琐、检测时间较长,通常需要3~5 d才能完成,且灵敏度较低。本研究缩短食品中金黄色葡萄球菌肠毒素的检测时间,针对PCR检测的灵敏性、特异性,建立了检测金黄色葡萄球菌肠毒素的方法,为检测食品中金黄色葡萄球菌肠毒素提供了技术支持。分别采用TRIZol法和热酚法提取金黄色葡萄球菌总RNA并进行比较研究,在此基础上反转录获得cDNA,用特异引物对sea基因进行扩增,并优化PCR反应条件,获得理想的sea基因阳性扩增条带。结果表明,热酚法在总RNA提取方面优于TRIZol法,改进PCR反应时间和循环次数,最终初步建立RT-PCR检测金黄色葡萄球菌A基因的方法。     

菠萝皮醇提取物抑菌活性的研究

以菠萝皮为原料,利用醇提法提取活性物质,通过平板打孔法研究该提取物对常见的4种食品污染菌的抑菌作用。实验结果表明：菠萝皮醇提取物对大肠杆菌、黑曲霉、金黄色葡萄球菌具有明显的抑制作用,在测试范围内,其最小抑菌浓度（MIC）分别为40、100、200 g/L;对大肠杆菌、黑曲霉的最低杀菌浓度（MBC）分别为800、1000 g/L,对金黄色葡萄球菌的MBC未在测试范围内;菠萝皮醇提取物对桔青霉则无抑制作用。通过比较介质pH对提取物稳定性的影响,发现菠萝皮醇提取物在酸性条件下有抑菌活性,在碱性条件下则无抑菌活性。     

4种食源性致病菌多重PCR检测技术的研究及应用

为建立一种利用多重PCR技术检测和鉴定沙门氏菌(Salmonellla spp)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的方法,根据沙门氏菌侵袭力蛋白A基因(invA gene)、单核细胞增生李斯特菌蛋白转录调控基因(prfA gene)、金黄色葡萄球菌自溶素基因(alt gene)、蜡样芽孢杆菌的促旋酶B亚单位基因(gyrB gene)设计引物,进行多重PCR扩增,并对多重PCR反应体系进行优化。在此基础上建立了4种致病菌的多重PCR检测体系,同时以国标法进行对比验证。结果表明,本研究建立的多重PCR检测方法简单、快速、灵敏度高,具有很好的应用前景。     

黄喉拟水龟松鼠葡萄球菌16S rDNA的序列测定和系统进化分析

从患病的黄喉拟水龟肝脏、肾脏分离到1株葡萄球菌（YLD81101）,经人工感染实验证实其为该病的病原菌。为了从分子水平上对其进行分类学鉴定,采用扩增细菌16S rDNA的通用引物对该菌的16S rDNA进行PCR扩增、克隆及序列分析。结果扩增出长约1．5kp的目的片段,测序得到1条长度为1515bp的核苷酸序列（GenBank登录号GQ261178）。核苷酸相似性分析表明,所得序列与GenBank公布的松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciud,S．sciuri）CTSP9菌株16S rDNA核苷酸序列相似性最高（99．9％）。同时,用与该序列相关性较高的S．sciuri及常造成动物葡萄球菌病的S．aureus S、saufeuss．bsp．anaerobius、S.gallinarum、S.hyicus代表菌株构建的系统发育进化树显示,菌株YL081101与S.sciuri代表株聚为一簇。上述研究证实,分离菌株YL081101为松鼠葡萄球菌。     

山东省牛源金黄色葡萄球菌耐药谱分析及mecA耐药基因检测

采用纸片扩散法测定金黄色葡萄球菌(以下简称金葡菌)对6种抗生素的敏感性。结果表明,在测定的121株金葡菌中,耐苯唑西林金葡菌(MRSA)为26株,占21.5%;对苯唑西林敏感菌(MSSA)为93株,占76.9%;中介菌株为2株,占1.6%。金葡菌对6种抗生素耐药率最低的是头孢噻肟为2株,占1.6%。mecA基因的PCR扩增结果显示:所有的MSSA mecA基因均阴性,中介株mecA基因阳性1株,而MRSA中mecA基因阳性株为9株。MSSA对大部分抗生素仍保持良好的敏感性,而MRSA表现为多重耐药性,PCR技术可以作为快速检测金葡菌耐药基因的有效方法。     

可形成生物膜的禽源产色葡萄球菌的分离鉴定及耐药性研究

从发病鸡关节腔内分离获得1株革兰氏阳性球菌,根据细菌形态、生理生化特性、动物试验,结合16S rRNA基因核苷酸序列测定、系统进化树分析及生物膜半定量检测,确定该分离菌株为可形成生物膜的的产色葡萄球菌,该菌在正常条件下不致病。药物敏感试验和耐药基因检测发现,该菌对磺胺六甲、阿奇霉素、米诺环素等8种药物敏感,对环丙沙星、头孢噻肟钠和复方新诺明中敏,而对万古霉素等13种药物低敏甚至不敏感。检测到该分离菌株包含氨基糖苷类、四环素类和磺胺类的6个耐药基因,说明这是一株多重耐药菌株,推测其耐药性与生物膜的形成有密切关系。     

微生物能力验证实验结果分析

为提高微生物实验室检潮能力和检验人员技术水平,增强实验室竞争力,依据国家标准GB 4789.2、3、4、10-2010,采用多稀释度、多平行样和多方法,同时结合3M纸片法对代码为T0504-A样品中的菌落总数、T0504-B中的大肠菌群、T0504-C中的金黄色葡萄球菌、T0504-D中的沙门氏菌进行检测鉴定.结果表明...     

定点突变阻止金黄色葡萄球菌α-溶血素溶血活性

金黄色葡萄球菌分泌的α-溶血素是导致肺炎的重要致病因子。为进一步研究金黄色葡萄球菌α-溶血素(α-hla)的分子致病机理以及对其进行免疫预防,对α-hla第35位氨基酸进行了定点突变。用聚合酶链式反应(PCR)技术,从S.aureus wood46株基因组中扩增出α-hla基因,再利用重叠延伸PCR技术,将第35位带正电荷的组氨酸(密码子为CAC)突变为非极性的亮氨酸(密码子为CTC)。hlaH35L基因测序结果显示第35位的组氨酸突变为亮氨酸,构建的重组表达质粒pET-28a-c(+)/hla和pET-28a-c(+)/hlaH35L在E.coli BL21(DE3)中得到表达,重组蛋白α-Hla及hlaH35L大小均为33.4 kDa,α-Hla引起兔红细胞溶血,hlaH35L未引起兔红细胞溶血。成功表达并获得了失去溶血毒性的重组蛋白hlaH35L。