施氏鲟精巢和卵巢差减cDNA文库的构建和差异表达EST的筛选

应用抑制差减杂交（SSH）技术构建了施氏鲟（Acipenser schrenckii）精巢和卵巢组织的SMART cDNA文库及其cDNA差减文库，从两个差减文库中随机挑取200个克隆进行PCR检测，随机挑选其中的123个cDNA克隆测序。将所测序列经GenBank检索和生物信息学比较，发现有55个cDNA片段序列在GenBank上无明显的同源性，68个片段与已报道的基因有较高的同源性，其中17个cDNA片断为精巢中特异表达的基因，而51个为卵巢中特异表达的基因。精巢中大量表达的主要为延长因子（EF-1）和脂肪酸连接蛋白等与精子生成发育有关的基因，而卵巢主要为ZPC、组蛋白和周期蛋白等与卵细胞发育成熟相关的基因。这些EST数据为进一步筛选和克隆鲟鱼性腺组织特异性表达基因提供了材料平台，为鲟鱼基因组数据增补了大量信息。     

抑制差减杂交法克隆牙鲆变态早期差异表达的基因

为了克隆变态早期牙鲆头部差异表达的基因，采用抑制差减杂交法，以变态前的仔鱼头部表达的RNA作为驱动RNA，建立了牙鲆变态早期的差减cDNA文库，并利用相对定量RT-PCR对其进行了筛选。差减库的平均插入片段558bp左右，阳性率为81．8％。随机测定的45个克隆，在剔除假阳性克隆后，共得到22个不同的基因，其中13个为已知cDNA的同源基因，而另外9个为已知蛋白的同源基因，分别为prolactin receptor-like，COL1A1，M3-muscarinic receptor，Sfrs3，tropomyosin，ribosomal protein L27，ribosomal [rpteom S12，GAPDH，COL1A3。在所有22个基因中，COL1A1基因在差减库中的分布频率最高，为22．2％。RT-PCR检测结果表明，在所检测的11个基因中，所有基因在右眼移动前后的牙鲆头部均有表达，只是体现在表达水平上的不同。     

cDNA芯片结合抑制性差减杂交技术构建对虾白斑综合征病毒表达基因和螯虾免疫相关基因文库

以克氏原螯虾做为对虾白斑综合征病毒（WSSV）的增殖模型，试验组接种WSSV，对照组接种PBS。分别以试验组为检测组（tester）、对照组为驱逐组（driver），进行正向抑制性差减杂交；以对照组为tester、试验组为driver，进行反向SSH。将获得的正、反向差减杂交产物克隆入质粒载体PinPointTM Xa1 TVector，再转化大肠杆菌DH5α,共构建了2个分别含1620和400个克隆的正、反向差减文库。经PCR扩增，1514个差减克隆得到产物，其中正向差减克隆1221个，反向差减克隆293个。获得的PCR产物经浓缩、变性处理，用自动点样仪点制于尼龙膜载体上，制成cDNA芯片，用cDNA芯片对SSH获得的差减克隆进行鉴定，共获得差异表达克隆278个，其中攻毒组高表达克隆255个；对照组高表达克隆23个。     

罗非鱼免疫前后白细胞cDNA差减文库的构建及其表达序列标签初步分析

为筛选得到罗非鱼白细胞免疫相关基因，促进鱼类免疫防治进展，本研究应用抑制性差减杂交（SSH）技术成功构建了罗非鱼链球菌疫苗免疫前后正、反两个白细胞eDNA差减文库，富集了免疫过程中表达谱发生变化的白细胞基因。随机挑选阳性克隆PCR检测。显示插入片段在300～750bp。正反文库各随机挑选300个阳性克隆（共600个克隆）进行测序及EST初步分析。正库筛选得到18个免疫期间袁达丰度上调基因，其中2个与罗非鱼已知基因具有相似性，6个与其他鱼类已知基因相似，其他6个与其他物种已知基因具有相似性，4个为未知新基因。负库筛选得到22个免疫期间表达丰度下调的基因，其中4个与罗非鱼已知基因具有相似性，5个与其他鱼类已知基因相似，6个与其他物种已知基因具有相似性，7个为未知新基因。随着序列的进一步分析及利用RACE等技术得到罗非鱼抗菌或免疫相关全基因，深入开展鱼类功能基因研究奠定良好的基础。     

溶藻弧菌诱导马氏珠母贝血淋巴cDNA差减文库的构建及分析

为了探讨马氏珠母贝免疫防御机制,筛选免疫防御相关功能基因,以致病性溶藻弧菌人工感染的马氏珠母贝血淋巴为材料,采用抑制性差减杂交(SSH)技术,构建了溶藻弧菌诱导的马氏珠母贝血淋巴cDNA差减文库;以马氏珠母贝管家基因β-actin作为差减指标检测该文库的差减效率;对选取的600个阳性克隆进行测序及生物信息学分析。结果显示,该文库的差减效率可达210倍;PCR阳性检测显示差减片段为100~750 bp,对随机挑取600个克隆的测序结果显示,共获得414个有效EST序列;通过BLAST同源性比对,有167个EST序列(占40.34%)与NCBI数据库中已知功能蛋白质具较高同源性,其中7个EST序列(占1.69%)与免疫防御相关基因同源;此外,204个EST(占49.28%)在数据库中未发现同源序列。研究表明,SSH技术能有效富集马氏珠母贝血淋巴差异表达基因,研究结果为探索马氏珠母贝免疫基因作用机理和调控机制奠定了基础。     

海带雄性配子体差异表达基因片段的克隆及筛选

利用抑制消减杂交法（suppression subtractive hybridization,SSH）获得了海带雌、雄配子体差异表达的cDNA片段,将雄配子体差异表达的cDNA片段克隆于pGEM-T载体并转化大肠杆菌（Escherichia coli）JM109,构建雄配子体差异表达的cDNA消减文库。自750个阳性克隆中随机挑选100个进行PCR扩增鉴定,电泳图谱表明插入片段大小在200～1000bp之间。进一步经过Southern斑点杂交筛选后,选取10个阳性克隆进行测序和序列分析,有7个片段与GenBank数据库中已知基因序列无明显同源性,初步判断为新的基因序列,3个片段与已知脚基因和Lhcf6基因的同源性分别达到88％和98％。     

三角帆蚌肝脏瘟病感染期抑制性消减cDNA文库的构建与分析

采用抑制性消减杂交技术构建了三角帆蚌肝脏瘟病感染期抑制性消减cDNA文库。经检验,差异表达基因均被富集了 2¹⁰倍左右,证明构建的 cDNA 消减文库具有很强的消减效率。PCR 鉴定发现,在随机挑取的阳性克隆中,95% 的克隆均含有 0.2～1.0 kb 的插入片段,这些片段可能是三角帆蚌瘟病病毒感染后差异表达基因的cDNA片段。测序共获得 214 个有效 cDNA 序列,分别属于8 大类,共 98 个基因。其中细胞分裂基因 2个、细胞结构与运动基因 9 个、代谢基因 10 个、信号传导基因 7 个、细胞防疫基因 10 个、基因与蛋白表达基因 20 个、未知功能蛋白基因 26 个,GenBank中找不到任何同源序列的基因 14 个。结果说明,构建的差异表达cDNA文库,可较好地反映三角帆蚌瘟病病毒对三角帆蚌影响的基因信息。     

皱纹盘鲍外套膜耐维生素E缺乏消减cDNA文库的构建

为了克隆维生素E缺乏时皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)外套膜差异性表达的基因,本研究配制了维生素E缺乏水平(3.5 mg/kg)和正常添加水平(52.8 mg/kg)的人工饲料,喂养皱纹盘鲍幼鲍,初始体质量为(0.71±0.00)g,初始壳长为(15.49±0.04)mm,240 d后,采用抑制消减杂交法(Suppression Subtractive Hybridization,SSH)构建了维生素E缺乏组与正常组外套膜组织差异表达的cDNA消减文库。经检验,差异表达的基因均被富集了25-28倍,证明构建的cDNA消减文库具有很强的消减效率。从文库中随机挑取100个白色克隆摇菌液进行PCR鉴定,95%的克隆中均有100-900 bp的插入片段,这些片段可能是维生素E缺乏差异表达基因的cDNA片段。选取含插入片段大小不同的48个克隆测序,其中有16个新基因,10个谷胱甘肽转移酶的基因,5个谷胱甘肽过氧化物酶基因,2个过氧化氢酶基因,3个羟基类固醇脱氢酶基因,4个酪氨酸激酶基因,1个类甲状腺过氧化物酶蛋白基因,3个纤维素酶基因,1个cAMP效应元件结合蛋白基因,3个贝壳生物矿化相关蛋白的基因。总的来说,利用抑制消减杂交的方法构建差异表达cDNA文库,可以比较好地反映维生素E对皱纹盘鲍影响的基因信息,为研究其他营养素对皱纹盘鲍基因表达的影响提供了基础数据。     

鲤脑组织cDNA文库的构建及脑室管膜素基因鉴定

用Gubler-Hoffman法构建了低温下鲤(Cyprinus carpio Linnaeus)脑组织cDNA文库,经测定库容量为5.7×105 CFU/mL,文库的重组率接近95%,平均插入片段长度约为1.5 kb,符合文库保存和筛选实验的要求.同时,根据鲤与低温相关消减cDNA文库中低温下特异表达基因片段序列,设计PCR引物在此cDNA文库中进行PCR检测和序列测定,使用BLAST软件将测序的10个cDNA序列同GenBank等数据库进行比对,结果显示8个阳性克隆有相关同源性,2个克隆为功能未知的基因,全长率近75%;以上结果说明本实验所构建的cDNA文库质量较高,可作为筛选与鲤低温性状相关的功能基因的重要资源.同时对其中一个与低温相关的基因脑室管膜素基因构建了表达载体,为进一步验证该基因在鱼类低温适应中所发挥的作用及其作用机理奠定了基础.     

链状亚历山大藻抑制消减杂交文库的构建及分析

为了筛选链状亚历山大藻特异表达的发光相关基因,应用抑制消减杂交技术,构建了链状亚历山大藻特异表达的cDNA消减文库,共获得500个克隆,通过基因PCR初步筛选表明插入片段的大小主要集中在250～1000 bp,随机挑选10个阳性克隆进行双向测序和序列比对分析,有2个克隆基因片段与已知基因序列高度同源,分别为荧光素结合蛋白和羧化酶/加氧酶,另有8个克隆基因片段在GenBank中未查找到相应的同源基因,可能为未知新基因序列.这些基因的获得为进一步研究链状亚历山大藻特异表达基因,阐明其发光机理及建立特异甲藻的新型检测方法提供重要依据.     

Isolation of a viable but non-culturable suppression mutant of Vibrio vulnificus: role of antioxidant enzymes in surviving stationary phase and low temperatures

ABSTRACT:   The viable but non-culturable (VBNC) suppression mutant was isolated. Suppression subtractive hybridization was used to identify differentially expressed genes among cDNA of the VBNC suppression mutant and the wild-type strain. RpoS-dependent catalase was highly expressed from the VBNC suppression mutant during oxidative stress in the stationary phase and at low temperatures. In experiments of H₂O₂ sensitivity, the VBNC suppression mutant showed a peroxide-resistant phenotype in the stationary phase and at low temperatures. These results suggest that VBNC suppression mutant cells use catalase for protection against oxidative stress in the stationary phase and at low temperatures.     

Difference in genes between a high virulence strain G4 and a low virulence strain G18 of Flavobacterium columnare by using suppression subtractive hybridization

Flavobacterium columnare is the causative agent of columnaris disease. Different genetic groups of F. columnare show to some extent different degrees of virulence. To identify genetic differences between the high virulence strain G₄ and the low virulence strain G₁₈ of F. columnare, suppression subtractive hybridization was used. A total of 46 genes were identified from the virulent strain G₄, 35 of which showed some degree of homology with known proteins and can be classified into 11 categories: DNA replication or recombination proteins, inorganic ion transport proteins, outer membrane proteins, enterotoxin, binding proteins, YD repeat proteins, transposase, chaperon, signal transduction‐related proteins, regulatory proteins, metabolism‐related proteins. Several putative virulence factors identified in other bacteria could also be identified in the virulent strain G₄, such as ferrous iron transport protein, TonB‐dependent receptor, transposases, as well as ABC transporter permease protein. The flanking region of a putative transposase ISFclI was analysed, and a putative Rhs element was located at the downstream of the putative transposase. The analysis of isfclI gene in 24 strains of F. columnare isolated in China revealed that 11 strains have isfclI, and all the strains from Zhaoqing, Anhui and Qingjiang have isfclI.     

红笛鲷头肾消减cDNA文库的构建与分析

应用抑制性消减杂交技术(SSH)构建红笛鲷(Lutjanus sanguineus)头肾消减cDNA文库,筛选红笛鲷免疫相关基因的EST.以哈氏弧菌(Vibrio harveyi)灭活疫苗体内诱导红笛鲷为实验组,以注射无菌生理盐水的红笛鲷为驱动组,通过SSH技术构建红笛鲷头肾消减.DNA文库.利用PCR技术和斑点杂交对文库进行筛选,从2 424个含插人片段的阳性克隆中筛选了680个克隆在上海生工进行了序列测定.使用BLASTx和BLASTn工具对获得的ESTs与GenBank数据库进行同源性比较并根据相似性序列的名称通过GO法对ESTs进行注释.结果获得了30个与红笛鲷免免疫防御相关基因的EST,如组织相容性抗原复合物基因(MHC I和MHCII),免疫球蛋白基因(IgH和IgL)、热休克蛋白基因(HSP10,HSP70和HSP90)等.本研究构建了哈氏弧菌灭活疫苗免疫后与正常组织差异表达的消减cDNA文库,并获得一批与红笛鲷免疫防御相关的ESTs,旨在为探讨红笛鲷分子免疫防御机制、筛选参与免疫防御调控相关的功能基因,揭示红笛鲷免疫抗病机制、提高机体抗病力、实现遗传改良奠定基础.     

盐碱胁迫下青海湖裸鲤鳃基因表达差异

采用抑制消减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术,研究了青海湖裸鲤(Gymnocyprisprzewalskii)在高盐碱胁迫下转录水平上的基因表达差异,实验获得差异表达序列91条,其中成功注释60条。以同是鲤科鱼类的斑马鱼(Danio rerio)的基因ID作为参照,用DAVID软件对这些序列进行功能分类,结果从正向文库获得28条功能基因片段,反向文库获得14条。按功能将其分为10类,其中,催化活性、细胞、部分结合相关基因表达上调,结合、免疫相关基因表达下调。分析发现,高盐碱胁迫会改变鱼类的渗透压和酸碱平衡,对免疫系统产生一定的抑制作用,对此,鱼类通过增强离子调控、提高血清尿素氮浓度、合成应激蛋白等,来维持渗透压和酸碱平衡,缓解应激反应。     

抑制消减杂交（SSH）及其在鱼类基因克隆中的应用

和其它脊椎动物一样,在鱼类的生命进程中,某种特定类型的细胞中只有比例约为10%～15%的基因表达.由于这些基因的特异性决定了从受精卵到机体死亡的整个生命过程,所以这些基因的时空表达是受到严格调控的.在不同发育阶段,不同生理状态和不同类型的细胞中,表达的基因各不相同.因此,比较两种不同类型细胞中基因表达的差异,可以探究表型的遗传原因,了解生命过程的基本信息,从而找到与发育、疾病等相关的基因.     

抑制消减杂交技术在鲤鱼抗寒研究中的应用

用抑制性消减杂交技术（SSH）研究与鲤鱼（Cyprinus carpio）抗寒性状相关的基因。通过对荷包红鲤抗寒品系（Cyprinus carpio wuyanensis Tchang）和柏氏鲤（Cyprinus pellegnini Tchang）杂交F2代进行降温诱导实验，获得不同温度下的实验材料。利用抑制消减杂交技术构建了一个低温下差异表达基因的消减cDNA文库，共含有2000个克降。对其叶1480个克隆进行斑点杂交筛选，共得到60个阳性克隆，选取其中29个克隆测序。通过序列分析比对，13个克隆与已知基因序列高度同源，同源性为85％-98％；另外的13个克隆为未知新基因序列。在13个同源性较高的克隆序列巾，有brevican基因、AMP—acid连接酶、CFL2基因、催产素基因、主要组织兼容复合体（MHC）Ⅱβ链、锌指蛋白、细胞色素氧化酶、EPD-1基因、透明质酸结合蛋白多糖类、核受体／类视色素信号调节器等，其中9个基因上调表达，另有4个则抑制表达。这些基因的获得可为研究鱼类抗寒性状以及从分子水平上阐明其机制提供重要依据。     

孔石莼在干出胁迫下上调表达基因消减cDNA文库的构建及分析

利用抑制消减杂交技术构建了潮间带绿藻孔石莼(Ulva pertusa)在干出胁迫状态下上调表达基因的消减cDNA文库.获得的阳性克隆经测序得到150条上调表达的EST片段,其中21条为冗余序列(RS),137条非冗余序列(NRS).片段中最长833 bp,最短106 bp,平均长度364 bp.参与比对的EST片段按照...