中国水仙几丁质酶基因的克隆与表达分析

【目的】克隆中国水仙几丁质酶基因,分析其在水仙不同组织中的表达,为提高中国水仙的抗病性提供参考。【方法】利用RT-PCR技术克隆得到中国水仙几丁质酶基因,对其序列及编码氨基酸序列进行生物信息学分析,通过qRT-PCR分析该基因在感染基腐病、病毒病及褐斑病中国水仙根、叶中的表达。【结果】中国水仙几丁质酶基因的cDNA序列长768bp,编码230个氨基酸,其编码蛋白的分子质量为25.4ku,理论等电点为9.04,为不稳定蛋白,亲水性强,二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主。该基因编码的蛋白与荷兰芹几丁质酶蛋白的亲缘关系最近,隶属于糖苷水解酶19家族,与溶菌酶相似超家族基因的保守结构域类似,推测其可能是兼具几丁质酶和溶菌酶的双功能酶。qRT-PCR分析表明,在水仙基腐病、病毒病及褐斑病发病过程中,水仙几丁质酶基因的表达量均显著提高。【结论】成功克隆得到中国水仙几丁质酶基因,推测该基因可能参与了水仙的抗病过程。     

哈茨木霉Rac基因的克隆及特征分析

Rac基因是普遍存在于真核生物细胞中参与环境应急反应的重要基因。本文采用RT-PCR方法从哈茨木霉中成功克隆了哈茨木霉的Rac基因的eDNA,全长718bp,推测编码204个氨基酸,蛋白分子量为22.4kD。通过数据库检索等生物信息学方法分析发现哈茨木霉Rac与羊茅香柱菌相似性高达82％。与柄篮状菌相似性也达到75％。哈茨木霉Rac基因含有GTP／GDP结合和Effeetor区。Rac基因的cDNA序列及推测的氨基酸序列在GenBank上登录（登录号分别FJ595933和ACM24223）。     

百日草几丁质酶基因片段克隆及其序列分析

[目的]克隆百日草几丁质酶的基因片段,并对其序列进行分析.[方法]以百日草“梦境”系列为材料,提取其叶片总RNA,并根据其他植物几丁质酶基因保守序列设计简并引物,通过RT-PCR克隆百日草几丁质酶基因片段（ZEchi）,并对该基因序列进行分析.[结果]克隆得到的片段长度为227 bp,共编码75个氨基酸残基;核苷酸同源性分析表明,ZEchi与已报道的其他植物几丁质酶基因同源性达70％以上,其中与葡萄的同源性最高,为74％;氨基酸同源性分析表明,该几丁质酶多肽属于18家族几丁质酶,且与已报道的其他植物几丁质酶氨基酸序列具有70％以上的相似性;氨基酸聚类分析表明,该几丁质酶多肽与白车轴草和蒺藜苜蓿的几丁质酶聚类;生物信息学分析表明,由该基因片段编码的多肽为非跨膜蛋白,主要含α螺旋和随机线圈螺旋等二级结构.[结论]该研究为进一步研究几丁质酶基因的功能奠定了基础.     

陆地棉干旱胁迫响应基因GhGR的克隆及特征分析

【目的】克隆陆地棉干旱胁迫谷胱甘肽还原酶基因（GhGR）,并对其序列进行生物信息学分析和表达分析。【方法】利用RACE和RT-PCR技术克隆陆地棉谷胱甘肽还原酶基因的全长序列,应用生物信息学软件对获得的基因序列及编码的蛋白序列进行分析;通过基因枪转化和实时荧光定量PCR表达对该基因表达部位和表达模式进行分析。【结果】从陆地棉（Gossypium hirsutum L.）中克隆了谷胱甘肽还原酶基因GhGR,cDNA全长1 035 bp,其中,ORF为792 bp,编码263个氨基酸。氨基酸序列比对和同源性分析显示该基因与杨树（XP_002299276.1）、蓖麻（XP_002518118.1）、葡萄（CAN74593.1）同源性最高,分别为90%、91%和91%。系统发育树结果显示,GhGR与葡萄中该蛋白的亲缘关系最近。基因枪转化和实时荧光定量PCR分析表明GhGR定位于洋葱的细胞膜和细胞核膜,并且其表达量受干旱胁迫诱导上调表达。【结论】从陆地棉克隆得到谷胱甘肽还原酶基因GhGR,初步认为该基因对干旱胁迫有一定响应。     

绵羊YAP1基因全长cDNA克隆及生物信息学分析

【目的】克隆绵羊YAP1基因cDNA并分析其序列及其蛋白的遗传特性及其在不同组织中不同程度的表达情况。【方法】以湖羊为研究对象,利用RT-PCR和RACE技术获得绵羊YAP1序列,并结合生物信息学方法对绵羊YAP1的序列进行深入分析。【结果】从湖羊背最长肌中克隆YAP1基因的全长cDNA序列;利用生物信息学技术,对绵羊YAP1基因与其它物种的同源性,蛋白质序列的跨膜区,亚细胞定位,亲水性,潜在信号肽剪切位点,糖基化位点,磷酸化位点,编码产物进行功能预测分析,及其编码蛋白的二级结构,三级结构等进行分析。【结论】克隆获得绵羊YAP1基因序列全长为1 712 bp,包括1 212 bp的编码区序列,编码403个氨基酸。同源性分析发现,绵羊YAP1核苷酸序列与推测氨基酸序列与灰仓鼠的同源性最高,分别达到78.77%和92.51%,而与人、黑猩猩的一致性差异较小。氨基酸序列分析发现该基因编码蛋白为水溶性蛋白,相对分子量为44079.0Da,理论等电点为4.91,无信号肽序列和跨膜区;亚细胞定位主要在细胞核,不属于分泌蛋白;预测含有33个磷酸化位点,7个糖基化位点,具有两个WW结构域,二级结构以无规则卷曲为主,三级结构显示,YAP1结构域区构成弯曲状螺旋结构。预测YAP1蛋白主要在调节功能过程中有着关键作用。以上研究为进一步探讨YAP1基因在肌肉生长过程中的功能研究奠定了遗传信息基础。     

延边黄牛转铁蛋白受体2基因克隆与序列分析

【目的】克隆延边黄牛转铁蛋白受体2（transferrin receptor 2,TFR2）基因,并分析该基因在不同组织器官中的表达分布。【方法】通过提取肝脏组织总RNA,采用RT-PCR及RACE方法克隆延边黄牛TfR2基因,采用生物信息学软件进行序列分析,用半定量PCR（SqRT-PCR）方法分析TfR2基因在不同组织器官中的表达分布规律。【结果】①成功克隆出了延边黄牛TfR2基因完整ORF区及3′UTR区（GenBank登录号：GU553087）,该基因全长2 901 bp,ORF区2 412 bp,编码803个氨基酸;②延边黄牛TfR2基因核苷酸序列与其它物种的同源性在80%以上,不同物种间TfR2基因氨基酸序列,尤其是影响其功能的关键氨基酸位点高度保守;③各物种TfR2蛋白功能结构域同样高度保守;④牛TfR2基因主要在肝脏中表达,其它组织,如脾脏、心脏、肾脏和肠道（十二指肠）中也存在少量表达。【结论】不同物种间TfR2基因具有高度同源性,功能结构域及组织分布规律具有高度保守性。     

内蒙古白绒山羊LDH-A基因cDNA的克隆与特性分析

 【目的】克隆内蒙古白绒山羊乳酸脱氢酶A（LDH-A）基因并分析其基本表达模式。【方法】采用RT-PCR和3′ RACE技术克隆基因,将得到的基因cDNA序列及其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析。利用RT-PCR方法进行组织表达检测。【结果】获得了内蒙古白绒山羊LDH-A基因全长cDNA序列。该基因cDNA全长1 649 bp,包含一个996 bp的ORF和642 bp 的3′ UTR。SMART分析表明ORF编码的蛋白质具有Ldh_1_N domain和Ldh_1_C domain,Psite分析表明有L-乳酸脱氢酶活性位点,PSORT程序分析将其定位于细胞质中。LDH-A基因在脾、肾、睾丸和肌肉组织中均有表达。【结论】内蒙古白绒山羊LDH-A基因编码的蛋白具有典型的乳酸脱氢酶结构,cDNA核苷酸序列与牛的LDH-A基因（NM_174099.2）具有较高的同源性。在脾、肾、睾丸和肌肉组织中均有表达。     

黑豆NBS类抗病基因同源片段的克隆与分析

根据已克隆的抗病基因保守结构域设计简并引物,以湖南黑豆（HH）为试材,通过RT-PCR,从cDNA中扩增抗病基因同源序列,测序鉴定出2个含有通读阅读框的DNA片段：FNBSl、FNBS3。FNBS1大小为534bp,编码178个氨基酸;FNBS3大小为513bp,编码169个氨基酸。BLASTP分析表明,2个片段均具有NB-ARC结构域（与植物抗病有关）,并且包含p-loop、Kinase-2、HD等结构域。基因FNBSl与大豆基因RPMl-like编码的氨基酸序列的同源性为98％,基因FNBS3与大豆基因N-like 编码的氨基酸序列的同源性为99％,推测FNBS1、FNBS3可能是黑豆NBS-LRR类抗病基因的核心区域。     

杨树PsChiⅠ基因全长的克隆与表达分析

【目的】克隆川杨几丁质酶基因cDNA全长序列,分析其在病原菌侵染过程中不同时段的表达特征。【方法】以受落叶松-杨栅锈菌(Melampsora larici-populina)单孢子堆菌系Sb052侵染后的川杨叶片为试材,采用RACE法克隆川杨几丁质酶基因cDNA序列,对其进行生物信息学和实时荧光定量表达分析。【结果】克隆到1条川杨几丁质酶基因序列,将其命名为PsChiⅠ(GenBank登录号:KC416180)。该序列全长1 145bp,包含1段960bp的开放阅读框(ORF),38bp的5′非编码区和147bp的3′非编码区。其编码蛋白含有319个氨基酸,具有2条糖苷水解酶19家族特征序列,理论等电点为5.03,为ClassⅠb型酸性几丁质酶,属于几丁质酶第19家族。序列比对和系统进化树结果表明,PsChiⅠ与毛果杨(Populus trichocarpa)几丁质酶基因相似性最高,且亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果表明,菌系Sb052侵染杨树叶片后PsChiⅠ基因在各个时段都有表达,但以侵染后12和48h时的表达量相对较高。【结论】获得了几丁质酶基因全长序列,推测其参与了寄主川杨抵抗真菌的防御机制。     

地黄纤维素合酶基因的克隆与生物信息学分析

根据以前克隆的地黄Rgh BNG基因碱基序列,利用Primer Premier 5.0设计特异引物,采用hi TAIL-PCR技术从怀地黄基因组DNA中扩增出578 bp DNA片段。经生物信息学分析发现,它与根癌土壤杆菌、土壤杆菌的纤维素合酶基因的同源性达81%~91%;它所含的453 bp的开放阅读框(ORF)编码蛋白质的氨基酸序列与根癌土壤杆菌、土壤杆菌、菜豆根瘤菌、豌豆根瘤菌纤维素合酶基因编码蛋白质氨基酸序列的同源性高达83%~99%,说明蛋白质可能具有纤维素合酶的结构域。用hi TAIL-PCR技术克隆怀地黄纤维素合酶基因,为进一步研究其分子作用机制和在地黄分子育种中的应用奠定了基础。     

粉蕉MbACO2基因克隆及其表达分析

【目的】克隆粉蕉1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）氧化酶（ACO）基因（MbACO2）,并进行表达分析,为研究ACO基因家族在香蕉果实发育成熟过程及逆境胁迫过程中的功能作用提供参考依据,也为改良香蕉采后贮藏提供潜在的基因资源。【方法】利用RT-PCR从粉蕉果实克隆MbACO2基因,运用生物信息学软件分析其编码蛋白的理化性质、亲疏水性、保守结构域及二、三级结构。利用农杆菌介导的瞬时转化法进行亚细胞定位,并利用实时荧光定量PCR检测MbACO2基因在果实发育成熟过程及高盐、干旱和低温胁迫处理下的表达情况。【结果】克隆获得的MbACO2基因开放阅读框（ORF）长度为918 bp,编码305个氨基酸残基,其蛋白分子量为34.583 kD,理论等电点（pI）为5.43,属于亲水性蛋白,具有典型的植物ACO蛋白家族的结构特征,含有DIOX_N和2OG-FeⅡ_Oxy 2个保守结构域。MbACO2氨基酸序列与同属的香蕉（Musa acuminata AAA group）ACO氨基酸序列（XP_010908825.1）相似性最高,为98.04%,表明其具有高度的保守性。MbACO2蛋白在细胞核和细胞质中均有表达。随着粉蕉果实发育成熟,MbACO2基因表达量整体呈升高趋势,极显著高于开花后0 d（对照）（P< 0.01,下同）,尤其是在果实采后6 d,其相对表达量达最高值。高盐、干旱和低温胁迫处理下,MbACO2基因的相对表达量较对照（未胁迫处理）显著（P< 0.05）或极显著提高。【结论】MbACO2基因属于ACO基因家族成员,含有该家族的典型结构域,在粉蕉果实发育成熟过程及逆境胁迫的应答中发挥正向调控作用,高盐、干旱和低温胁迫处理均能诱导其上调表达。     

烟草抗马铃薯Y病毒病相关基因NtPsaN的克隆及表达分析

【目的】从高抗PVY烟草品种VAM中克隆抗病相关基因,分析该基因的序列特征、进化关系和表达特性,研究其在烟草抗PVY防御反应中的作用,为培育抗PVY烟草新品种奠定基础。【方法】利用SSH结合cDNA芯片筛选出来的病害诱导特异表达基因片段,通过RACE技术克隆烟草抗病相关基因;生物信息学分析该基因保守结构域以及序列特征;采用MEGA4.0软件构建系统进化树;利用实时荧光定量RT-PCR技术研究该基因的表达特性。【结果】克隆了1个烟草抗病相关基因,命名为NtPsaN,该基因具有PsaN基因家族保守结构域,OFR长度507bp,编码168个氨基酸;构建了PsaN亚基系统进化树;实时荧光定量RT-PCR结果显示接毒之后该基因表达与不接毒对照相比有明显上调趋势。【结论】克隆得到一个烟草PVY抗病相关基因NtPsaN,其表达受PVY侵染诱导,该基因可能在烟草抵御PVY病害侵染过程中起重要作用。     

玉木耳漆酶基因Aclac的克隆及原核表达

【目的】对玉木耳漆酶基因Aclac进行克隆及原核表达分析,为深入研究漆酶基因在玉木耳子实体发育中的生物学功能提供理论依据。【方法】克隆Aclac基因的cDNA和DNA全长序列,对其进行生物信息学分析,并将目的基因连接至pET-28a质粒上以构建原核表达载体pET28a-Aclac,将其转化大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达。【结果】克隆获得的Aclac基因cDNA序列长度为1734 bp,编码577个氨基酸残基;Aclac基因DNA序列长度为2521 bp,含14个内含子。AcLAC蛋白理论分子量为64.75 kD,理论等电点为5.70,不稳定指数为34.01,无跨膜区域,存在1个信号肽,在4个铜离子结合区高度保守,且含有Cupredoxin超家族蛋白保守功能域。AcLAC蛋白与真菌的漆酶蛋白聚为一支,其中,AcLAC蛋白与木耳属真菌的漆酶蛋白亲缘关系最近。AcLAC融合蛋白在大肠杆菌BL21（DE3）表达宿主中成功表达,分子量为67 kD。【结论】克隆获得的Aclac基因属于Cupredoxin超家族基因,可在原核表达系统中异源表达,推测其与其他真菌漆酶基因在生物学功能上具有一致性,丰富了真菌漆酶资源。     

内蒙古绒山羊CRABP I基因的克隆及表达

【目的】克隆内蒙古绒山羊视黄酸结合蛋白Ⅰ（cellular retinoic acid binding proteinⅠ,CRABPⅠ）基因的cDNA,进行蛋白结构的预测和表达分析,为绒山羊毛和绒形成的分子机理奠定基础。【方法】利用RT-PCR方法克隆内蒙古绒山羊CRABPⅠ基因序列,利用生物信息学方法预测其蛋白结构,采用实时荧光定量PCR探讨该基因在绒山羊4个胎儿日龄皮肤中的表达。【结果】内蒙古绒山羊CRABP I基因cDNA长679 bp（JN936490）,其开放阅读框为414 bp,氨基酸序列与其它物种相比具有较高的序列相似性。CRABP Ⅰ蛋白无明显的信号肽和跨膜区域,不存在N糖基化位点和O糖基化位点;蛋白二级结构主要由α 螺旋、β折叠和少量的转角及无规则卷曲构成。胎儿皮肤中CRABPⅠ基因在 90 d 的表达量明显高于100、120和130 d（P<0.05）。【结论】绒山羊的CRABPⅠ基因cDNA中的开放阅读框（open reading frame,ORF）在不同物种间较为保守,但种属特异性集中表现在第33和123氨基酸残基处,该基因在胎儿期的90 d表达量最大。     

黄瓜S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶全长DNA的克隆及表达分析

【目的】克隆黄瓜S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶基因的cDNA,并进行生物信息学和表达分析,为研究该基因的功能奠定基础。【方法】通过对乙烯利诱导黄瓜茎尖SSH文库的筛选,采用RT-PCR 和电子克隆技术,获得黄瓜CsSAHH基因的cDNA全长序列(NCBI编号：HQ444960, CsSAHH)。运用半定量RT-PCR,分析CsSAHH基因在乙烯利诱导后的茎尖和雌雄花不同部位的表达。通过生物信息学方法预测CsSAHH基因的蛋白结构。【结果】黄瓜CsSAHH基因的cDNA全长1 545 bp,编码485个氨基酸,其理论上的等电点pI＝5.66,分子量MW＝53.1 kD。CsSAHH基因在黄瓜茎尖受乙烯利诱导增强表达,在黄瓜雄花中的雄蕊表达较弱。CsSAHH理化性质表明,该蛋白无明显的信号肽;蛋白二级结构主要由loop 环和α螺旋构成,含少量的β折叠,预测发现该蛋白分别在85-99 氨基酸残基和262-279氨基酸残基处各有1个S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶活性功能区。CsSAHH基因氨基酸序列与苜蓿的同源性为63%,与水稻、玉米、拟南芥等作物同源性较低。【结论】成功克隆黄瓜CsSAHH基因cDNA序列,在85-99 氨基酸残基和262-279氨基酸残基处各有1个S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶活性功能区。该基因在茎尖受乙烯利诱导增强表达,在雄蕊中表达较弱。在未处理的雌雄花芽发育不同阶段,雌花芽中表达强于幼果和雄花芽。     

甘蔗MAP激酶基因SoMAPK4克隆与生物信息学分析

[目的]克隆甘蔗MAP激酶家族新基因的全长序列,为了解甘蔗抗逆胁迫机制提供依据.[方法]以新台糖22为材料,提取甘蔗幼叶总RNA并反转录为cDNA;利用已知物种MAP激酶基因核苷酸序列保守区设计引物,采用5′和3′端RACE技术克隆新基因全长,并进行生物信息学分析.[结果]克隆获得的甘蔗新基因与玉米ZmMAPK4同源性很高,达92.6%,将该基因命名为SoMAPK4(登录号JQ062930),基因全长1499 bp,其中开放阅读框(ORF)为1128 bp,5′非翻译区(UTR)为218 bp,3′非翻译区(UTR)为213 bp.生物信息学分析结果表明,SoMAPK4基因编码一个含376个氨基酸的蛋白质,分子量约43.5 kDa,等电点为5.51,含有11个保守的蛋白激酶亚区和MAP激酶的磷酸化位点TEY基序.[结论]克隆获得甘蔗MAP激酶新基因SoMAPK4,该基因可能参与多种胁迫反应的信号传递,是研究甘蔗非生物胁迫和生物胁迫过程中信号传递的一个关键因素.     

红鳍东方鲀组织蛋白酶L基因的电子克隆及序列分析

[目的]采用电子克隆技术克隆红鳍东方鲀组织蛋白酶L基因,并应用生物信息学技术分析其推导氨基酸的序列特征,为进一步探索其在免疫功能中的作用奠定基础.[方法]以斑马鱼的组织蛋白酶L核苷酸序列(Y08321.1)为探针,对红鳍东方鲀基因组数据库进行BLASTn分析,将检索到的匹配结果进行碱基3′端及5′端的适当延长,用DNAssist预测其编码信息;然后从GenBank获取若干物种组织蛋白酶L序列,用DNASTAR软件进行比对.[结果]红鳍东方鲀组织蛋白酶L基因全长2005 bp,含7个外显子和6个内含子;包含编码336个氨基酸的开放阅读框(1011 bp);其推导的氨基酸序列具有组织蛋白酶L所特有的氨基酸保守结构域(ERWNIN和GNFD)及由Cys25、His159和Ash175残基组成的保守活性位点,与青鳉、鲤鱼的组织蛋白酶L基因具有较高的序列一致性.[结论]红鳍东方鲀组织蛋白酶L的一些结构域和催化活性位点在进化过程中比较保守,与鱼类物种来源的组织蛋白酶L在氨基酸水平上一致性较高,在进化上亲缘关系较近.     

中华稻蝗几丁质酶基因10（OcCht10）的分子特性及功能

【目的】获得中华稻蝗（Oxya chinensis）几丁质酶基因10（OcCht10）的cDNA序列,预测其功能域,并做聚类分析明确该基因的系统发育关系。绘制OcCht10在5龄若虫不同组织部位和发育时间的表达图谱,研究其在中华稻蝗蜕皮过程中的生物学功能,为害虫防治提供高效安全的候选基因。【方法】从中华稻蝗转录组数据库搜索OcCht10 cDNA片段,经过blast分析、比对、拼接后,翻译为氨基酸序列,预测其功能域,并与其他昆虫几丁质酶家族基因进行聚类分析,进一步确认该基因的系统发育关系并进行准确命名;选取中华稻蝗5龄第6天不同组织部位及5龄若虫不同天数表皮样本,总RNA提取后反转录为cDNA模板,采用Real-time quantitative PCR（qPCR）方法获得OcCht10在5龄稻蝗若虫不同组织部位和不同发育阶段的表达谱;设计OcCht10 dsRNA引物,用试剂盒体外合成dsOcCht10,采用注射法进行RNA干扰;取注射24 h稻蝗表皮样本,用qPCR方法检测OcCht10基因沉默效率;并仔细观察dsRNA注射后稻蝗表型,统计其死亡率。【结果】经对中华稻蝗转录组数据库的搜索,获得OcCht10 cDNA片段长度为9 318 bp,开放阅读框为8 613 bp,编码2 870个氨基酸;其3′非编码区为705 bp,推测OcCht10 5'端有500多碱基尚未获得;预测其氨基酸序列具有多个结构域,包含有5个几丁质酶催化域和6个几丁质结合域;与其他昆虫几丁质酶基因聚类分析结果显示OcCht10属于昆虫几丁质酶家族基因Ⅱ组,该组基因与昆虫蜕皮相关;5龄若虫组织特异性分析表明该基因主要在表皮、前肠和后肠等外胚层发育而成的组织器官中表达,提示OcCht10可能参与表皮几丁质代谢;发育时间表达图谱表明该基因在5龄第6-7天,即蜕皮前的表皮中高表达,表明OcCht10可能负责蜕皮时表皮几丁质降解;5龄若虫第2天注射该基因的dsRNA,24 h后取表皮检测其干扰效率,结果显示该基因被沉默70%;与注射dsGFP的对照组相比,注射dsOcCht10 5龄若虫表现为龄期延长,旧表皮无法开裂,蜕皮受阻,昆虫无法正常活动导致死亡,死亡率达到100%。【结论】获得OcCht10的部分cDNA序列,该基因在昆虫蜕皮前表皮中高表达;OcCht10参与中华稻蝗的蜕皮发育,注射dsOcCht10可有效沉默靶基因,并导致试虫无法完成正常蜕皮而死亡。