弯曲杆菌多重PCR检测方法的建立

根据弯曲杆菌属细菌细胞致死性膨胀毒素cdtABC操纵子核酸序列,针对cdtA、cdtB、cdtC设计并合成了3对特异性引物,用于建立空肠弯曲杆菌、结肠弯曲杆菌和弯曲杆菌属细菌的多重PCR检测方法。试验证明,建立的多重PCR检测方法能鉴定弯曲杆菌属细菌,并区分出空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌。该方法具有较好的特异性与敏感性,适合在实验室对弯曲杆菌进行检测与鉴定。     

空肠弯曲杆菌SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）是一种人兽共患病病原菌,给养殖业带来了较大经济损失。为实现对空肠弯曲杆菌的快速检测,针对其MapA基因序列设计特异性引物,优化反应条件和反应体系,建立了空肠弯曲杆菌SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行了评估。结果显示：建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性,仅能特异性扩增出空肠弯曲杆菌,对胎儿空肠杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌无交叉反应;敏感性较强,最低检测限为6.42 copies/μL;以5个稀释度的重组质粒为模板分别进行组内和组间重复性试验,发现组内和组间Ct值变异系数（CV）均小于2.50%,说明该方法具有良好的可重复性。结果表明,本研究建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR具有良好的特异性、敏感性及重复性,可用于空肠弯曲杆菌的快速诊断和流行病学调查。     

猪源空肠弯曲杆菌的分离及鉴定

为了研究更快、更加准确分离空肠弯曲杆菌的方法,试验同时采用常规生化法对由12份猪盲肠内容物中分离的可疑菌进行检测,得到了6个阳性样品,经特异性PCR检测,2个样品可定性为空肠弯曲杆菌,检测时间为7 d;而对所得菌株直接进行PCR检测,检测结果相同,检测时间为2 d。结果表明:PCR可以快速、特异性地检测空肠弯曲杆菌,与常规生化检测法相比是一种更有效的方法。     

三种食源性致病菌多重荧光PCR检测方法的建立

根据沙门氏菌、空肠弯曲杆菌和单核增生李斯特氏菌的保守基因序列,设计特异性引物和以不同荧光素标记的探针。通过对荧光PCR反应体系和反应条件的优化筛选,建立了检测沙门氏菌、空肠弯曲杆菌和单核增生李斯特氏菌的三重荧光PCR检测方法。为了评价所建立的实时PCR检测体系的特异性,试验中选取了阳性菌株及干扰菌株进行特异性验证。同时对梯度稀释的纯化DNA和不同浓度引物探针进行检测以确定方法的灵敏度。结果表明,该方法有效、特异、敏感、稳定,对于动物产品中沙门氏菌、空肠弯曲杆菌和单核增生李斯特氏菌的快速检测具有重要应用价值。     

空肠弯曲杆菌基因分型方法的研究进展

空肠弯曲杆菌(campylobacter jejuni)是最重要的人类肠道致病菌之一。随着近年来分子生物学及相关技术的迅猛发展,空肠弯曲杆菌基因分型的方法因其分辨力、特异性、分型率、敏感性显著高于传统检测方法而越来越受到人们的重视。作者就空肠弯曲杆菌基因分型方法(RFLP 分型、AFLP 分型、RAPD 分型、PFGE分型、MLST分型)的研究进展作一简要综述。     

用PCR技术检测牛胎儿弯曲杆菌

在国内首次用ＰＣＲ技术检测牛胎儿弯曲杆蓖，试验结果表明，灭菌生理盐水中的胎儿弯曲杆菌胎儿亚种或性病亚种均可检出；而空肠弯曲杆菌，葡萄球菌，链球菌，大肠杆菌等均为阴性。本法特异性和灵敏度很高，甚至可检出样品中的一个菌体。应用前景良好。     

应用SYBR Green I的Real-time PCR方法定量检测空肠弯曲杆菌

空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)被认为是人类主要食源性病原菌之一。由于空肠弯曲杆菌特殊的生长条件和容易进入不可培养但存活的状态(Viablebutnonculturable,VNC),所以传统的生化鉴定结果不一定可靠,并且是一项费时而繁琐的工作。核酸检测方法的出现为空肠弯曲杆菌的检测带来了方便。本文基于LightCycler为平台,利用SYBRGreenI染料能特异与双链DNA结合而发荧光的特性,建立一种Real-timePCR方法来定量检测空肠弯曲杆菌。用该方法检测时,发现所有空肠弯曲杆菌(11株)都呈阳性,所有其它弯曲菌(3株)和其它菌株(5株)都是阴性。整个检测过程60min内可以完成,检测限度为5CFU,标准曲线的相关系数为1。结果表明基于SYBRGreenI的定量PCR方法既为空肠弯曲杆菌提供了一种特异、敏感、快速和简洁的定量检测方法,又为研究空肠弯曲杆菌致病机理提供了一种重要方法。     

基于TaqMan探针的Real-time PCR定量检测空肠弯曲杆菌

空肠弯曲杆菌 (Campylobacterjejuni ,C .jijuni)被认为是人类主要食源性病原菌之一。由于空肠弯曲杆菌特殊的生长条件和容易进入不可培养但存活的状态 (Viablebutnonculturable ,VNC) ,所以传统的生化鉴定结果并不一定可靠 ,并且是一项费时而繁琐的工作。核酸检测方法的出现为空肠弯曲杆菌的检测带来了方便。在本文基于LightCycler为平台 ,建立一种基于TaqMan探针的Real_timePCR方法来定量检测空肠弯曲杆菌。用该方法检测时 ,发现所有空肠弯曲杆菌 (11株 )都呈阳性 ,所有其它弯曲菌 (3株 )和其它菌株 (5株 )都是阴性。整个检测过程 6 0min内可以完成 ,检测限度为5CFU ,标准曲线的相关系数为 0 .988。结果表明荧光定量PCR方法既为空肠弯曲杆菌提供了一种特异、敏感、快速和简洁的定量检测方法 ,又为研究空肠弯曲杆菌致病机理提供了一种重要方法。     

用PCR技术检测牛胎儿弯曲杆菌

在国内首次用PCR技术检测牛胎儿弯曲杆菌(Campylobacterfetus),试验结果表明,灭菌生理盐水中的胎儿弯曲杆菌胎儿亚种或性病亚种均可检出;而空肠弯曲杆菌、葡萄球菌、链球菌、大肠杆菌等均为阴性。本法特异性和灵敏度很高,甚至可检出样品中的一个菌体。应用前景良好。     

直接从家禽排泄物中检测和定量空肠弯曲杆菌的逆转录定量PCR方法研究

弯曲杆菌属是导致人类细菌性腹泻的主要原因,亟需一种快速而可靠地检测和定量该病原的方法。本研究建立了运用逆转录荧光定量PCR直接从鸡粪便中检测和定量空肠弯曲杆菌的方法,并将其与另一种基于DNA的荧光定量PCR方法和细菌培养方法进行比较。运用细菌培养和逆转录荧光定量PCR方法,可在5d后从人工或天然污染的粪便样品中检测到空肠弯曲杆菌。在使用细菌培养方法无法计数细胞时,逆转录荧光定量PCR亦无法检测到阳性扩增信号,而运用基于DNA的荧光定量PCR方法可以检测到死亡的或无法培养的弯曲杆菌细胞,即使在经过20d保存处理后所有被检测样品仍是阳性。这种直接从鸡粪便样品中检测和定量空肠弯曲杆菌的方法在检测环境弯曲杆菌中的应用还有待进一步研究。     

雪貂空肠弯曲杆菌的分离与鉴定

从试验用雪貂分离到一株弯曲杆菌,通过菌落、菌体形态、生化特征、培养特性等生物学特性和PCR方法对所分离菌株进行鉴定,分离株经空肠弯曲杆菌VS1基因特异性引物PCR扩增为阳性,测序结果显示与空肠弯曲杆菌序列同源性达100%,结合生物学特性和PCR结果确定所分离菌株为空肠弯曲杆菌,该菌的分离鉴定为雪貂微生物检测标准的建立提供了理论依据。     

禽源空肠弯曲杆菌的分离与双重PCR鉴定

以空肠弯曲杆菌保守基因mapA和hipO基因为靶基因,建立空肠弯曲菌的双重PCR方法,该方法只对空肠弯曲菌有特异性,对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌等则不能扩增出特异性片段。利用该方法对从市场、养殖鸡和屠宰场的禽源空肠弯曲菌进行了分离和鉴定,平均分离率为35.8%,PCR鉴定结果与生化鉴定结果相一致,说明建立的双重PCR鉴定方法具有灵敏、特异的特点,可节省传统生化鉴定所耗费的时间,为空肠弯曲菌的检测提供新方法。     

多重PCR-变性高效液相色谱检测食品中空肠弯曲菌和结肠弯曲菌

本研究应用多重PCR反应(mPCR)结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术建立食品中空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的快速检测方法.以编码嗜热弯曲菌属的16S rRNA基因、编码空肠弯曲菌的gyrA基因和编码结肠弯曲菌的cdt真基因为靶基因,选择3对引物,建立并优化了鉴别空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的mPCR体系,扩增产物分别为287 bp、159 bp和173 bp.采用22株细菌验证了该mPCR具有特异性.mPCR检测的灵敏度在DNA水平上达到空肠弯曲菌10pg/μL、结肠弯曲菌1 pg/μL;在人工模拟污染样品起始污染浓度为1.5个/mL时,42℃微需氧条件下培养24 h即可被检出.在随机采集的172份冷冻鸡肉类样品中,检出了18份样品为空肠弯曲菌阳性,7份样品为结肠弯曲菌阳性.本研究建立的mPCR-DHPLC方法可特异、灵敏地实现对空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的快速检测.     

地高辛标记空肠弯曲菌DNA探针的研究

应用地高辛标记核酸技术将地高辛结合到空肠弯曲菌染色体ＤＮＡ上,制备了地高辛标记的ＤＮＡ探针。地高辛标记的空肠弯曲菌ＤＮＡ探针仅与空肠弯曲菌ＣＪ１、ＣＪ２发生反应,而与大脾性杆菌、鼠沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副结核分枝杆功不发生反应,具有很高的特异性,其敏感性可检测出０．２２ｎｇ的样品ＤＮＡ,较光敏生物素（８ｎｇ）、＾３２Ｐ同位素（４ｎｇ）标记的核酸探针高。     

副鸡禽杆菌LAMP检测方法的建立

应用环介导等温扩增(LAMP)技术建立了快速特异的检测副鸡禽杆菌的方法。利用在线引物设计软件Primer Explorer Version 4.0,针对副鸡禽杆菌16SRNA基因序列设计两组LAMP引物,并对副鸡禽杆菌特异性DNA的扩增条件进行优化,评价所建立LAMP的特异性和灵敏性。结果显示,优化后的反应条件为65℃恒温反应60min,内引物1.60pmol/μL、外引物0.20pmol/μL。该LAMP对13株副鸡禽杆菌均发生了扩增反应,而对大肠埃希菌、禽多杀性巴氏杆菌、空肠弯曲杆菌等14株其他病原微生物没有扩增反应;该LAMP最低检出量为0.17pg/反应,敏感性远高于常规PCR的56pg/反应。结果表明,所建立的副鸡禽杆菌LAMP具有快速、高效、方便操作等特点,适用于基层兽医部门进行副鸡禽杆菌的快速检测。     

牛弯曲杆菌性腹泻的诊治

牛弯曲杆菌病是由弯曲杆菌属细菌所引起的牛及其他动物的不同疾病的总称。与人畜有关的有2种病型，由胎儿弯曲杆菌引起的牛只不育与流产和主要由空肠弯曲杆菌引起牛及其他动物的急性肠炎。空肠弯曲杆菌目前有2个亚种，即空肠亚种和多伊尔亚种。空肠亚种与兽医学有关的是人畜共患病的重要病原菌。现介绍牛弯曲杆菌性腹泻的诊治方法。     

国内外动物食品安全的最新动态

1英国食品规范管理局制定空肠弯曲杆菌危害管理机制英国食品规范管理局(FSA)正在呼吁加强食品安全管理,实行对空肠弯曲杆菌进行分子生物学的检测和溯源调查。在英国,空肠弯曲杆菌是引起     

FHIT基因和Fhit蛋白在犬淋巴瘤细胞系中的畸变

空肠弯曲菌是人类主要食源性病原菌之一，其主要的储存宿主是家禽。据研究空肠弯曲杆菌主要定植于肉仔鸡的盲肠。从7个鸡群采集20份样本来检测弯曲杆菌，结果表明，平均发病率为65％。本试验还研究了48株空肠弯曲菌对INT～407细胞的黏附力和入侵力。用检测庆大霉素抗性的INT-407细胞对从盲肠内容物分离的48株空肠弯曲菌进行分析，盲肠分离菌株呈现出广泛的黏附力和入侵力，且菌株间的黏附力和入侵力呈显著相关（P〈0．01）。用PCR方法检测到空肠弯曲杆菌的毒力相关基因dnaJ、cadF、pldA、ciaB，检出率分别为100％、76％、31％、41％，     

空肠弯曲杆菌的分离鉴定

空肠弯曲杆菌是一种人畜共患病致病菌,作为一种食物源性病原菌,空肠弯曲杆菌能引起人和动物发生多种疾病,其治病机理正在被广泛的研究,本文主要介绍了目前空肠弯曲杆菌相关疾病的研究进展,以及通过实验介绍空肠弯曲杆菌的实验室分离及鉴定的一般方法。     

应用液相芯片检测空肠弯曲菌

[目的] 建立空肠弯曲菌液相芯片检测方法。[方法] 本研究将空肠弯曲菌HIP蛋白单克隆抗体与聚苯乙烯微球偶联,结合双抗体夹心技术建立空肠弯曲菌液相芯片检测方法,测定不同浓度的抗体与微球偶联率。通过L9（34）正交设计试验优化方法的反应条件,并进行灵敏度和特异性试验。[结果] 较优实验条件即多克隆抗体工作浓度为1:100、生物素标记的羊抗兔IgG工作浓度为1:500、SA-PE的工作浓度为10ug/mL、生物素标记的抗体与SA-PE反应时间为90min。该方法灵敏度可达103CFU/mL,与其他常见食源性致病菌无交叉反应。[结论] 该方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可快速检测食品中的空肠弯曲菌。