雪貂空肠弯曲杆菌的分离与鉴定

从试验用雪貂分离到一株弯曲杆菌,通过菌落、菌体形态、生化特征、培养特性等生物学特性和PCR方法对所分离菌株进行鉴定,分离株经空肠弯曲杆菌VS1基因特异性引物PCR扩增为阳性,测序结果显示与空肠弯曲杆菌序列同源性达100%,结合生物学特性和PCR结果确定所分离菌株为空肠弯曲杆菌,该菌的分离鉴定为雪貂微生物检测标准的建立提供了理论依据。     

应用PCR技术检测空肠弯曲菌及结肠弯曲菌的研究

本研究根据空肠弯曲菌及结肠弯曲菌的16s rRNA基因相同保守序列来设计引物,建立了一种PCR检测方法,该方法具有较强的特异性及灵敏性,其对空肠弯曲菌及结肠弯曲菌的最低检测限度为5 CFU/mL,它无需增菌培养过程可以直接对样品进行检验,在对鸡肉样品空肠弯曲菌及结肠弯曲菌的检测中取得了较好的效果.     

猪源空肠弯曲杆菌的分离及鉴定

为了研究更快、更加准确分离空肠弯曲杆菌的方法,试验同时采用常规生化法对由12份猪盲肠内容物中分离的可疑菌进行检测,得到了6个阳性样品,经特异性PCR检测,2个样品可定性为空肠弯曲杆菌,检测时间为7 d;而对所得菌株直接进行PCR检测,检测结果相同,检测时间为2 d。结果表明:PCR可以快速、特异性地检测空肠弯曲杆菌,与常规生化检测法相比是一种更有效的方法。     

多重PCR-变性高效液相色谱检测食品中空肠弯曲菌和结肠弯曲菌

本研究应用多重PCR反应(mPCR)结合变性高效液相色谱(DHPLC)技术建立食品中空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的快速检测方法.以编码嗜热弯曲菌属的16S rRNA基因、编码空肠弯曲菌的gyrA基因和编码结肠弯曲菌的cdt真基因为靶基因,选择3对引物,建立并优化了鉴别空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的mPCR体系,扩增产物分别为287 bp、159 bp和173 bp.采用22株细菌验证了该mPCR具有特异性.mPCR检测的灵敏度在DNA水平上达到空肠弯曲菌10pg/μL、结肠弯曲菌1 pg/μL;在人工模拟污染样品起始污染浓度为1.5个/mL时,42℃微需氧条件下培养24 h即可被检出.在随机采集的172份冷冻鸡肉类样品中,检出了18份样品为空肠弯曲菌阳性,7份样品为结肠弯曲菌阳性.本研究建立的mPCR-DHPLC方法可特异、灵敏地实现对空肠弯曲菌和结肠弯曲菌的快速检测.     

弯曲杆菌多重PCR检测方法的建立

根据弯曲杆菌属细菌细胞致死性膨胀毒素cdtABC操纵子核酸序列,针对cdtA、cdtB、cdtC设计并合成了3对特异性引物,用于建立空肠弯曲杆菌、结肠弯曲杆菌和弯曲杆菌属细菌的多重PCR检测方法。试验证明,建立的多重PCR检测方法能鉴定弯曲杆菌属细菌,并区分出空肠弯曲杆菌和结肠弯曲杆菌。该方法具有较好的特异性与敏感性,适合在实验室对弯曲杆菌进行检测与鉴定。     

空肠弯曲菌PEB1A蛋白的原核表达及间接ELISA方法的建立

为了建立检测血清中空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni）抗体的间接ELISA方法,试验通过PCR扩增并克隆空肠弯曲菌PEB1A基因,构建原核表达载体pET32a-PEB1A,将该表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,诱导表达获得约47 ku的可溶性目的蛋白,通过Western blotting证明所表达的重组蛋白具有良好的生物学活性。以纯化后的重组蛋白作为包被抗原,建立空肠弯曲菌抗体间接ELISA方法,对其特异性、敏感性、重复性进行检测。结果表明,本试验建立的空肠弯曲菌抗体间接ELISA检测方法临界值为0.3424,本方法仅与空肠弯曲菌阳性血清发生特异性反应,与其他抗血清无交叉反应,具有较强的特异性,批内、批间的重复性试验变异系数均<5%,具有较好的重复性和稳定性。该方法的建立可应用于血清中空肠弯曲菌抗体的快速检测,为进一步防制空肠弯曲菌腹泻提供依据。     

猪源结肠弯曲菌分离鉴定及细胞致死性膨胀毒素三重PCR分子检测

为了探明河南省及周边地区猪源结肠弯曲菌病(campylobacteriosis)的流行情况,本研究对从省内外的猪场和屠宰场采集的猪结肠及粪便样品,进行了病原菌的初步分离培养鉴定。对结肠弯曲菌细胞致死性膨胀毒素(cytolethal distending toxin,CDT)A、B、C型毒素基因进行了单一PCR检测与扩增,在此基础上建立了结肠弯曲菌细胞致死性膨胀毒素A、B、C型三重PCR检测方法。该三重PCR方法可同时扩增出结肠弯曲菌A、B、C毒素型基因,具有较好的特异性。从97份猪结肠样品中分离128株细菌,经16SrRNA基因扩增和结肠弯曲菌特异性引物PCR扩增,确定12株为结肠弯曲菌。本研究为猪源结肠弯曲菌的分离鉴定及结肠弯曲菌细胞致死性膨胀毒素A、B、C型毒素基因扩增提供基础,可用于猪源结肠弯曲菌的鉴定及毒素鉴定、食品安全检测与监测等。     

三种食源性致病菌多重荧光PCR检测方法的建立

根据沙门氏菌、空肠弯曲杆菌和单核增生李斯特氏菌的保守基因序列,设计特异性引物和以不同荧光素标记的探针。通过对荧光PCR反应体系和反应条件的优化筛选,建立了检测沙门氏菌、空肠弯曲杆菌和单核增生李斯特氏菌的三重荧光PCR检测方法。为了评价所建立的实时PCR检测体系的特异性,试验中选取了阳性菌株及干扰菌株进行特异性验证。同时对梯度稀释的纯化DNA和不同浓度引物探针进行检测以确定方法的灵敏度。结果表明,该方法有效、特异、敏感、稳定,对于动物产品中沙门氏菌、空肠弯曲杆菌和单核增生李斯特氏菌的快速检测具有重要应用价值。     

空肠弯曲菌荧光偏振抗体检测方法的建立

为建立血清中空肠弯曲菌抗体的荧光偏振检测(FPIA)方法,本研究对空肠弯曲菌的黏附蛋白PEB1A进行原核表达。Western blot鉴定显示该重组蛋白具有良好的抗原性;FITC标记空肠弯曲菌黏附蛋白PEB1A形成示踪物,通过确定示踪物的最佳反应浓度、反应时间及血清最佳稀释度,建立空肠弯曲菌的FPIA抗体检测方法。结果显示:本实验建立的空肠弯曲菌FPIA抗体检测方法的检测标准为FP值≥150m P为阳性,FP值150为阴性。该方法仅与空肠弯曲菌阳性血清发生特异性反应,与产肠毒素型大肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、金黄色葡萄球菌的抗血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法对抗体的最低检测效价为1∶80,批内和批间的重复性试验变异系数均小于10%,具有较好的重复性。表明本研究建立的FPIA方法为血清中空肠弯曲菌抗体的快速检测提供了一种可行的方法。     

大肠埃希菌PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速检测动物大肠杆菌病的方法,基于大肠埃希菌16S~23S rRNA基因序列分析,利用Premier 5.0软件设计并合成了一对特异性引物,建立了可检测16S~23S rRNA基因的PCR检测方法,通过反复试验确定了最佳PCR反应体系和反应条件,并评估了此方法的灵敏性和特异性。同时应用该方法对临床病料进行检测,检测结果与生化试验鉴定结果的符合率为100%。说明该方法具有良好的特异性和敏感性,与细菌分离培养、生化鉴定方法相比较有效降低了检测时间,提高了检测效率。     

BA—DOT—ELISA方法的建立及其在空肠弯曲菌鉴定上的应用

通过对实验条件的筛选,建立了BA—DOT—ELISA的工作程序。在该程序中,应用抗空肠弯曲菌共同抗原的单克隆抗体,对空肠弯曲菌进行了鉴定。本方法具有较强的特异性。在参试的15种其它细菌中,除与幽门弯曲菌出现弱阳性反应外,与其它细菌均为阴性反应。其敏感性可达1.6×10~5cell/ml。对不同地区、不同来源的148株空弯菌进行鉴定,结果均为阳性反应,与常规鉴定法的结果一致。这为空肠弯曲菌的鉴定提供了一种特异、敏感、快速的方法。 DOT—ELISA是近几年发展起来的一项新技术,具有简便、经济、不需要特殊仪器、结果可长期保存的优点,自八十年代初期问世以来,已得到较广泛的应用。将生物素一亲和素(BA)系统引入酶联免疫吸附试验,提高了ELISA的敏感性,但在DOT—ELISA中的应用效果如何,尚有待探讨。本研究应用抗空肠弯曲菌共同抗原的单克隆抗体和BA系统,建立了BA—DOT—ELISA的工作程序,并应用这种方法对空肠弯曲菌进行快速鉴定,取得了较满意的结果,现简要报告如。     

鸡白痢与鸡伤寒沙门菌双重PCR方法的建立和初步应用

分析不同血清型/生物型沙门菌全基因组序列筛选出鸡白痢和鸡伤寒沙门菌特异性基因组序列,设计两对引物,建立双重PCR方法鉴别检测鸡白痢和鸡伤寒沙门菌不同生物型,并进行初步的临床应用。双重PCR方法结果显示,鸡白痢沙门菌显示417 bp条带,鸡伤寒沙门菌显示417 bp和636 bp两个条带,而阴性对照未出现条带,与预期设计相符。双重PCR体系对56株不同血清型沙门菌鉴定结果与细菌学分离的血清型鉴定结果完全一致,说明本试验建立的双重PCR体系特异性良好,应用上述方法检测鸡场疑似20份临床样本,结果发现8株鸡白痢沙门菌阳性,1株鸡伤寒沙门菌阳性。上述结果表明,已建立双重PCR方法特异性检测鸡白痢和鸡伤寒沙门菌。本试验为鸡白痢和鸡伤寒不同生物型沙门菌的检测提供了一种简洁、敏感、特异的新方法。     

丹顶鹤空肠弯曲菌感染情况调查

对江苏省盐城国家级珍禽自然保护区丹顶鹤中空肠弯曲菌带菌情况进行监测,共采集泄殖腔标本80份,采用国标法,并用API Campy System进行了生化与分类鉴定,结合弯曲菌多重PCR检测方法,共检出弯曲菌17株,阳性率为21.67%,其中空肠弯曲菌10株。结果表明,丹顶鹤弯曲菌的感染与年龄有关,未成年丹顶鹤弯曲菌阳性率极显著地高于成年丹顶鹤;同时对部分菌株用琼脂扩散法进行药敏试验。     

弗劳地枸橼酸杆菌分离鉴定及其三重PCR检测方法的建立

为鉴定导致鲫鱼嘴部溃烂、肛门红肿、腹部有出血点症状的病原菌,并建立一种快速检测该病原菌的方法,本研究采用形态学、生理生化特性分析及16S rDNA序列分析方法从患病鲫鱼中分离鉴定病原菌株,并进行了动物回归实验。结果显示,从患病鲫鱼中分离菌株为弗劳地枸橼酸杆菌(Citrobacter freundii),命名为fsznc-08,该菌对鲫鱼具有致病性。针对该菌GalF基因、petA基因和FliC基因设计了3条特异性引物,通过对反应体系和条件的优化,建立了检测该菌的三重PCR方法,结果显示,三重PCR方法可准确扩增出弗劳地枸橼酸杆菌GalF、petA和FliC 3个目的基因,而其它菌株均未扩增出目的基因,特异性良好;该方法对该菌DNA最低检出限为6.09×10~1拷贝/μL。利用该方法检测人工感染患病鱼样品的阳性率约为93.33%,与单一PCR方法的检测率一致,但特异性和敏感性均高于单一PCR。本实验建立的弗劳地枸橼酸杆菌三重PCR检测法具有特异性强、敏感性高、操作简单、成本低的优点,为临床弗劳地枸橼酸杆菌的检测提供可行方法。     

鸡白痢沙门菌等位基因特异性PCR检测方法的建立

根据鸡白痢沙门菌与鸡伤寒沙门菌的rfbS基因在第237和第598位碱基的不同，设计和合成了等位基因特异性PCR引物，建立了快速检测鸡白痢沙门菌的PCR方法，并应用该方法对鸡白痢沙门菌临床分离样品进行了PCR鉴定。结果显示，该PCR方法能够特异性地鉴定鸡白痢沙门菌，检测灵敏度达100PgDNA。对35个经常规方法鉴定的鸡白痢沙门菌分离株应用等位基因特异性PCR方法进行鉴定，鉴定出33株鸡白痢沙门菌，符合率为94．3％。表明，建立的等位基因特异性PCR方法能够准确而快速地鉴定鸡白痢沙门菌。     

库尔勒市牛源空肠弯曲菌的分离鉴定及耐药性分析

了解库尔勒市牛源空肠弯曲菌流行及耐药性状况,为空肠弯曲菌的防控与临床用药提供理论基础。采用特异性选择培养基培养并结合PCR法对新疆库尔勒市及其周边牛养殖场采集的787份肛拭子样品进行空肠弯曲菌的分离鉴定,并采用纸片扩散法对牛源空肠弯曲菌分离株进行10类23种抗菌药物的耐药性检测。结果共分离到空肠弯曲菌38株,总分离率为4.83%(38/787); 38株空肠弯曲菌对克林霉素、四环素、氨苄西林、林可霉素、阿莫西林、头孢噻肟、头孢曲松表现高度耐药,耐药率均达80%以上;对美罗培南的敏感性最高,耐药率为0。研究表明,库尔勒市存在牛源空肠弯曲菌的流行隐患,空肠弯曲菌分离株对不同药物的耐药性存在差异,且耐药谱具有多样性,多重耐药情况普遍,应引起各部门的高度重视。     

空肠弯曲杆菌SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

空肠弯曲杆菌（Campylobacter jejuni）是一种人兽共患病病原菌,给养殖业带来了较大经济损失。为实现对空肠弯曲杆菌的快速检测,针对其MapA基因序列设计特异性引物,优化反应条件和反应体系,建立了空肠弯曲杆菌SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性、重复性进行了评估。结果显示：建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性,仅能特异性扩增出空肠弯曲杆菌,对胎儿空肠杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌无交叉反应;敏感性较强,最低检测限为6.42 copies/μL;以5个稀释度的重组质粒为模板分别进行组内和组间重复性试验,发现组内和组间Ct值变异系数（CV）均小于2.50%,说明该方法具有良好的可重复性。结果表明,本研究建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR具有良好的特异性、敏感性及重复性,可用于空肠弯曲杆菌的快速诊断和流行病学调查。     

食品中常见病原菌多重PCR检测方法的建立

根据基因库中沙门氏菌、空肠弯曲杆菌、单核细胞增生李斯特菌和大肠杆菌O157：H7的invA、MapA、hlyA和O gene cluster基因分别设计了4对引物,通过对反应条件的优化,建立了同时检测4种病原菌的多重PCR方法。结果表明,该多重PCR方法可扩增出四条特异性条带,并且任意两条产物片段长度相差大于20％。多重PCR反应体系检测四种病原菌混合模板最低含量为100 CFU。该多重PCR检测方法具有快速、准确和特异性强的优点,可用于快速检测食品中的病原菌。     

15株禽源空肠弯曲菌的分离鉴定及CheW基因序列分析

为了解四川地区禽源空肠弯曲菌流行菌株的感染情况及其Che W基因的变异特点,本研究于四川地区采集禽源盲肠及内容物对空肠弯曲菌进行分离并纯化培养,将分离菌株进行染色镜检、生化试验、16S r RNA基因PCR鉴定,并对分离株的Che W基因进行克隆测序,选取Gen Bank中登录的10株国内外空肠弯曲菌菌株与分离株进行Che W基因的序列分析及遗传进化分析。结果显示:分离株经纯化培养于哥伦比亚血琼脂培养基上后出现无溶血现象的菌落;革兰染色为阴性;生化代谢类型较稳定且与相关报道一致;16S r RNA基因序列与空肠弯曲菌(NCTC11168、YQ2210)等菌株同源性为99%以上。15株分离菌株的Che W基因的核苷酸序列与所选参考株一致性为98.68%,其推导的氨基酸序列同源性一致性在98.9%以上。其中鹌鹑源分离株CJ-1、CJ-2、CJ-4、CJ-13、CJ-14在第22位和161位均出现单个碱基的置换为A→G。本实验中分离菌株均为空肠弯曲菌且分离菌株之间Che W基因保守性强,遗传变异动态性较弱。本研究为空肠弯曲菌遗传变异方面的相关动态研究提供参考依据。     

弯曲菌荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

根据弯曲菌16S rRNA基因的靶序列设计特异性引物和探针,对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了快速检测鸡肉中弯曲菌的荧光定量PCR方法,并对其特异性、敏感性和重复性进行评价。该方法除了对弯曲菌有扩增曲线外,对其他常见食源性病原菌均未有扩增曲线,具有较好的特异性;弯曲菌的最低检测限为10 CFU/mL;重复性实验获得标准曲线相关系数为R2=0.999,批内可重复性变异系数在0.12%-2.1%之间,批间可重复性变异系数为1.7%。应用该方法对68份鸡肉样品检测弯曲菌阳性率为95.6%（65/68）,传统分离方法阳性率为89.5%（60/68）,两种方法的阳性符合率为89.7%。本研究建立的荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性好、操作简单,大大缩短检测周期,可作为检测鸡肉样品中弯曲菌的手段,为鸡肉样品弯曲菌的流行病学调查研究提供新的工具。