鱼腥草内生真菌的分离、鉴定及抑菌活性研究

[目的]分离和鉴定鱼腥草中的内生真菌,并检测其发酵液抑菌活性。[方法]用组织块法分离内生真菌,通过形态分类学方法进行鉴定,并用滤纸片法对4种指示菌进行体外抑菌试验。[结果]从鱼腥草各器官中共分离得到13株内生真菌。其中,根中1株,茎中10株,叶中2株;经形态鉴定,其分别属于子囊菌纲的毛壳菌属和半知菌亚门的曲霉属、镰孢属、茎点霉属及丝核菌属;12株内生真菌发酵液对至少1种指示菌有抑菌活性,而2株内生真菌的发酵液具有强抑菌活性。[结论]鱼腥草中存在具抑菌活性的内生真菌,可作为筛选抑菌活性物质的新资源。     

灯盏花内生真菌分离及其产黄酮内生真菌的初步研究

【目的】本研究对昆明市寻甸县人工栽培的大田灯盏花的根、茎、叶、花的内生真菌进行分离鉴定,旨在筛选产黄酮的内生真菌菌株。【方法】采用纯培养方法分离植物内生真菌,利用形态鉴定及显色反应筛选产黄酮内生真菌。【结果】共获得内生真菌40株,经显微形态观察40株内生真菌初步分类鉴定为14个属。通过黄酮类物质特异颜色反应,筛选到7株内生真菌产黄酮类物质,这7株内生真菌经初步鉴定为交链孢属(Alternaria sp.)、镰孢霉属(Fusarium sp.)、痕格孢属(Sirosporium sp.),根中内生菌产黄酮最高质量浓度为2.625 mg/L。【结论】灯盏花不同部位内生真菌的数量、分布和种群存有差异性,从根部分离到的内生真菌产黄酮类质量浓度最高。     

蛇足石杉内生真菌生物学性状及发酵产物研究

研究蛇足石杉内生真菌的生物学性状及其液体发酵产物中植物激素和酶类,结果显示:推测蛇足石杉内生真菌分别属于木霉属、曲霉、峡筒串孢霉属、聚孢霉属;从根毛细胞中发现内生菌菌丝,而在其他部位菌丝都以胞外菌丝状态存在;2株内生真菌能够分泌IAA,3株真菌发酵液具有PPO活性,3株真菌发酵液具有POD活性.     

八种肺衣属地衣内生真菌的鉴定及抗菌活性研究

采用平板分离法,从四川省黄龙、九寨沟等地采集肺衣属(lobaria sp.)地衣中分离内生真菌,分别对其进行液体发酵后检测发酵液的抑菌活性,并对具有抑菌活性的内生真菌进行形态学及分子生物学鉴定。结果表明,分离得到37株内生真菌,其中有8株内生真菌的发酵液具有一定的抑菌活性,分别属于黑孢属、链格孢属、镰刀菌属和木霉属等。     

金银花中产绿原酸内生真菌的分离与鉴定

以不同产区金银花的不同部位为材料,采用组织块法对金银花内生真菌进行分离鉴定,并结合TLC法和HPLC法对菌株发酵液进行定性分析.结果表明,共分离得到内生真菌80株,分属于5目、5科、10属,筛选出3株产绿原酸的菌株,均属于链格孢属.金银花中存在着丰富的内生真菌,不同产区及不同部位间内生真菌的种类和数量均存在差异,河南新密产绿原酸活性菌株较多.     

一株银杏内生裂褶菌的鉴定及其产黄酮的初步研究

为了解银杏内生真菌产黄酮情况,对从贵州大学校园银杏树叶中分离到的一株内生真菌GZUY201进行鉴定及产黄酮的研究。菌株鉴定利用形态学和分子生物学相结合的方法,并通过HPLC法测定其产黄酮的含量。鉴定菌株GZUY201为裂褶菌(Schizophyllum commune Fr.),菌株发酵液和菌丝体产黄酮苷元槲皮素量可达40.8 mg.L-1和101.7 mg.g-1。银杏内生裂褶菌可产黄酮苷元槲皮素,可作为生产银杏黄酮的候选菌株。     

甘草内生真菌的分离及产黄酮类化合物菌株的筛选

对甘草根、茎、叶中的内生真菌进行分离,并采用黄酮物质显色反应法对42株内生真菌的发酵液进行检测,结果显示,共得到菌株42株,其中26株分离自根,9株分离自茎,7株分离自叶。其中10株菌的显色反应呈阳性,说明能够产生黄酮类物质,这10株菌中,有7株来自根,1株来自茎,2株来自叶。进一步利用比色法对这10株菌发酵液中的总黄酮含量进行了测定,结果表明,菌株GF1-8、GF3-5、GF3-2有较高的黄酮产量,发酵液中总黄酮含量分别为0.138mg·mL-1、0.125mg·mL-1、0.102mg·mL-1,3株菌均分离自根。     

雪松内生真菌的分离及抑菌活性研究

采用组织分离法,从健康的雪松松针中分离纯化得到11株内生真菌。通过平板对峙和抑菌圈法将11株内生真菌分别对10株供试病原菌进行抑菌活性试验,结果显示内生真菌至少对1株供试病原菌存在抑菌活性。内生真菌发酵液抑菌试验结果显示N03菌株对苹果腐烂菌(Cytospora mandshurica)抑制率达到80.56%,N06菌株对辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)抑制率达到80.74%。N03菌株不同天数的发酵液抑菌活性研究表明,发酵液的抑菌活性与内生真菌的生物量相关。     

青钱柳内生真菌多样性及其代谢产物的特性

为揭示青钱柳内生真菌的分布、多样性及其代谢产物的抑菌活性,并筛选产黄酮的内生真菌,挖掘植物内生真菌新资源,采用组织分离的方法对青钱柳的枝、皮、叶、根部位的内生真菌进行分离,用马丁氏培养基、察氏培养基、PDA培养基对内生真菌进行培养,通过观察内生真菌的形态特征进行初步分类,同时提取其发酵产物,并以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌为供试病原菌对分离的内生真菌进行抑菌活性试验,通过显色试验和薄层层析试验筛选出产黄酮的内生真菌.试验共分离得到67株内生真菌,通过菌落形态和显微形态对分离得到的青钱柳内生真菌进行分类,其分别隶属于3纲4目6科10属;青钱柳不同组织中内生真菌的分离结果不同,其中根部分布的内生真菌从数量和种属上都占优势;马丁氏培养基培养的菌株种类少、数量多,而察氏培养基和PDA培养基培养的菌株种类较多、菌株较少;抑菌试验共得到13株具有抑菌作用的内生真菌,其中有2株内生真菌的发酵产物对供试菌株均表现出较强的抑菌活性,分别属于青霉属和链格孢属;并且筛选出7株菌株(PP03、PY01、PG11、PZ06、PY12、PP12和PP06)具有稳定的产生黄酮类化合物的能力.     

银杏产黄酮内生真菌的分离与鉴定

为了保护银杏资源,寻找生产黄酮类物质的替代品,采用选择性培养基,从银杏Gingkgo biloba L.的根、茎和叶中分离7株内生真菌,经高效液相色谱分析,证实3株内生真菌可产生槲皮素和山萘素类黄酮物质,其中内生真菌Enf 7的黄酮产量最高,达到70mg·100g-1干菌丝,可作为生产银杏黄酮的候选菌株.根据真菌的孢子结构、菌丝形态、菌落生长速度等形态学特征,结合核糖体RNA基因的居间序列(internal transcribed spacer,ITS)的碱基差异,确定3株产黄酮内生真菌分别属于安培菌属的白粉菌寄生菌Anpelomyces humuli、茎点霉属的头状茎点霉Phoma glomerata和镰孢属的茄镰孢Fusarium solani.     

顶孢霉菌(Acremonium hansfordii)液体培养最适条件及杀蚜毒力的研究

对自然感病的桃蚜幼虫上获得的顶孢霉菌株(Acremonium hansfordii)的最适培养条件及对甘蓝蚜的致病力进行了研究.结果表明,顶孢霉菌生长和产孢的最佳碳源为木糖,菌丝生物量和产孢量分别为1.806 mg/mL和7.061×106个孢子/mL;最佳氮源为尿素,其菌丝体含量和产孢量分别为0.242 mg/mL和54.07×106个孢子/mL;最适于顶孢霉菌菌丝生长和产孢的C/N为10∶1.液体培养至6-7 d时,菌丝生物量和产孢量均达到高峰,因此液体发酵终止时间应选择在接种后6-7 d.在接种后的第6 d,顶孢霉菌对甘蓝蚜的LC50为1.650×106个孢子/mL.     

鹿蹄草素对几种果蔬采后病原真菌的离体抑制作用研究

为寻找天然果蔬防腐剂,在离体条件下,采用生长速率法和培养板连续稀释法研究了鹿蹄草素对几种果蔬采后病原真菌的抑制效应,并对其最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)进行了初步确定。结果表明:鹿蹄草素的浓度越高,抑菌率越高,在2.5 mg/mL及以上浓度时对供试病原真菌均有较好的抑制效果。根据EC50值所得到的抑制作用由强到弱依次为链核盘菌(Monilinia fructicola),苹果轮纹病菌(Physalosporapiricola),链格孢菌(Alternaria alternata),根霉菌(Rhizopus stolonifer),灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)。其中链核盘菌的MIC和MBC分别为:0.156,1.25 mg/mL;苹果轮纹病菌的MIC和MBC分别为:0.078,0.156 mg/mL;链格孢菌的MIC和MBC分别为:0.313,0.625 mg/mL;灰葡萄孢菌的MIC和MBC分别为:0.156,0.313 mg/mL。     

2种野外采集白腐真菌分离及其产漆酶液体培养基优化

[目的]优化2种野外采集白腐真菌菌丝产漆酶液体培养基。[方法]对2种采集的白腐真菌轮纹韧革菌(Stereum ostrea)和朱红密孔菌(Pycnoporus cinnabarinus)通过分离纯化得到白腐真菌菌丝,应用ABTS法测定其产漆酶活性,研究碳源、氮源、金属阳离子、p H、温度、转速对白腐真菌产漆酶的影响。[结果]轮纹韧革菌最佳培养基是葡萄糖20.00 g、硝酸钾5.00 g、NaH_2PO_45.00 g、Cu SO41.00 g、初始p H 6、温度25℃、转速170 r/min,在第11天其产漆酶活性达到最大,为1.557 U/m L,是PDA液体培养基产漆酶活性的2.7倍。朱红密孔菌最佳培养基是麦芽糖25.00 g、酵母膏5.00 g、NaH_2PO_41.00 g、KCl 2.00 g、初始p H 7、温度30℃、转速200 r/min,在第9天其产漆酶活性达到最大,为1.478 U/m L,是PDA液体培养基产漆酶活性的2.3倍。[结论]筛选出2种野外白腐真菌产漆酶最佳培养基,为漆酶的进一步研究提供了参考。     

猕猴桃病原真菌拮抗菌筛选

为控制猕猴桃真菌病害,本研究使用平板对峙法,从34株青蒿内生真菌中筛选出对5种常见猕猴桃病原真菌(Botryosphaeria dothidea、Collectotrichum sp.、Monilinia laxa、phoma sp.、Alternaria alternata)具有广谱高效拮抗作用的菌株,并采用菌丝生长速率法检测了拮抗菌株发酵液及其发酵液粗提物对猕猴桃病原真菌的抑菌活性。结果表明:在平板对峙试验中,21号青蒿内生真菌具有较好的抑菌活性,对猕猴桃软腐病病原菌的抑制率高达81.16%,对其他几种猕猴桃病原真菌的抑制率也均在50%以上;21号菌株发酵液在浓度为20%时,对Botryoshaeria dothidea,Collectotrichum sp.,Alternaria alternate三种病害菌的抑制率分别达到了80.26%、79.12%、45.84%;在1 mg/mL浓度下,21号菌株发酵液乙酸乙酯粗提物对Monilinia laxa、phoma sp.的抑菌活性分别达到了100%、60.45%。研究表明21号菌株发酵液乙酸乙酯粗提物能有效抑制猕猴桃病害菌株,值得进一步研究。     

蒲公英内生真菌的分离、鉴定及抑菌活性研究

蒲公英为药食同源的一种传统植物,具有较好的抗菌消炎的功能,蒲公英提取物中含有多种具有抗菌活性的化合物,而植物内生真菌可产生与宿主植物相同或相似的代谢产物,可为抗菌化合物的开发利用开辟新途径。从蒲公英中分离获得蒲公英内生真菌,并选取金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、铜绿假担孢菌(Pseudomonas aeruginosa)、白色念珠球菌(Candida sporogenes)等病原菌进行抑菌试验,对蒲公英内生真菌发酵产物进行了抑菌活性筛选,其中菌株PGY5具有较好的抑菌活性,对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度(MIC)值为0.16 mg/m L,最小杀菌浓度(MBC)值为0.31 mg/m L。对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、肠炎沙门氏菌、铜绿假单孢菌和白色念珠菌也具有明显的抑菌效果,最小抑菌浓度(MIC)值分别为0.31 mg/m L,最小杀菌浓度(MBC)值为0.63 mg/m L。通过对菌株PGY5的ITS r-DNA序列进行比对分析,菌株PGY5为烟曲霉菌(Aspergillus fumigatus),与Aspergillus fumigatus JQ356539具有100%的相似性。通过LC-MS/MS检测在内生真菌PGY5乙酸乙酯层中发现了一种活性成分木犀草苷,其常存在于蒲公英叶中。     

高产漆酶白腐真菌的筛选

以6种白腐真菌作为供试菌株,5种食用菌作为对照菌株,采用愈创木酚及α-萘酚基质平板显色法,依据漆酶催化氧化还原反应产生显色圈的直径大小及变色程度对产漆酶菌株进行初筛;并采用ABTS酶活力测定法对菌株进行复筛。结果表明,11种真菌均具有分泌漆酶的能力,得到5株高产漆酶的白腐真菌菌株,由强至弱排列依次为朱红栓菌[Trametes cinnabarina(Jacq.∶Fr.)Fr]、木蹄层孔菌[Pyropolyporus fomentarius(L.Ex F.)Teng]、单色云芝[Coriolus unicolor(L.∶Fr.)Pat]、轮纹韧革菌[Stereum ostrea(Bl.et Nees)Fr.]和宽鳞棱孔菌[Favolus squamosus(Huds.ex Fr.)Ames],酶活力分别为23.47、20.26、19.52、18.39、17.93 U/m L。     

褐多孔菌发酵代谢物的抑菌活性初步研究

采用滤纸片法和生长速率法分别研究了褐多孔菌发酵代谢物对7种常见细菌和6种植物病原菌的抑制作用。结果表明,发酵液乙酸乙酯部分对金黄色葡萄球菌、巨大芽孢杆菌抑制效果显著,最小抑菌浓度分别为2.50 mg/mL和1.25 mg/mL,浓度为0.5 mg/mL时对小麦赤霉病菌抑菌率达到100%,菌丝乙酸乙酯部分对蜡状芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌最小抑菌浓度分别为1.25mg/mL和0.625 mg/mL,对白菜黑斑病菌和小麦赤霉病菌抑菌率均高于70%,菌丝及发酵液正丁醇部分对几乎所有病原菌抑制作用都很明显。     

克百威和灭多威的高效液相色谱法分离测定

采用高效液相色谱—紫外检测法,对克百威和灭多威2种N-甲基氨基甲酸酯类农药进行分离检测。在最佳色谱分离条件下(以甲醇∶水=60∶40作为流动相,紫外检测波长为220 nm;流速为1.1 mL/min),克百威和灭多威在4 min内达到基线分离。方法的线性范围良好,克百威和灭多威的相关系数分别为0.998 8和0.999 8,最小检测浓度分别为0.010 mg/mL和0.005 mg/mL。     

菊芋叶片提取物抑菌活性研究

采用生长速率法测定菊芋叶片5种有机溶剂提取物对3种植物病原真菌的抑菌效果。结果表明,菊芋叶各溶剂提取物对3种真菌均存在一定的抑制作用,其中丙酮提取物抑菌效果最好,25.0mg/mL丙酮提取物对辣椒灰霉菌的抑菌率达到90.46%±0.535%;各溶剂提取物针对不同的病原真菌最低抑菌浓度(MIC)不同,丙酮提取物对辣椒灰霉菌的MIC最小;为充分利用菊芋资源和进一步研发新型植物源杀菌剂奠定了基础。     

狭叶坡垒枝叶粗提物抑菌活性研究

采用菌丝生长速率法,以西瓜枯萎菌(Fusarium oxysporum Schl.f.sp.cucumerirum Owen)、烟草赤星菌[Alternaria longipes(Ell.et Eu)Tisdale et Wadk]、香蕉大灰斑菌[Curvularia lunata(Wakker)Boedijin]、烟草灰霉菌(Botrytis cinerea Pers)和水稻纹枯菌(Rhizoctonia solani Kuhn)为靶标,对采自广西十万大山的16种植物的甲醇粗提物进行了生物活性筛选,结果表明,狭叶坡垒(Hopea chinensis Hand.Mass)、水茄(Solanum touvum Swartz)等7种植物粗提物对5种供试真菌均有活性,其中狭叶坡垒抑菌活性最为显著;进一步测定了狭叶坡垒石油醚萃取层、乙酸乙酯萃取层及水萃取层对玉米大斑菌(Helminthosporium turcicum Pass)、稻胡麻叶斑菌(Helminthosporium oryzae Breda de Haan)和西瓜枯萎菌(F.oxysporum Schl.f.sp)等21种供试植物病原真菌的生物活性,结果表明,5 mg/mL狭叶坡垒乙酸乙酯萃取物的抑菌活性最强,对水稻恶苗菌[Gibberella fujikuroi(Saw)Wollenw]、香蕉黑条叶斑菌(Mycosphaerella fijiensis Marelet)和香蕉褐缘灰斑菌(Cercospora musae Zimm)等18种植物病原菌均有一定抑制作用,其中对烟草黑胫病菌(Phytophthora nicotianae Breda)的抑制率达100%,对香蕉叶缘枯菌(Alternaria musae Bour.et Bat)、香蕉大灰斑菌[Curvalaria lunata(Wakker)Boedijin]、甘蔗凤梨病菌[Ceratocystis paradoxa(Dade)Moreau]、甘蓝黑斑菌[Alternaria brassicola(Schw.)Wiltshire]和水稻纹枯菌(R.solani)的抑制率分别为89.00%、94.12%、90.35%、89.93%和85.13%。对烟草黑胫病菌(C.nicotianae)、香蕉叶缘枯菌(A.musae)、香蕉大灰斑菌(C.lunata)、甘蔗凤梨病菌(C.paradoxa)、甘蓝黑斑菌(A.brassicola)和水稻纹枯菌(R.solani)的EC50分别为:0.475 8,2.642 9,0.614 7,0.467 4,0.977 7,3.463 7 mg/mL。对甘蔗凤梨病菌(C.paradoxa)、甘蓝黑斑菌(A.brassicola)进行孢子萌发实验,其EC50分别为0.716 6 mg/mL、1.784 4 mg/mL。研究结果为进一步研究狭叶坡垒枝叶中的抑菌活性成分提供了基础数据。