新孢子虫荧光PCR检测方法的研究

根据已知的犬新孢子虫种属特异性基因片段Nc-5基因序列,设计荧光定量PCR引物和荧光探针,经反应条件的优化,建立了检测新孢子虫的荧光定量PCR方法。该方法的检测灵敏度为10拷贝/反应。通过对系列稀释的重组质粒进行重复性检测,Ct值的变异系数为0.50%~1.18%。应用该方法对50份牛全血和8份流产胎儿样本进行检测,有5份全血和1份流产胎儿样本为阳性,阳性检出率均为10.3%,比普通PCR方法阳性检出率（7%）高。且具有较好的特异性和可重复性,可用来对新孢子虫病快速准确检测。     

鲤春病毒血症病毒SYBR GreenⅠ荧光定量RT-PCR方法的建立

为建立鲤春病毒血症病毒(SVCV)的荧光定量RT-PCR检测方法,本研究根据Gen Bank中登录的SVCV N蛋白基因的保守性序列设计并合成特异性引物,建立了该病毒的SYBR Green I荧光定量RT-PCR检测方法。结果表明,以重组质粒标准品构建的标准曲线的相关系数为0.99,在102拷贝/μL~109拷贝/μL范围内具有良好的线性关系。该方法对传染性脾肾坏死病毒、草鱼呼肠孤病毒、传染性皮下及组织坏死病毒和白斑综合征病毒其他水生动物病毒核酸扩增结果均为阴性,特异性强;该方法对SVCV检测下限为100.76 TCID50/m L,比常规PCR灵敏100倍;批内和批间的变异系数均小于7.6%,重复性好。本研究建立的荧光定量RT-PCR方法灵敏度高、特异性强、重复性好,对SVCV的快速检测及定量检测具有重要意义。     

隐孢子虫三种实时荧光定量PCR检测方法的比较

为筛选一种检测谱广、敏感性好、特异性高的隐孢子虫实时荧光定量PCR法,对JVAP18S法、Csp18S法和CRU18S法三种隐孢子虫实时荧光定量PCR方法的敏感性、特异性和重复性进行了检测,并与基于18S r DNA序列的套式PCR方法进行了比较。结果显示,以10倍倍比稀释的含有微小隐孢子虫18S r DNA基因片段的重组质粒为模板,成功地建立了三种实时荧光定量PCR方法;敏感性试验显示,JVAP18S法和Csp18S法最低可检测0.1个卵囊,而CRU18S法最低只能检测到1个卵囊,但他们均比套式PCR方法敏感;特异性试验结果显示,三种实时荧光定量PCR法均可检测微小隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)、泰泽隐孢子虫(Cryptosporidium tyzzeri)和贝氏隐孢子虫(Cryptosporidium baileyi),而其他属寄生虫和细菌DNA的检测结果均为阴性;重复性试验结果显示,JVAP18S法、Csp18S法和CRU18S法的批内变异系数分别为0.69%~2.68%、0.11%~4.93%、0.04%~2.89%,批间变异系数分别为0.52%~5.75%、2.09%~5.13%、1.15%~3.71%;对50份小鼠田间粪便样品检测结果显示,JVAP18S法检测的阳性率为84.00%,显著高于套式PCR法检测的64.00%的阳性率。上述结果表明,三种实时荧光定量PCR法均能有效检测隐孢子虫,比较而言,JVAP18S法敏感性高、特异性强、重复性好,尤其适合于隐孢子虫含量较少的样品检测。     

牛新孢子虫内标双重荧光PCR检测方法的建立

为建立牛新孢子虫的快速准确检测方法,根据犬新孢子虫种属特异性基因Nc-5序列,设计高度保守的引物和荧光探针,通过引物设计和搭桥PCR法扩增,获得Nc-5荧光PCR内标模板。对内标模板的添加量和反应条件进行优化,建立了牛新孢子虫内标双重荧光PCR检测体系。该方法具有较好的特异性;可以检测到10个拷贝/PCR反应的核酸分子,与不加内标的荧光PCR检测灵敏度相当;通过对系列稀释的核酸样品的重复性检测,变异系数为0.50%～1.30%。通过对58份临床样品分别用该方法、不含内标的荧光PCR方法和普通PCR方法检测,结果显示,该方法与不含内标的荧光PCR方法的阳性检出率均为10.3%,比普通PCR方法阳性检出率（7.0%）高;表明该方法可用于临床样品中牛新孢子虫的快速检测,并能对实验室进行质量控制。     

PCV4 SYBR Green I实时荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立一种灵敏、可快速检测猪圆环病毒4型（PCV4）的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法,根据PCV4 Rep基因的保守区域设计引物,建立针对PCV4的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性和重复性进行评价。结果显示,该检测方法的Ct值与标准品在5.64×102~5.64×109 copies/μL范围内呈良好的线性关系,R2为0.999,斜率为-3.638,检测下限为5.64×102 copies/μL,且无非特异性扩增。利用该方法对56份临床样品进行检测,发现PCV4核酸阳性率为3.57%,比普通PCR更灵敏可靠。结果表明,本试验建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法可用于PCV4的快速诊断。     

猪圆环病毒2型荧光定量PCR检测方法的建立

通过条件优化,以定量的10倍系列稀释质粒pMD-ORF2(含PCV2-ORF2全基因)为标准品,进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了猪圆环病毒2型(PCV2)的荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μL,线性范围为109~100,达10个数量级;对起始浓度为1.0×106、1.0×105、1.0×104拷贝/μL的标准品的最终实际测得值分别为1.000×106、0.935×105、0.987×104拷贝/μL,变异系数分别为2.527%、2.067%、2.092%。该方法的检测灵敏度与套式PCR(nPCR)相当,甚而高于常规PCR。     

鸡Caspase-1基因SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立快速定量检测鸡Caspase-1基因的方法,本研究根据鸡Caspase-1基因序列设计特异性检测引物,PCR扩增Caspase-1基因片段,构建pMD-Caspase-1重组质粒。以该重组质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增,建立标准曲线,并通过反应条件优化、特异性、敏感性及重复性等试验,建立了鸡Caspase-1基因SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。结果显示,本研究建立的该荧光定量PCR方法在重组质粒标准品为1.0×10~3拷贝/μL～1.0×10~8拷贝/μL范围内具有良好的线性关系;该荧光定量PCR方法对Caspase-1基因的扩增具有较强的特异性;对重组质粒标准品的检测下限为1.0×10~2拷贝/μL,比常规PCR敏感100倍;批内和批间变异系数分别在0.51%～4.41%和0.37%～0.88%,重复性好。利用所建立的方法可以定量检测致病性禽腺病毒血清4型感染鸡不同组织中Caspase-1的转录水平。本研究方法的建立将为研究鸡Caspase-1在免疫反应和疫病发展过程中的作用提供技术支持。     

猪圆环病毒3型TaqMan-MGB荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立猪圆环病毒3型(PCV3)荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中PCV3基因序列设计特异性引物和探针,经过反应体系和条件优化,建立了特异性检测PCV3的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。该检测方法在4.78×10~1拷贝/μL～4.78×10~9拷贝/μL质粒标准品范围内均有良好的线性关系;该方法特异性试验结果显示,其与多种常见猪病病毒均无交叉反应,特异性良好;本研究建立的方法敏感性是常规PCR方法的100倍,敏感性较高;批内批间重复性试验变异系数均小于2.3%,重复性良好。对临床样品的检测结果显示,该方法对PCV3的检出率高于常规PCR方法,并且PCV3阳性样品多存在混合感染情况。该方法的建立为PCV3的实验室诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。     

鳜弹状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立快速、准确检测鳜弹状病毒(SCRV)的TaqMan荧光定量PCR方法,本实验根据弹状病毒N基因中的保守序列,设计合成了一对特异性引物和TaqMan探针,以构建的标准质粒为模板,经条件优化后建立了SCRV的TaqMan荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行试验。结果显示,建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法标准曲线的相关系数为0.999,质粒标准品在1×10~8拷贝/μL～1×10~1拷贝/μL范围内有较好的线性关系;该方法可以特异性检测SCRV,但对草鱼出血病病毒(GCRV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、罗非鱼湖病毒(TiLV)、石斑鱼虹彩病毒(SGIV)、传染性脾肾坏死病(ISKNV)、神经坏死病毒(NNV)及鲤春病毒血症病毒(SVCV)等7种常见鱼类病毒检测结果均为阴性;最低可检测到的质粒标准品浓度为102拷贝/μL,比常规PCR方法灵敏100倍;该方法组内与组间变异系数均小于2%。采用该方法对35份临床样品进行检测,结果显示阳性检出率为31%,而普通PCR阳性检出率为14%,该方法检出率比常规PCR高。本研究建立的SCRV的TaqMan荧光定量PCR检测方法为SCRV的快速检测提供了可行的技术手段。     

伪狂犬病病毒野毒荧光定量PCR检测方法的建立

根据伪狂犬病病毒gE基因的序列,设计和合成了一对特异的可用于检测伪狂犬病病毒野毒的PCR引物和一条Taqman荧光探针,采用Li ght Cycl e 480荧光定量PCR仪,建立了一种可实时定量检测伪狂犬病病毒野毒的荧光定量PCR技术。该方法的线性范围为1.0×102～1.0×1010拷贝,灵敏度可达4拷贝。检测速度快,仪器的运行时间仅为1 h。对13株猪伪狂犬病病毒野毒进行了检测,结果均为阳性;与伪狂犬病gE基因缺失疫苗、猪细小病毒和鸭瘟病毒无非特异性反应。与病毒分离培养比较,该方法具有快速、灵敏、特异、定量、重复性好等优点,可望用于临床上伪狂犬病病毒野毒与疫苗毒的区分,伪狂犬病病毒野毒的检测和病毒分布的研究等。     

带毒蚕卵中的家蚕微孢子虫DNA提取方法研究

为促进用PCR法检测家蚕微粒子病的生产应用,对带毒蚕卵中的家蚕微孢子虫DNA提取方法进行了研究。结果表明,蚕卵经30%KOH、27℃预处理后抽提的核酸能满足PCR检测对DNA质量的要求。以该方法抽提的DNA为模板,进行蚕卵集团检测,结果10~100粒蚕卵中混有1粒“有毒”卵,即能用PCR的方法检测出。“1/100”“有毒”卵的检出概率约为80%。     

家蚕微孢子虫原位杂交诊断技术研究

根据家蚕微孢子虫rRNA基因高度保守的特点,设计合成了1对PCR引物,从家蚕微孢子虫基因组DNA上扩增出1个12kb片段,用同位素标记后作为检测家蚕微孢子虫的特异性探针。采用原位杂交的方法,对家蚕卵及感染家蚕微孢子虫4、6、10d的幼虫进行原位杂交检测。实验结果表明,该方法可以从家蚕单粒卵内检测到296粒孢子,对感染家蚕微孢子虫4、6、10d的幼虫均有阳性杂交信号出现。     

几种化学药剂对家蚕微孢子虫在家蚕BmN细胞中发育、增殖的抑制

通过5种对家蚕微孢子虫发育有抑制作用的化学药剂--脓微灵、防微灵、蒿甲醚、三眠素和硫酸喹咛不同处理时期、时间在体外对家蚕微孢子虫发育、增殖影响的研究表明：供试的5种化学药剂对家蚕微孢子虫体外发育、增殖均产生不同程度的抑制作用。脓微灵的显抑制作用的时期表现在从接种0h开始的处理区，孢子形成数仅为对照的11.89%～15.68%，主要体现为对微孢子虫、芽体的杀灭作用或对微孢子发芽的抑制作用。防微灵、蒿甲醚、三眠素和硫酸喹咛对家蚕微孢子虫体外发生、增殖抑制作用最显的时期，均表现在接种24h～72h，从裂殖体分裂、增殖到孢子形成期之前这一对外界环境条件的变化最为敏感的发育阶段，尤以48h～72h最有效，其孢子形成数为对照的22%～38%。而抑制作用与化学药剂作用时间长短的相关性则不十分明显。     

家蚕微孢子虫(镇江株)β-微管蛋白基因部分片段的克隆及系统发育分析

设计1对正、反向引物btubf/btubr,对家蚕微孢子虫(镇江株)基因组DNA的β-微管蛋白(beta-tubulin)基因进行扩增,得到部分片段。经PCR鉴定、酶切及测序分析,该片段与Nosema属其它微孢子虫的beta-tubulin同源。采用邻近归并法(Neighbour-Joining)构建系统发育树,结果表明微孢子虫和真菌关系密切。研究结果对于微孢子虫的系统发育研究和家蚕微粒子病的治疗具有积极意义。     

家蚕微孢子RAD51基因的克隆、原核表达与体外翻译

从家蚕微孢子 (Nosemabombycis)中通过RT PCR扩增出RAD5 1(DNArepairprotein)基因的 3′端部分序列 ,经5′ RACE(RapidAmplificationofcDNAEnds)后得到全长cDNA序列 ,共 10 0 2bp ,编码 334个氨基酸。虽然用NorthernBlot检测不出mRNA的特异性表达带 ,但用RT -PCR直接扩增出全长cDNA而证实了该基因。该cDNA已作为新基因提交到GenBank数据库中 ,登录号为AF0 3730 5。将该基因在大肠杆菌 (E .coli)中进行表达 ,得到表达量较高的分子量约 37ku的蛋白质 ,经亲和层析纯化后得到较浓的单一蛋白带 ,纯化效果较好。用兔网织红细胞裂解液在体外也翻译出该分子量为 37ku的蛋白质 ,进一步确证了该蛋白。通过BLAST查询GenBank数据库 ,发现它与许多生物体的RAD5 1同源性很高     

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)侵染家蚕丝腺组织后的免疫胶体金标记观察

为了探讨家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)功能基因组研究方法和手段,利用免疫胶体金标记电镜技术,对被感染的家蚕丝腺组织中家蚕微孢子虫的蛋白质分泌状况进行了观察。结果显示,有大量的胶体金颗粒存在于家蚕微孢子虫寄生位点的宿主组织内,说明了家蚕微孢子虫寄生位点的宿主组织内存在大量的孢子蛋白质,证实了家蚕微孢子虫在寄生过程中将许多孢子蛋白质分泌到宿主体内。初步探讨了家蚕微孢子虫与宿主家蚕之间的互作关系。     

家蚕微粒子孢子单克隆抗体的研制及其在检测上的初步应用

将家蚕微粒子Nosema bombycis孢子免疫的BALB/c小鼠的脾细胞和FO细胞融合,经克隆筛选获得6株能稳定分泌抗N.bombycis孢子表面抗原的单克隆抗体细胞株(Nb_(1-6))。其中Nb_(1-2)和Nb4分泌的抗体属于IgM,Nb_3,Nb_5和Nb_6分泌的分别为IgG_2b、IgG和IgG_3。特异性检查结果表明,除Nb_4和Nb_6对柞蚕微粒子孢子有交叉凝集反应外,其余均对家蚕N.bombycisJ孢子具特异性。杂交瘤细胞培养上清液对N.bombycis孢子的凝集效价以Nb_1为最高,达1:256,由此细胞株诱发的腹水效价高达1:5000。建立了以普通聚苯乙烯酶标板为载体,完整的N.bombycis孢子为抗原的LEISA测定方法,最低检测量为700个孢子。     

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)染色体DNA的分离纯化

为了获取可供家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)单染色体测序的基础材料,通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)技术分离家蚕微孢子虫CQ1株系的染色体DNA,随后切取含有目的染色体DNA条带的琼脂糖胶块,分别利用电洗脱法、柱式胶回收试剂盒法及玻璃奶胶回收试剂盒法进行染色体DNA的分离纯化实验。结果显示3种方法均能回收到目的染色体DNA,但分离纯化的效率和样品质量存在差异:电洗脱法对胶块中的DNA损失较大,回收的染色体DNA含量低,而柱式胶回收试剂盒回收的染色体DNA断裂严重,因此这2种方法获得的样品质量均达不到染色体建库测序的要求;通过优化后的玻璃奶胶回收试剂盒法获得的染色体DNA相对完整且污染较少,质量检验分析133μL样品中的DNA质量浓度为8.495 ng/μL(DNA总量1.13μg),达到后续构建染色体测序文库的要求。玻璃奶胶回收试剂盒法不仅适用于家蚕微孢子虫染色体DNA的分离纯化,也可供基因组较小的物种制备单染色体建库测序材料参考。     

家蚕微粒子病的PCR诊断技术研究

在ＤＮＡ水平上，以聚合酶链反应（ＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎＲｅａｃｔｏｎ，ＰＣＲ）技术检测家蚕微孢子虫的结果。设计、合成了两对引物，其中引物Ⅰ是针对家蚕微泡子虫（ＮｏｓｅｍａｂｏｍｂｙｃｉｓＮ．ｂ．）引物Ⅱ是针对变形孢子虫（ＶａｉｒｉｍｏｒｐｈａｎｅｃａｔｒｉｘＶ．ｎ，）的。用这两对引物分别对“桑尺蠖微孢子虫”孢子ＤＮＡ和Ｎ．ｂ．（镇江株）的纯孢子及其感染的幼虫、蛹及蛾的ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，均获得预期的阳性条带；对不同引物扩增的产物进行了ＤＮＡ序列分析。初步认为引物Ⅰ可作为家蚕微孢子虫Ｎ．ｂ．特异性较高的检测引物，而引物１是微孢子虫共有的检测引物。进一步讨论了对家蚕微孢子的检测及分类上的问题。     

家蚕微孢子虫半胱氨酸脱硫酶基因的克隆及表达和亚细胞定位

半胱氨酸脱硫酶是一类活性依赖于磷酸吡哆醛的酶类,可催化L-半胱氨酸转化为L-丙氨酸和硫烷硫原子,为铁硫簇组装提供硫原子。基于家蚕微孢子虫基因组数据,克隆了家蚕微孢子虫半胱氨酸脱硫酶(NbNfs)基因。序列结构分析显示NbNfs含有其活性所需的保守氨基酸位点,但不具有线粒体型N端导肽;系统发育分析表明微孢子虫半胱氨酸脱硫酶与真菌线粒体型半胱氨酸脱硫酶聚为一类,属于类群Ⅰ,起源于α-变形细菌;共线性分析表明半胱氨酸脱硫酶基因在不同微孢子虫之间其基因座位保守,具有共线性。构建重组质粒pET30a(+)-NbNfs,并转化到E.coli Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达NbNfs融合蛋白,用Ni-NTA亲和层析柱进行纯化后,将融合蛋白免疫昆明小鼠制备多克隆抗体,Western blotting检测NbNfs在成熟家蚕微孢子虫具有表达。胶体金免疫定位显示NbNfs主要定位于成熟家蚕微孢子虫的细胞质中。研究结果为家蚕微孢子虫铁硫簇组装途径的研究奠定了基础。