中华蜜蜂囊状幼虫病毒检测方法研究进展

中蜂囊状幼虫病是一种由中蜂囊状幼虫病毒引起的严重威胁中蜂健康的传染性疾病。目前由于该病尚无有效的药物治疗方式,因此,预防与及时检测对于遏制该病传播显得尤为重要。本文主要从临床诊断、分子生物学和免疫学方面总结中蜂囊状幼虫病检测与鉴定的方法,包括形态诊断、RT-PCR技术、实时荧光定量PCR、巢式PCR、胶体金免疫快速诊断技术、ELISA、血清学技术和基因芯片等,为中蜂囊状幼虫病毒检测方法的改进和优化提供参考。     

家蚕中肠丝氨酸蛋白酶基因对家蚕微孢子虫入侵的响应模式

为探究接种家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)24与48 h后,家蚕中肠6种丝氨酸蛋白酶基因(serineprotease gene,sps)的表达变化趋势,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)方法对正常组和微孢子虫感染试验组的6个家蚕中肠丝氨酸蛋白酶基因(编号分别为sp1、sp3、sp5、sp8、sp11和sp12)进行定量分析。结果显示,与正常家蚕中肠内丝氨酸蛋白酶基因的转录水平相比,sp1、sp3、sp5和sp12在接种家蚕微孢子虫24与48 h后均上调表达,其中sp5上调最明显,接种家蚕微孢子虫24与48 h的表达量分别是对照的1.9和1.2倍;sp8和sp11在受微孢子虫感染24 h后表达上调,而48 h后表达量下降。结果表明,丝氨酸蛋白酶(serineprotease,SP)参与了家蚕中肠对微孢子虫入侵的免疫反应;不同丝氨酸蛋白酶上调倍数不同,说明不同丝氨酸蛋白酶参与家蚕免疫反应的程度不同;家蚕微孢子虫侵染48 h后,sp8和sp11出现了下调,推测微孢子虫的成功入侵抑制了sp8和sp11的表达。家蚕中肠不同丝氨酸蛋白酶在微孢子虫感染的不同时间的表达变化趋势为进一步研究丝氨酸蛋白酶家族在家蚕微孢子虫与宿主家蚕互作中的作用奠定了基础。     

来自桑树的3株青枯劳尔氏菌分离株的亚分类研究

青枯劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum)是导致桑青枯病的病原菌。从广东省罗岗、英德蚕区桑园的感病桑树取样,采用TZC固体培养基分离纯化得到的3株青枯劳尔氏菌菌株G11-41、G12-9、G12-50的形态特征均有差异:G11-41菌株菌落小,菌落中央深红色,菌体形态为接近球形的短杆状;G12-9菌落不规则,菌落中央呈淡红色,菌体形态为短杆状;G12-50菌落呈不规则圆形,菌体形态呈长杆状。将3个分离菌株的菌液淋灌根部接种感染桑树植株,其致病性也存在明显差异:接种G11-41菌株的植株发病率为11%,死亡率为0;接种G12-9与G12-50菌株的植株发病率和死亡率均为100%。根据Hayward分类标准进行生化型分类,3个分离株的6种碳源利用试验均呈现阳性反应,属于生化型Ⅲ。基于菌株的16S r DNA序列和内切葡聚糖酶基因(egl)序列构建的系统进化树将青枯劳尔氏菌分类为4个种群型,G11-41、G12-9、G12-50分离株同归属于种群型Ⅰ,其中:16S r DNA序列进化树上,G11-41与G12-50分离株的亲缘关系最近,分布在同一个进化小枝上;egl基因序列进化树上,强毒力分离株G12-9与G12-50分布在同一个进化小枝上,与弱毒力分离株G11-41有一定的进化距离。初步认为:在青枯劳尔氏菌的亚分类中,依据16S r DNA序列构建的系统进化树可能会更好地显示各分离株的地理来源;依据egl基因序列构建的系统进化树则可能会更好地显示出各分离株的致病性。     

家蚕微孢子虫蛋白水解酶的活性检测及质谱鉴定和序列分析

微孢子虫的蛋白水解酶类不仅参与代谢活动,而且可能作为一种潜在的侵染宿主的毒力因子。为了研究家蚕微孢子虫蛋白水解酶的种类及蛋白质结构特点,将家蚕微孢子虫总蛋白经非变性凝胶电泳后与底物酪蛋白孵育,检测到可水解酪蛋白的蛋白酶类的活性。采用质谱法分析该类蛋白酶主要是锌离子依赖型的细胞质型亮氨酰氨肽酶和丝氨酸蛋白酶。细胞质型亮氨酰氨肽酶序列是由1 515个碱基编码的505个氨基酸组成,无信号肽,有2个潜在的锌离子结合部位,属于金属蛋白酶M17家族;丝氨酸蛋白酶具有肽酶S8结构域和跨膜域。通过序列比对发现在兔脑炎微孢子虫、蝗虫微孢子虫、蜜蜂微孢子虫、肠道微孢子虫和比氏肠道微孢子虫中均有这2种酶,且相似度较高,其进化较为保守。     

家蚕微孢子虫诊断方法研究进展

家蚕微孢子虫（Nosema bombycis）因其能经食下和胚种途径寄生于家蚕,引发严重的传染性微粒子病,造成巨大的经济损失,成为近100年来影响蚕业生产的难题,因而被世界各养蚕国家和地区列为蚕种生产的惟一检疫对象。多年来,广大学者对其病原、检测技术及防治方法等方面进行了大量的研究,取得了较大进展。本文主要从光镜检测、电镜观察、分子生物学技术以及血清学检测4个方面综述近几十年来关于微孢子虫诊断方面的研究进展,并展望新技术的诞生。     

家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)侵染家蚕丝腺组织后的免疫胶体金标记观察

为了探讨家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)功能基因组研究方法和手段,利用免疫胶体金标记电镜技术,对被感染的家蚕丝腺组织中家蚕微孢子虫的蛋白质分泌状况进行了观察。结果显示,有大量的胶体金颗粒存在于家蚕微孢子虫寄生位点的宿主组织内,说明了家蚕微孢子虫寄生位点的宿主组织内存在大量的孢子蛋白质,证实了家蚕微孢子虫在寄生过程中将许多孢子蛋白质分泌到宿主体内。初步探讨了家蚕微孢子虫与宿主家蚕之间的互作关系。     

重度感染家蚕微孢子虫的家蚕丝腺cDNA文库构建及EST测序分析

用家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)感染家蚕品种大造的3龄幼虫,于感染后第10天选择有Nb重度感染特征的家蚕丝腺组织无菌操作提取RNA,构建Nb和家蚕丝腺混合样品cDNA文库(文库滴度≥1.6×106PFU/mL)。对文库进行测序,获得EST序列5 026条,其中家蚕丝腺EST3 901条、家蚕微孢子虫EST970条。拼接后,分别获得家蚕丝腺和Nb的单一EST(unique EST)563和383条。对EST和unique EST进行分析发现,感染后第10天家蚕丝腺中Nb的组蛋白、细胞分裂激酶等与孢子分裂增殖相关的基因表达水平较高,一些可能与Nb侵染或寄生适应相关的基因,如Nb孢壁蛋白、极丝蛋白、转运体蛋白等基因亦在此时期较高水平表达,尤其是此期间有相对高水平的组蛋白脱乙酰基酶基因表达,说明Nb基因的表达受到组蛋白去乙酰化方式的调控。对家蚕微孢子虫uniqueEST的序列特征分析发现,Nb mRNA UTR的长度和GC含量与其它微孢子虫差异较小,但ORF区的AT含量较高,即家蚕微孢子虫基因ORF序列较其它微孢子虫发生了高AT变化。Nb unique EST的功能注释及分类结果表明感染后第10天家蚕丝腺中的Nb孢子仍处于多形期,还未完全成熟化。     

家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP25、SWP30、SWP32的表达谱分析

研究家蚕微孢子虫(Nosema bombycis,Nb)的孢壁蛋白对于揭示家蚕微孢子虫感染宿主的分子机制具有重要意义。对已完成精细定位的家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP25、SWP30、SWP32在家蚕中肠组织中的表达谱进行了分析。RT-PCR结果表明,SWP32在感染后24 h就可以检测到其转录本,SWP25、SWP30的转录本在感染后36 h可检测到,提示SWP32可能在孢子裂殖体阶段就需要发挥作用;3种孢壁蛋白在感染3 d后其转录本均达到较高水平,并在感染过程中持续保持,在感染后第10天仍能明显检出。3种孢壁蛋白在感染3 d后转录本量明显增加的现象与家蚕微孢子虫的生活史相符合,即:孢子母细胞在此阶段迅速增加并向成熟孢子转化,成熟孢子的孢壁在这一时期形成。3种孢壁蛋白的表达能在感染早期阶段的家蚕中肠组织中被检出,为进一步探讨3种蛋白的功能提供了线索,也为开发基于这3种蛋白的分子生物学及免疫学特异性的家蚕微粒子病早期诊断技术提供了理论依据。     

蜜蜂RNA病毒在传粉昆虫中的分布及其病害诊断防治方法

近几十年来,传粉昆虫尤其是蜜蜂种群数量锐减,蜂群崩溃失调症(Colony collapse disorder,CCD)是严重威胁蜂产业发展和农作物增产的重要因素。在蜜蜂疾病病原中,RNA病毒被认为是造成CCD的主要原因。蜜蜂RNA病毒在非蜜蜂属膜翅目传粉昆虫中也能被大量检测到,暗示蜜蜂RNA病毒的广泛传播可能导致了世界范围内传粉昆虫数量的急剧下降。就蜜蜂囊状幼虫病毒(SBV)、卷翅病毒(DWV)、黑蜂王台病毒(BQCV)、急性麻痹病毒(ABPV)等常见蜜蜂病毒在传粉昆虫中的分布情况以及蜜蜂病毒病的诊断和治疗方法进行综述,这对于整个传粉昆虫的流行病毒学研究和传粉昆虫的保护具有重要意义,也为蜜蜂病害综合防控体系的建设提供理论参考。     

家蚕中肠丝氨酸蛋白酶基因对家蚕微孢子虫入侵的响应模式

为探究接种家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)24与48 h后,家蚕中肠6种丝氨酸蛋白酶基因(serine protease gene, sps)的表达变化趋势,采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)方法对正常组和微孢子虫感染试验组的6个家蚕中肠丝氨酸蛋白酶基因(编号分别为sp1、sp3、sp5、sp8、sp11和sp12)进行定量分析.结果显示,与正常家蚕中肠内丝氨酸蛋白酶基因的转录水平相比, sp1、sp3、sp5和sp12在接种家蚕微孢子虫24与48 h后均上调表达,其中sp5上调最明显,接种家蚕微孢子虫24与48 h的表达量分别是对照的1.9和1.2倍;sp8和sp11在受微孢子虫感染24 h后表达上调,而48 h后表达量下降.结果表明,丝氨酸蛋白酶(serine protease,SP)参与了家蚕中肠对微孢子虫入侵的免疫反应;不同丝氨酸蛋白酶上调倍数不同,说明不同丝氨酸蛋白酶参与家蚕免疫反应的程度不同;家蚕微孢子虫侵染48 h后,sp8和sp11出现了下调,推测微孢子虫的成功入侵抑制了sp8和sp11的表达.家蚕中肠不同丝氨酸蛋白酶在微孢子虫感染的不同时间的表达变化趋势为进一步研究丝氨酸蛋白酶家族在家蚕微孢子虫与宿主家蚕互作中的作用奠定了基础.