家兔胚胎细胞核移植的研究

研究改进了兔胚胎细胞核移植的技术体系,并对核移植胚胎的体外培养以及克隆胚胎的体内发育进行了试验。结果表明：卵母细胞去核率为８８．９％（８／９）,重组胚融合率为７６．７％（１７６／２２９）,将融合的重组胚与兔胎儿成纤维细胞共同培养,其２￣４细胞发育率、８￣１６细胞发育率以及桑椹胚和囊胚的发育率分别为６５．７％（２３／３５）、２８．６％（１０／３５）、２２．９％（８／３５）,显著高于“ＴＣＭ－１９９＋１０％ＦＣＳ”系统培养的４３．３％（１３／３０）、２６．７％（８／３０）、１６．７％（５／３０）。１６及３２细胞期卵裂球的重组胚可发育到产仔,将１１１枚重组胚移植给９只同期处理的受体母兔,２只妊娠,其中１只产出２只足月克隆仔兔,１只在产前１周（妊娠２２ｄ）流产。     

速冻中低温保护剂浓度对小鼠胚胎发育的影响

用快速冷冻方法，冷冻小鼠的２－细胞胚、４－细胞胚、８－细胞胚、桑椹胚和囊胚，低温保护液分别含有０．５，１．５，２．５，４ｍｏｌ／Ｌ丙二醇，含１０％的犊牛血清和０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖。对于８－细胞以前的小鼠胚胎，快速冷冻保存时丙二醇的浓度在２．５ｍｏｌ／Ｌ和４ｍｏｌ／Ｌ时效率较好。随着小鼠早期胚胎（囊胚以前）的发育，抗低温冷的能力加强。     

速冻中低温保护剂浓度对小鼠胚胎发育的影响

用快速冷冻方法，冷冻小鼠的２－细胞胚、４－细胞胚、８－细胞胚、桑椹胚和囊胚，低温保护液分别含有０．５，１．５，２．５，４ｍｏｌ／Ｌ丙二醇，含１０％的犊牛血清和０．２５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖，对于８－细胞以前的小鼠胚胎，快速冷冻保存时丙二醇的浓度在２．５ｍｏｌ／Ｌ和４ｍｏｌ／Ｌ时效果较好，随着小鼠早期胚胎（囊胚以前）的发育，抗低温冷冻的能力加强。     

猪体外成熟,受精卵的体外培养研究

用自己改良的发育培养基使３．９％￣２０．１％体外成熟体外受精卵在体外发育过了４－细胞阻滞期，到达８￣１６－细胞期，个别发育到桑椹期；培养中还观察到葡萄糖对猪胚胎的体外发育没有抑制作用，说明葡萄糖不是猪胚胎体外培养中出现阻滞的原因，在培养基中添加ｐＦＦ可促进猪胚胎体外发育，使发育至８￣１６－细胞期的胚胎率从３．９％，提高到１０２．２％。     

猪胚胎细胞核移植

选用杜洛克２￣１６细胞期胚胎卵裂球作核供体，湖北白猪卵母细胞作核受体，通过显微操作和电融合法构成重组胚。体外培养时，以融合前２ｈ、１ｈ激活及融合前不激活的卵母细胞做核受体的重组胚，发育率分别为６４．６％，５５．３％和３４．５％。     

家兔胚胎细胞核移植的研究

兔超排后收集卵母细胞和１６细胞胚，以Ｍｃ－Ｇｒａｔｈ－Ｓｏｌｔｅｒ和Ｗｉｌｌａｄｓｅｎ两种去（注）核方法，将１６细胞胚细胞核经电融合植入去核成熟卵母细胞内，经体外培养或中间受体培养，使移核胚发育．结果表明：（１）兔胚核移植中上述两种去（注）法的成功率无差异；（２）ｈｃＧ注射后１３～１５ｈ，６７．８％的卵母细胞保留有第一极体；（３）强度为０．６３ｋＶ／ｃｍ，持续１６０μｓ的一次电脉冲可使７０．８％的注核胚融合，同样的电脉冲刺激卵母细胞的活化率为６１．１％；（４）兔移核胚在中间受体内或体外均可发育，在中间受体内有２３．０％可以发育到桑椹胚或囊胚．     

小鼠2细胞胚卵裂球电融合的研究

分别用８００ｖ／ｃｍ、４０～８０μｓ的单个电脉冲；８００ｖ／ｃｍ、１６０～３２０μｓ的单个电脉冲；１０００ｖ／ｃｍ、１６０～３２０μｓ的单个电脉冲；１２００ｖ／ｃｍ、１６０～３２０μｓ的单个电脉冲；１０００ｖ／ｃｍ、１６０～３２０μｓ的２个电脉冲所获得的胚胎融合率分别为８４．６％（３３／３９），１００．０％（５９／５９），９７．４％（７４／７６），９５．１％（３９／４１），６４．７％（１１／１７）。融合胚作培养后，２细胞胚的发育率分别为１５．２％（５／３３），３９．０％（２３／５９），４７．３％（３５／７４），４３．６％（１７／３９），１８．２％（２／１１）。以１０００ｖ／ｃｍ，１６０～３２０μｓ的单个脉冲诱导注射ＬＨ３９～４３ｈ，４４～４８ｈ回收的２细胞胚，胚胎融合率分别为１００．０％（２７／２７），９６．４％（２７／２８）；发育率分别为４４．４％（１２／２７），３３．３％（９／２７）。２细胞胚卵裂球融合的适宜条件为１０００ｖ／ｃｍ和１６０～３２０μｓ的单个脉冲。     

超速冷冻8—细胞鼠胚

用３．５Ｍ和２．５Ｍ ＤＭＳＯ作冷冻保护剂进行超速冷冻８－细胞鼠胚。用前者作保护剂的鼠胚，无论在体外培养和体内发育的情况都好于后者。前者中的８－细胞鼠胚解冻后的存活率为７８．９％；存活胚胎体外发育到囊胚的比率为８３．４％，体内附植率为６３．９％，胎儿形成率为４３．２％。实验证明，超速冷冻保护存胚胎是一种省时，省力，省钱的好方法。     

家兔早期胚胎体外培养和移植研究

用ＦＳＨ，ＰＭＳＧ，ＨＣＧ和ＩＣＩ－８０９９６对２０只家兔进行超数排卵，平均每只排卵１９．１枚，回收胚胎１３．５枚。超排卵数和卵子回收数ＦＳＨ分别为２６．３枚和２１．１５枚，ＰＭＳＧ为２２枚和１３．５。将正常的２５枚１细胞，７枚２细胞和３２枚４细胞期胚胎在ＴＣＭ－１９９培养液，５％ＣＯ２和 ３８．５℃环境中培养６０－７ ０ｈ，６３．１７％的胚胎可发育至囊胚移植至５只体兔后，产出仔兔１３只。     

小鼠胚胎切割取样后体外培养发育能力的研究

本文对小鼠胚胎切割取样细胞数量的多少，取样后胚胎在室温中停留时间以及透明带存留与否的体外发育情况进行了研究，目的在于为牛胚胎性别鉴定切割取样时供借鉴和探讨。实验中的胚胎依据切割取样的细胞数分１０个细胞以内和大于１０个细胞以上两个组。其体外培养发育率分别为９５．７％（６７／７０）和７６．２％（３２／４２），两者差异极显著（Ｐ＜０．０１）；其中晚期桑椹胚、早期羹胚、扩展囊胚的体外发育率分别为８７．７％（６４／７３）、８６．２％（２５／２９）、１００％（１０／１０），三者之间差异不显著（Ｐ＞０．０５）；培养前在室温下停留３～７ｈ和９ｈ的体外培养发育率分别为９４．８％（７３／７７）、５７．１％（２０／３５），两者差异极显著（Ｐ＜０．０１）；胚胎取样后透明带存留和脱失的体外培养发育率分别为８７．９％（５１／５８）和８３．３％（４５／５４），两者差异不显著（Ｐ＞０．０５）。     

Effects of Ooplasmic Transfer on Rabbit Oocyte Fertilization and Early Embryonic Development

In order to evaluate the effects of ooplasm on oocyte fertilization and early embryonic development and to study the mitochondrial DNA (mtDNA) heterogeneity of early embryos, microinjection was first performed to transfer a small amount (5 to 7%) of donor ooplasm into recipient oocytes, then the eggs were fertilized with rabbit sperm through intracytoplasmic sperm injection (ICSI). In group 1 (homogeneous ooplasmic transfer), both the donor and recipient rabbit oocytes were at metaphase Ⅱ (MⅡ). In group 2 (heterogeneous ooplasmic transfer), the donor was mouse MⅡ oocyte and the recipient was rabbit MⅡ oocyte. In the control group, only ICS! was done on rabbit oocyte without ooplasmic transfer.No significant difference (P＞0.05) was observed in blastocyst development rates between group 1 (13.0%, 3/23) and the control group (16.7%, 4/24), but significant difference (P＜0.05) was examined in blastocyst development rate between group 2 (0, 0/27) and the control group. Blastomeres cleaved unequally and embryonic fragments increased after ooplasmic transfer and ICSI. In early embryos, in group 2, donor mouse mtDNA was detected in 2-cell embryos (3/3), 4-cell embryos(3/4), 8-cell embryos (4/4), and morulae (2/2). The mtDNA fingerprinting analysis showed that mouse mtDNA detected in heterogeneous embryos of different developmental stages had exactly the same sequence as that of the donor mouse mtDNA, thus indicating that homogenous ooplasmic transfer had no significant influence on rabbit oocyte fertilization and early embryonic development, and that heterogeneous ooplasmic transfer did cause notable reduction in blastocyst development rate. Heterogeneous mtDNA sequence in early embryos did not mutate. Compared with the control group,the embryonic quality declined after ooplasmic transfer operation in the present experiment.     

应用巢式及复合PCR对小鼠早期胚胎进行性别鉴定

根据小鼠SRY基因，设计并合成内外两对巢式PCR引物；同时。根据ZFY—ZFX基因的同源性，设计合成其共同的巢式PCR引物，对昆白小鼠组织DNA样品进行了性别鉴定。雄性样品可扩增262bp的SRY基因和137bp的ZFY—ZFX基因片断，而雌性样品只能扩增137bp的ZFY-ZFX基因片断，其鉴定结果与已知性别一致。将2-细胞、4-细胞、8-细胞和16细胞胚胎视为微量细胞样品进行PCR扩增，通过常规PCR与巢式PCR、复合PCR的比较。确立了巢式及复合PCR的扩增体系。结合核型分析和PCR法共鉴定21枚胚胎，其中雄性12枚，雌性8枚，鉴定准确率为95．2％。     

猪输卵管上皮细胞对小鼠早期胚胎体外发育的影响

研究了不同生殖时期猪输卵管上皮细胞对小鼠早期胚胎体外发育的影响,以此建立了适于早期小鼠转基因胚胎体外培养的猪输卵管上皮细胞共培养体系,并用PCR法对体外培养发育到不同阶段的小鼠转基因胚胎进行了外源基因整合检测。结果表明,在受孕初期的猪输卵管上皮细胞(无论是原代还是传代细胞)上,培养的小鼠1-细胞期胚胎的囊胚率显著高于发情间期的猪输卵管上皮细胞(P<0.01);在相同生殖时期猪输卵管原代和传代上皮细胞上,培养的小鼠1-细胞期胚胎的囊胚率差异不显著;在转基因胚胎不同发育阶段,PCR检测呈阳性的胚胎比率分别为:2-细胞期为96%,4-细胞期为63%,8-细胞期为43%,囊胚期为19%。由此可见,受孕初期的猪输卵管上皮细胞可促进与之体外共培养的小鼠早期胚胎的发育;随着早期小鼠转基因胚胎的发育,PCR检测呈阳性的转基因胚胎的比率逐渐降低。     

程序化冷冻对小鼠胚胎发育的影响

取小鼠原核(220枚)、2～4细胞胚胎(227枚)、桑椹胚(127枚),将其分为3组,每一时期胚胎分成两半,一半取出后立即冷冻复苏并体外培养至囊胚,另一半体外培养至囊胚后冷冻复苏,子宫冲取囊胚(78枚)冷冻复苏为对照组;各组囊胚均移植至于宫,比较程序化冷冻对小鼠早期胚胎存活率的影响.结果表明:原核、2～4细胞胚胎、桑椹胚体外培养至囊胚后冷冻复苏率分别为56.4%、72.2%、81.6%,移植产仔率分别为38.1%、41.6%、56.8%,原核、2～4细胞组复苏率和产仔率极显著或显著低于对照组,桑椹胚组与对照组差异不显著,显示体外培养对早期胚胎冷冻存活有影响;原核、2～4细胞胚胎、桑椹胚冷冻后体外培养至囊胚,胚胎移植后产仔率分别为25.3%、28.2%、42.1%,与对应胚胎时期体外培养至囊胚冷冻复苏后移植产仔率相比,原核、2～4细胞组均存在显著差异,而桑椹胚组差异不显著,显示原核、2～4细胞的早期胚胎体外培养至囊胚后冷冻可提高冷冻存活率.     

实验大鼠、小鼠胚胎的缓慢冷冻和玻璃化冷冻的比较

对3日龄小鼠胚胎和5日龄大鼠胚胎进行了玻璃化低温保存和缓慢冷冻保存的比较研究,从经过超数排卵的小鼠和大鼠中收集到了1897个8－16细胞的胚胎,经筛选后将I级和Ⅱ级胚计1738个（91．62%）分别进行两种低温保存试验,并对其中的881个冷冻胚胎分阶段进行复苏,复苏率分别为65．03％（小鼠69．59％,大鼠60．46％）和68．45％（小鼠72．61％,大鼠64．29％）,两者间无显著性差异（P＞0．05）。在复苏在胚胎中,选择其中的488个胚胎进行移植试验,结果,玻璃化冷冻保存胚胎的移植的受孕率为39．47％（89／222）,缓慢冷冻保存胚胎的移植的受孕率为42．56％（115／266）,两种低温保存方法经方差检验也无显著性差异（P＞0．05）。     

小鼠桑椹胚OPS管内解冻和直接移植

本实验对昆明白系小鼠的桑椹胚实施OPS法玻璃化冷冻,研究不同管内解冻程序对胚胎体内外发育的影响,旨在为小家畜胚胎冷冻、解冻和移植提供技术参数。采用OPS冷冻两步法(10%(体积分数)EG 10%(体积分数)DMSO溶液中平衡30 s,移入EDFS30平衡25 s)保存小鼠桑椹胚。一步法解冻是将OPS直接插到盛有0.5mol/L蔗糖的离心管中分别平衡1、2、3、4、5和6 min,解冻后经体外培养结果表明,平衡2~4 min组囊胚发育率(93.58%~97.22%)与对照组(100%)无显著差异(P>0 05);实施两步法解冻时将OPS先后插入0.5和0.25mol/L蔗糖中,体外培养结果显示,先后平衡3和2 min组囊胚发育率(100%)最佳,同对照组无显著差异(P>0.05)。将以上方法管内解冻最佳组的胚胎用OPS管作移植导管,直接移植到受体子宫角中,其妊娠产仔率(38.57%)和管外解冻组(42.86%)及新鲜对照组(51.19%)均无显著性差异(P>0.05)。证明OPS玻璃化冷冻的小鼠桑椹胚可以进行管内解冻和直接移植,为小家畜胚胎移植提供了模型。     

用RPE冷冻器冷冻小鼠胚胎试验

用RPE冷冻器冷冻42枚桑椹胚和13枚囊胚。冷冻液为1M甘油杜氏磷酸盐缓冲液,胚胎采用0.25ml细管包装。0℃时置入冷冻器。以1℃/分降温,-6.5～-7℃诱发结晶,再以0.5℃/分(0.3～0.8℃/分)降温至-30℃,然后投入液氮。35℃水浴解冻。桑椹胚与囊胚的冻后存活率分别为71.4％(30/42)和53.8％(7/13),差异不显著(P>0.05)。胚胎冻后发育步调很不一致。     

克服小鼠早期胚胎体外培养发育阻滞的研究

为探讨不同培养基及共培养对克服小鼠早期胚胎体外发育阻滞的影响,用不同成分组成的5种常用培养液对小鼠早期胚胎进行体外培养,后以KSOM作为基础培养基,KSOMFBS为对照,分别与小鼠输卵管上皮细胞(MOEC)和卵丘细胞(CC)进行共培养,观察从2细胞发育到4细胞的胚胎数和囊胚数的变化。结果发现5种培养液中从2-细胞发育到4-细胞的胚胎率为30.5%~43.5%,差异不显著。KSOM组囊胚率为40.9%,显著高于其他各组(27.9%~30.0%)。共培养后,各组中克服发育阻滞的胚胎数和囊胚数均有显著提高,其中添加胎牛血清组4细胞胚胎数和囊胚数显著高于不添加组,输卵管上皮细胞组显著高于卵丘细胞组。结果显示共培养对克服小鼠2-细胞发育阻滞作用明显,添加胎牛血清效果明显好于不添加,输卵管上皮细胞共培养效果好于卵丘细胞。     

小鼠-猪种间核移植胚胎玻璃化冷冻保存

以小鼠卵丘细胞为供核细胞,猪体外成熟去核卵母细胞为受体,构建小鼠-猪种间体细胞核移植(iSCNT)胚胎,并以猪体细胞核移植(pSCNT)胚胎为对照,采用开放式拉长细管(OPS)法对所获iSCNT胚胎进行冷冻保存,研究不同冷冻保护液(ES、EFS和EDFS)及胚胎不同发育阶段(2-、4-、8-细胞)对冷冻效果的影响。结果显示:小鼠-猪iSCNT胚胎卵裂率与猪pSCNT胚胎相比无显著差异(P>0.05),但其8-细胞发育率则明显较低(28.1%对56.8%,P<0.05)。采用ES液作为冷冻保护液,iSCNT胚胎冻后存活率与EDFS组相似,但显著高于EFS组(28.6%和22.7%对9.5%,P<0.05);与其他发育阶段相比,2-细胞期小鼠-猪iSCNT胚胎可获得最高的冻后存活率;小鼠-猪iSCNT各期胚胎的冻后存活率均低于pSCNT组,但无统计学差异(P>0.05)。结果表明,以ES液为冷冻保护液,选择2-细胞期小鼠-猪iSCNT胚胎进行OPS法冷冻保存,可获得相对较高的冻后存活率,但iSCNT胚胎的冻后存活率和体外发育能力均较pSCNT胚胎低。