秋茄KcTIP1基因克隆及其对植物耐盐性作用的研究

【目的】从秋茄中克隆液泡膜水通道蛋白KcTIP1基因,并研究其对植物耐盐性的作用机制。【方法】以秋茄幼嫩叶片为材料,通过PCR扩增克隆KcTIP1基因并构建其表达载体,采用根癌农杆菌介导法,用含重组质粒的农杆菌转化烟草植株,通过卡那霉素筛选和转基因烟草基因组PCR、RT-PCR鉴定,获得转基因再生植株;并选取其中2个阳性株系和野生型株系进行盐处理,测定野生型烟草(对照)与盐处理烟草根、茎、叶鲜质量,光合参数,叶片组织Na+、K+浓度以及根尖Na+、K+的流速。【结果】成功克隆得到了KcTIP1基因,对其编码蛋白氨基酸序列进行分析表明,秋茄KcTIP1包含MIP家族的特征序列SGGHVNPAVT和2个保守的NPA(Asn-Pro-Ala)位点。RT-PCR检测结果显示,KcTIP1基因在转基因烟草株系中成功表达。盐胁迫后,转基因烟草植株根、茎、叶鲜质量,叶片净光合速率,蒸腾速率,叶片组织Na+、K+积累和根尖Na+、K+内流幅度均高于野生型烟草。【结论】KcTIP1具有与其他水通道蛋白类似的蛋白结构和酶学功能,KcTIP1基因过表达可以提高转基因烟草的抗盐能力。     

利用寄主诱导的基因沉默技术验证大丽轮枝菌糖代谢相关基因的致病力

【目的】筛选大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)糖代谢相关基因,证实其与大丽轮枝菌的生长发育和致病性相关,为防治由大丽轮枝菌引起的棉花黄萎病提供理论基础。【方法】利用寄主诱导的基因沉默（host-induced gene silencing,HIGS）技术对大丽轮枝菌糖代谢相关基因进行筛选。将单个或多个含靶标基因的病毒载体注射本氏烟草瞬时表达基因,7-10 d后八氢番茄红素脱氢酶PDS会出现明显的烟草白化症状,蘸根法接种大丽轮枝菌V.d991,对应的大丽轮枝菌靶标基因会被干扰,接菌14 d后,观察转基因烟草表型,统计烟草病情指数,同时利用荧光定量PCR技术检测转基因烟草中大丽轮枝菌V.d991的生物量和靶标基因VDPDF-1、VDEG-1、VDMAN-1和VDPD-1的表达量。【结果】HIGS方法快速筛选获得大丽轮枝菌4个糖代谢相关基因,分别为VDPDF-1、VDEG-1、VDMAN-1和VDPD-1,相比空载体对照,转化这4个靶标基因的烟草病情指数分别降低了35%、30%、20%和10%,混合注射VDEG-1/VDPDF-1、VDPD-1/VDPDF-1/VDMAN-1、VDPD-1/VDMAN-1、VDPD-1/VDPDF-1和VDEG-1/VDPD-1的转基因烟草病情指数分别降低了45%、45%、40%、40%和35%,除VDPD-1转基因烟草外,其余转基因烟草与注射空载体的阴性对照相比病情指数都有显著降低。接种后大丽轮枝菌在寄主体内的生物量和干扰后靶基因表达量也有不同程度降低,混合基因注射比单基因注射干扰效果降低更明显,其中生物量降低最显著的是混合注射的EG/PDF(VDEG-1/VDPDF-1)和EG/PD(VDEG-1/VDPD-1),生物量的降低可达0.94,干扰大丽轮枝菌的靶标基因后,表达量降低最明显的是混合注射PD/PDF(VDPD-1/VDPDF-1)中VDPDF-1,降低了0.91。【结论】HIGS方法快速筛选到大丽轮枝菌糖代谢相关的4个基因VDPDF-1、VDEG-1、VDMAN-1和VDPD-1,当其被干扰后,转基因烟草的病情指数降低,抗病性增强,而且混合注射多个基因载体比单基因注射效果更为明显,证实这些糖代谢相关的基因与大丽轮枝菌的致病性相关。     

转麻疯树甜菜碱醛脱氢酶基因提高烟草耐盐性

 【目的】研究麻疯树甜菜碱醛脱氢酶(JcBD1)的功能。【方法】通过RT-PCR和RACE的方法从麻疯树中克隆甜菜碱醛脱氢酶基因（JcBD1）的全长cDNA序列。将从麻疯树中克隆的JcBD1 cDNA与CaMV 35S组成型启动子融合,构建植物表达载体pBI-JB,利用根癌农杆菌介导转入烟草。对获得抗性的植株用PCR、RT-PCR及Western杂交检测分析,同时测定转基因烟草植株的电导率、JcBD1酶活性及抗盐性等特性。【结果】由JcBD1 cDNA序列推测的JcBD1氨基酸序列与已知的BADH具有很高的同源性,包括BADH家族绝对保守区域十肽“VSMELGGKSP”和半胱氨酸残基。这两部分区域在甜菜碱醛脱氢酶底物特异性结合过程中起着重要作用,与酶的催化活性有关。PCR及RT-PCR检测证明外源JcBD1已整合到烟草基因组中并成功表达,转化率为56.7%。转基因植株的电导率明显低于未转基因植株。盐胁迫处理后,在转基因植株的蛋白提取样中能检测到Western杂交信号,而在未转基因植株中没有检测到杂交信号;转基因植株的蛋白提取样中能检测到甜菜碱醛脱氢酶活性,而对照没有活性,表明JcBD1在转基因植株中得到了表达。转JcBD1烟草在盐胁迫下,生长势明显强于未转基因植株。【结论】JcBD1能在异源植物中正常翻译、表达;JcBD1是盐害胁迫相关的重要基因。     

苹果MpSnRK2.4基因的克隆及转化

【目的】从常用苹果砧木楸子中克隆MpSnRK2.4基因,并将其转化番茄(Lycopersicon esculentum)品种Micro-Tom,为研究其功能奠定基础。【方法】以楸子幼叶为材料,通过RT-PCR扩增获得MpSnRK2.4基因的完整开放阅读框序列;利用Gateway技术构建pGWB411-SnRK2.4植物过表达载体,通过根癌农杆菌介导法将此载体转入Micro-Tom番茄中,通过卡那霉素筛选和转基因番茄RT-PCR鉴定,获得阳性转基因株系,利用qRT-PCR技术研究不同转基因株系中MpSnRK2.4基因的表达水平。【结果】成功克隆到长度为1 220bp的MpSnRK2.4基因片段,该基因包含长1 026bp的完整开放阅读框,编码341个氨基酸残基。通过在线软件分析发现,该基因的gDNA序列包含8个内含子,9个外显子;预测编码蛋白MpSnRK2.4的分子质量为38.475ku,理论等电点(pI)为6.06。系统进化树分析表明,MpSnRK2.4与水稻OsSAPK3蛋白的亲缘关系最近,序列比对显示MpSnRK2.4蛋白与已知的其他植物SnRK2s蛋白序列具有较高的同源性。转基因植株PCR鉴定结果表明,MpSnRK2.4基因已成功转入番茄植株中,经qRT-PCR发现,不同转基因株系的MpSnRK2.4基因表达量存在差异,其中株系1的表达水平最高。【结论】克隆获得了MpSnRK2.4基因全长序列,并得到了10个含有该基因的Micro-Tom番茄转基因株系。     

不结球白菜硝酸还原酶基因BcNR的克隆及其在拟南芥中的转化

 【目的】克隆不结球白菜硝酸还原酶基因（BcNR ）,并转化拟南芥做初步的功能鉴定。【方法】采用分段RT-PCR及3′RACE和5′RACE技术克隆了BcNR基因的全长cDNA,利用生物信息学方法进行序列分析和蛋白结构分析。构建pCAM-BcNR植物过量表达载体,通过农杆菌介导的真空渗透法将其转入野生拟南芥中,经抗性筛选及PCR验证获得T0代转基因植株,用Real-time PCR方法对30 mmol?L-1 KNO3溶液处理的转基因拟南芥的硝酸还原酶基因表达进行检测,并测定转基因植株的硝酸还原酶活性。【结果】获得了编码不结球白菜硝酸还原酶基因(BcNR )的cDNA全序列3 049 bp,包含有2 733 bp的开放阅读框,编码910个氨基酸。其氨基酸序列与拟南芥、烟草、甘蓝型油菜、马铃薯等编码的氨基酸序列具有较高同源性。蛋白质结构域分析表明,所推导的氨基酸序列具有完整的硝酸还原酶结构,同时证明从不结球白菜中克隆的这条基因属于NADH-NR型。GenBank登录号为EU662272。转基因拟南芥T0代植株进行GUS基因PCR检测,证明重组质粒已整合到转基因植株基因组中。硝酸盐处理后的转基因植株硝酸还原酶基因的表达比野生型显著提高,且硝酸还原酶活性有不同程度的提高。【结论】本研究首次从不结球白菜中克隆获得BcNR基因的全长cDNA序列,揭示了其序列特征并对其进行了初步的功能鉴定,为进一步利用该基因开展蔬菜硝酸盐含量的基因调控研究奠定了基础。     

野生茄转化酶抑制子基因 StINH1的克隆与序列分析

以1个受黄萎病菌诱导的“托鲁巴姆”下调EST为种子序列,在NCBI进行同源搜索,经人工拼接、RT PCR克隆与序列分析验证,获得野生茄“托鲁巴姆”转化酶抑制子基因(INH)的全长cDNA序列,命名为 StINH1。该基因的开放阅读框全长531 bp,编码176个氨基酸,与电子克隆获得的序列完全相同。编码蛋白的分子质量为19.916 ku,理论等电点为5.14。序列分析表明,该基因属于植物PMEI超家族,编码的前体蛋白含有1个拥有19个氨基酸的前导肽,同时含有多个磷酸化位点。表达模式分析表明,在黄萎病菌侵染后, StINH1在“托鲁巴姆”根中呈下调表达。     

胡杨PeXTH基因的克隆及其转基因烟草的抗镉性分析

【目的】克隆胡杨木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因PeXTH,并研究该基因和植物抗Cd2+性之间的关系。【方法】利用RT-PCR方法从胡杨中克隆一个木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶基因PeXTH,将该基因的全长cDNA克隆到植物表达载体pGreen0029上,然后通过农杆菌介导法,将重组表达载体转入烟草,并对转基因烟草的抗Cd2+能力进行初步分析。【结果】PeXTH基因的开放阅读框(ORF)长867bp,含ATG起始密码子和TAG终止密码子,编码由288个氨基酸组成的蛋白;多重氨基酸序列比对结果显示,PeXTH蛋白含有木葡聚糖内转糖苷酶/水解酶(XTHs)的保守催化活性域DEIDFEFLG和N-糖基化位点NLSG;Real-Time PCR检测结果表明,PeXTH基因已经成功在2个转基因株系(L6和L14)中过表达;Cd2+胁迫后,转基因烟草根组织中积累的Cd2+含量显著高于野生型,而叶组织中积累的Cd2+含量明显低于野生型;Cd2+胁迫下,转基因烟草叶片的相对电导率显著低于野生型,但抗氧化酶活性、营养元素含量、叶片净光合速率和蒸腾速率等生理指标都要明显高于野生型。【结论】PeXTH基因的过表达提高了烟草对Cd2+的抗性,为进一步深入研究PeXTH基因在植物抗Cd2+机制中的作用奠定了良好基础。     

毛白杨PtPCP—like基因的克隆及其遗传转化初报

利用滤纸吸附噬菌体 PCR法,从毛白杨花芽cDNA文库中分离克隆了PtPCP-like基因cDNA全长序列,测序表明克隆得到的该序列全长595 bp,包含一个完整的开放阅读框,编码91个氨基酸;经BLAST分析发现,该基因包含与拟南芥花粉外被蛋白基因相似的序列,命名为PtPCP-like。采用RT PCR技术检测PtPCP-like基因在各个组织部位的表达模式,结果显示在毛白杨的根和雄花芽中表达丰度最高,而在雌花芽部位表达丰度最低。并且构建35S∶∶PtPCP-like植物表达载体,采用农杆菌介导法将PtPCP-like基因导入烟草中,获得了一批阳性转化植株。采用qRT-PCR技术检测PtPCP-like基因在各个转基因烟草中的表达模式,结果显示在转基因烟草中各个株系均比野生型表达量高,且不同株系间相对表达量差异显著。      

CP基因3'端短片段介导的对马铃薯Y病毒的抗性

【目的】探明马铃薯Y病毒脉坏死株系（PVYN）CP基因3′端序列短片段的不同结构转基因诱导转基因植物产生RNA介导抗性的有效性。【方法】以PVYN的CP基因cDNA 3′端202 bp片段构建非翻译的正向重复和反向重复结构的植物表达载体转化烟草。【结果】攻毒试验表明前者没有一例转基因植株表现为抗病，而转化反向重复结构的转基因植株82.8%表现近似免疫的高度抗病型，Southern印迹杂交证明目的基因已整合到烟草基因组，Northern印迹杂交结果显示反向重复结构转基因植物的抗病性与RNA的表达量呈现负相关。【结论】抗病性是RNA介导的病毒抗性。3′端短片段诱导产生的转基因抗病株比例比5′端短片段诱导产生的高。     

新疆荷斯坦牛β防御素5基因的克隆、表达及表达产物的抑菌活性

【目的】克隆和表达新疆荷斯坦牛中性粒细胞防御素5(BNBD5)基因,对BNBD5蛋白进行纯化并分析其抗菌活性。【方法】利用RT-PCR方法扩增新疆荷斯坦奶牛BNBD5的cDNA序列,将BNBD5 cDNA克隆到原核表达载体pGEX-4T-2,测序分析后转化大肠埃希菌BL21(DE3)。经IPTG诱导后,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blotting分析;利用GST亲和柱纯化BNBD5蛋白,并进行体外抑菌试验。【结果】通过PCR扩增获得了218bp的牛BNBD5全长cDNA序列,经IPTG诱导,获得了约33 ku的牛BNBD5蛋白。牛BNBD5蛋白在15~25℃培养时的可溶性较37℃时多,且大多以包涵体形式存在,经纯化后最终获得了少量的目的蛋白。纯化的BNBD5蛋白对标准金黄色葡萄球菌和标准大肠埃希菌均具有明显的抑菌活性。【结论】克隆、表达了牛BNBD5基因,表达的BNBD5蛋白对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌都有抑菌活性。     

棉花GbRvd的亚细胞定位及其超表达烟草抗病性分析

【目的】研究棉花NB-LRR家族基因GbRvd的亚细胞定位及超表达烟草的黄萎病抗性,为解析GbRvd介导的植物抗黄萎病机制提供依据。【方法】对真核表达载体pJCV52进行改造,在SpeⅠ酶切位点插入gfp,使其兼具亚细胞定位的功能,命名为GPJCV52。应用Gateway技术构建GbRvd的亚细胞定位和超表达载体,并分别转化农杆菌GV3101。利用生物信息学和农杆菌介导的烟草瞬时表达技术对GbRvd分别进行亚细胞定位预测与观察。采用农杆菌介导法转化烟草,并通过组织培养技术获得转基因植株。运用PCR对超表达GbRvd的烟草进行阳性植株筛选,且利用半定量RT-PCR对阳性转基因植株进行表达检测。制备棉花黄萎病菌孢子悬浮液,通过灌根法对T_3代转基因烟草株系进行接种,利用5级标准统计发病情况并计算病情指数。【结果】利用在线分析软件ProtComp预测GbRvd为一种胞外(分泌)蛋白;GbRvd的跨膜预测结果显示其包含3个跨膜域;在线分析软件Wo LF PSORT预测结果显示GbRvd在细胞膜、内质网及叶绿体的预测分值分别为7、3和1,表明GbRvd主要存在于植物细胞膜上。利用农杆菌介导的烟草瞬时表达技术进一步对GbRvd的亚细胞定位进行观察,结果显示在单独表达GFP蛋白的烟草细胞中,荧光信号在细胞核、细胞质和细胞膜均有分布;而GbRvd与GFP融合表达后的荧光信号主要分布于烟草表皮细胞质和细胞膜。综合生物信息学分析和亚细胞定位观察结果,表明细胞膜和细胞质是GbRvd的主要分布位置。利用农杆菌介导和组织培养获得了转基因烟草植株,通过对转基因烟草植株的PCR检测显示,阳性转基因烟草植株能够通过PCR扩增出与预期大小一致的目的条带,而野生型植株未出现相应条带;阳性转基因烟草植株半定量RT-PCR同样能够检测出与预期大小一致的目的条带,由此表明GbRvd成功整合于烟草基因组并能够进行正常转录。对3个T_3代超表达烟草株系的黄萎病抗性进行分析,结果显示超表达GbRvd的烟草植株病情指数显著低于野生型对照植株,表明过表达GbRvd可有效提高植株对黄萎病的抗性。【结论】GbRvd主要存在于植物细胞质和细胞膜,其超表达可显著提高烟草对黄萎病的抗性。     

转G10aroA棉花株系的获得及分子生物学鉴定

【目的】培育具有抗草甘膦除草剂的棉花材料具有极其重要的意义。利用农杆菌介导法在棉花中转入编码EPSPS酶的抗草甘膦除草剂基因G10aroA,通过体细胞愈伤诱导组织培养技术获得能够稳定遗传的转基因棉花株系材料。【方法】首先,利用不同草甘膦抗性筛选条件比较分析不同棉花受体材料的愈伤诱导效率;其次,以R15材料作为受体,利用含有G10aroA的农杆菌侵染下胚轴切段,在进行体细胞愈伤诱导的组织培养过程中通过草甘膦抗性筛选获得棉花再生植株,对获得的棉花再生植株进行纯合繁育。在此基础上,利用PCR扩增检测证实外源G10aroA在转基因植株中能够稳定遗传;利用RT-PCR分析其外源基因在转基因植株不同组织中的转录水平进行研究、并进一步利用Western-blot对转基因植株中外源蛋白的表达进行分析。【结果】在优化的草甘膦筛选条件下,以草甘膦浓度为2.5 mmol•L-1的抗性条件进行棉花愈伤诱导筛选并获得棉花再生植株;利用特异引物进行PCR检测结果表明,在检测的全部再生植株中,扩增得到1.8 kb预期大小目标条带的阳性株系32株,其中,收获的27个株系的外源目标基因能够在T0、T1转基因植株中稳定遗传;对G10aroA在转基因株系L12、L14的不同组织中的转录表达进行定量RT-PCR分析表明,外源G10aroA在转基因棉花植株的不同组织中表达具有差异,相对表达量高低依次为茎、苞叶、叶和花;另外,蛋白检测结果进一步表明,该外源基因能够在转基因株系L7、L12和L14中植株中正常表达为预期46 kD的EPSPS蛋白。【结论】通过农杆菌介导法转化外源抗草甘膦基因G10aroA,在草甘膦抗性条件下进行棉花体细胞诱导的组织培养,成功获得转外源G10aroA的棉花再生株系,并通过分子生物学方法研究证实外源G10aroA能够在T0、T1转基因株系中稳定遗传、转录以及表达。     

棉花亲环素基因GhCYP1的功能分析

【目的】研究转棉花GhCYP1对烟草耐旱能力的影响。【方法】利用Gateway技术构建GhCYP1的植物表达载体pGWB-GhCYP1,采用农杆菌介导的遗传转化技术,获得融合目的基因的转基因烟草植株。以烟草野生型（WT）、L1和L2转基因系为试验材料,测定水分胁迫条件下烟草叶圆片中叶绿素的相对含量、叶片中相对水分含量、丙二醛含量和相对电导率。【结果】与野生型烟草植株相比,转GhCYP1烟草植株根系粗壮、发达。水分胁迫下转基因烟草叶圆片中的叶绿素相对含量显著高于野生型。水分胁迫3 d,WT、L1和L2中相对含水量、丙二醛含量和相对电导率无显著差异（P<0.05）。水分胁迫13 d,转基因系叶片中相对含水量明显高于野生型（P<0.05）,丙二醛含量和相对电导率均明显低于野生型（P<0.05）。【结论】干旱胁迫对野生型烟草产生了较大影响,而转基因烟草显示出较强的耐旱能力,表明GhCYP1的过量表达有助于提高烟草的耐旱能力。     

蕙兰Flowering locus T基因的克隆及其对开花的影响

【目的】 探讨CfFT基因在蕙兰成花中的作用。【方法】采用RT-PCR结合RACE技术从蕙兰(Cymbidium faberi)中克隆Flowering locus T（FT）同源基因CfFT。采用实时定量RT-PCR对不同组织及不同花发育时期CfFT进行表达分析。将该基因克隆到PBI121载体上导入烟草中,并对不同转基因烟草株系中的CfFT、NFL、NtFUL和NAP1基因进行实时定量RT-PCR分析。【结果】对蕙兰花芽分化不同时期的CfFT的表达分析表明,CfFT在花芽分化初期的表达量最高,之后随着花芽的成熟表达量逐渐降低。将CfFT导入烟草进行异源表达,转基因株系表现出明显的早花表型。对开花时间不一的转基因株系中的CfFT表达分析表明,其表达量与转基因烟草开花时间早晚成正比。进一步对这些株系内源的NFL、NAP1和NtFUL表达分析表明,NFL、NAP1和NtFUL基因的表达量与CfFT表达成正比,说明NFL、NAP1和NtFUL的表达受FT基因的上游调控。【结论】在烟草中异源表达蕙兰中的CfFT基因能促进烟草提前开花。     

应用ihpRNA干扰技术创制高支链淀粉马铃薯材料

【目的】创造块茎高支链淀粉或纯支链淀粉含量的转基因马铃薯材料。【方法】以构建的由Patatin启动子驱动的pBI121g-PgABI为干扰表达载体,采用农杆菌介导法转化马铃薯优良品种甘农薯2号。用PCR、Southern blotting、半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR技术检测转基因植株,并对转基因植株的微型薯进行淀粉含量的测定。【结果】通过农杆菌介导法获得10个转基因株系。PCR和Southern杂交结果证明,目的基因已被整合到基因组中,通过半定量RT-PCR分析表明,转基因株系中GBSSI的表达均受到明显抑制,且在6个转基因株系中检测不到mRNA的表达。进一步通过real-time PCR分析表明,转基因株系中GBSSI的mRNA沉默效率为66.27%—93.53%;转基因株系微型薯的淀粉含量也发生明显变化,其支链淀粉含量高达90.16%—98.84%,比对照高出10.31%—20.92%。转基因株系GBSSI的mRNA沉默效率与支链淀粉含量呈显著正相关（r=0.937,P<0.01）。【结论】采用ihpRNAi技术可有效抑制马铃薯块茎中内源GBSSI表达,获得高支链或纯支链淀粉含量的马铃薯材料。     

农杆菌介导甜高粱转Bt cry1Ah的研究

 【目的】建立一套高效、稳定的甜高粱农杆菌遗传转化体系,并在甜高粱中验证来源于苏云金芽胞杆菌新型杀虫基因cry1Ah表达产物的杀虫活性。【方法】以甜高粱幼穗愈伤组织为转化受体,通过农杆菌介导法将密码子优化过的Bt cry1Ah导入2个甜高粱品种“BABUSH”和“MN-3025”中。对获得的再生植株进行PCR检测、RT-PCR分析及除草剂抗性、目的蛋白表达水平和抗虫性鉴定分析。【结果】对336块幼穗愈伤组织块进行了农杆菌侵染,经双丙氨膦（Bialaphos）梯度筛选后共获得66株再生植株,PCR鉴定在8个转化事件中有22株为阳性植株,平均转化率为2.38%。RT-PCR检测结果表明,cry1Ah在T0甜高粱转基因植株中能够正常转录。Western blotting分析和ELISA定量测定显示,有5株可检测到Bt蛋白,但Bt蛋白含量差异较大,最高可达165.69 ng•g-1叶片鲜重（FW）,最低的仅为1.93 ng•g-1叶片鲜重（FW）,平均为87.50 ng•g-1 FW。饲虫试验表明,有2株转基因甜高粱植株对亚洲玉米螟（Ostrinia furnacalis）表现为抗性。【结论】利用建立的以甜高粱幼穗为外植体的农杆菌遗传转化体系,可获得具有玉米螟抗性的转基因甜高粱植株,其后代遗传稳定性还有待于进一步的研究。     

生菜低温胁迫转录因子LsICE1的克隆、特征分析及其转化水稻

 【目的】克隆生菜（Lactuca sativa L.）低温胁迫转录因子LsICE1,对其进行序列分析和水稻遗传转化,研究超表达LsICE1基因对水稻耐低温能力的影响。【方法】设计简并引物,利用RT-PCR技术获得生菜LsICE1基因保守区域,再通过SON-PCR技术获得LsICE1基因的5′端和3′端,拼接得到全长的cDNA。对该序列进行生物信息学分析,采用半定量RT-PCR研究LsICE1的低温表达模式。最后构建植物表达载体,利用农杆菌介导法对水稻进行遗传转化。通过比较低温处理后对照和转基因株系的存活率和生理指标,鉴定超表达LsICE1基因对水稻耐低温能力的调控作用。【结果】测序结果显示,拼接后的cDNA片段长1 622 bp,包含一个1 497 bp完整的开放阅读框,编码498个氨基酸残基,命名为LsICE1,GenBank登录号为HQ848932。半定量RT-PCR研究表明,LsICE1基因是冷诱导条件下差异表达的基因。进化树分析表明,LsICE1蛋白与葡萄的ICE1蛋白亲缘关系最近,处于同一进化分枝。PCR和RT-PCR分子检测证明,LsICE1基因已经整合到水稻基因组中。与对照相比,低温处理后超表达LsICE1基因的转基因株系存活率和脯氨酸含量明显增加,相对电导率和丙二醛含量积累速率明显下降。【结论】首次从生菜中克隆了低温胁迫转录因子LsICE1,超表达LsICE1基因水稻株系提高了抗低温胁迫能力。     

转harpinXooc蛋白编码基因hrf2对油菜抗菌核病的影响

【目的】尝试利用转基因方法提高油菜抗病性。【方法】将来自水稻细菌性条斑病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzicola）编码harpinXooc蛋白的hrf2基因插入植物表达载体pCAMBIA1301中,构建了植物重组表达质粒pCAMBIA1301-hrf2。由根癌农杆菌LBA4404介导,将重组表达质粒pCAMBIA1301-hrf2转化甘蓝型油菜杨油4号子叶节。【结果】获得了抗潮霉素的再生转基因油菜植株,经PCR,RT-PCR和GUS染色检测证明hrf2基因已整合到油菜基因组中。抗病性鉴定结果表明,转基因油菜对油菜菌核病有较好的抗性,在转基因植株叶片上油菜菌核病菌菌丝的生长受到明显抑制。【结论】利用农杆菌转化法可将hrf2基因导入油菜基因组中,并使转基因油菜对菌核病的抗性提高。     

水稻木葡聚糖内糖基转移酶基因OsXTH11过表达的作用分析

【目的】利用转基因技术对水稻XTH（OsXTH11）进行分析,了解其在水稻生长发育调节和逆境应答中的作用。【方法】构建OsXTH11过表达载体,利用农杆菌介导法将其导入水稻品种日本晴,通过对转基因植株进行表型分析和分子检测验证OsXTH11功能。【结果】Real-time PCR分析结果表明,转基因植株中OsXTH11表达水平明显提高。对T1转基因幼苗的表型分析显示,在正常生长条件下,转基因幼苗生长速度快于野生型;对赤霉素（GA）和生长素（IAA）的响应程度强于野生型;在黑暗和深水条件下,茎伸长速度均显著快于野生型;对100 mmol•L-1 NaCl的耐受能力也优于野生型植株。【结论】过量表达水稻木葡聚糖内糖基转移酶/水解酶基因OsXTH11的转基因植株表型显示,OsXTH11在水稻生长发育和抗盐胁迫中发挥作用。