颗粒细胞或卵丘细胞提高小鼠未成熟卵母细胞恢复减数分裂能力的研究

本研究通过12～13d小鼠颗粒细胞或21d小鼠卵丘细胞与14d小鼠直径55～65μm的卵母细胞共培养7d,发现单独培养、与颗粒细胞共培养、与卵丘细胞共培养的直径分别为54.2±1.6μm、65.2±2.3μm和63.4±3.4μm。而且,共培养提高了卵母细胞GSH的表达量(p<0.05)。在与颗粒细胞共培养7d后,11.1%(27/254)的卵母细胞能完成第一次减数分裂达到MII期。说明了小鼠颗粒细胞或卵丘细胞能够促进未成熟卵母细胞的发育及减数分裂的恢复,为研究哺育动物卵母细胞的发育调控提供了依据。     

发情间期注射PMSG对猪卵泡发育及颗粒细胞凋亡影响的研究

为探讨孕马血清促性腺激素 (PMSG)对猪卵泡发育和闭锁及颗粒细胞凋亡的影响 ,实验采用性成熟肥育母猪为实验材料 ,对在情期第 11d(发情当日为 0 d)注射 PMSG后 2 4 ,4 8,72和 96 h的猪卵巢表面各类卵泡数量、颗粒细胞凋亡比例以及外周血浆中类固醇激素浓度等进行了研究。结果表明 ,注射 PMSG后 2 4 h卵巢表面卵泡总数、小卵泡 (直径 <3mm)数和中等卵泡 (直径 3～ 5 m m)数分别为 :5 9,32和 2 5 .5个 /卵巢 ,明显多于同期对照组 (情期第 12 d)猪的数量 ;注射 PMSG72和 96 h卵巢表面大卵泡 (直径≥ 5 m m)数量分别为 7和 6个 /卵巢 ,明显多于对照组 (情期第 14和第 15 d) ,而此时卵汇总数却明显低于对照组。大卵泡颗粒细胞的凋亡比例在注射 PMSG后与对照组相比无显著差异 ,而小卵泡和中等卵泡的颗粒细胞的凋亡比例在注射 PMSG后 2 4 h(6 .4 %和 7.8% )显著 (P<0 .0 5 )降低 ;中等卵泡颗粒细胞凋亡比例到 PMSG后 72 h回升至与对照组无显著差异 ,小卵泡颗粒细胞凋亡比例于 PMSG后 96 h回升至与对照组无显著差异。血清中雌二醇浓度在 PMSG注射后明显升高 ,在 PMSG注射后72 h时达最高值 (72 .3pg· m L- 1 ) ,显著高于对照组 (10 .8pg· m L- 1 )。孕酮的浓度在 PMSG注射后无明显变化。以上结果表明 ,在体内条     

CTNNB1对猪卵巢颗粒细胞的调控

【目的】卵巢颗粒细胞的增殖和分化是原始卵泡生长启动的关键因素,卵巢颗粒细胞过度凋亡是卵泡闭锁的主要原因,因此卵巢颗粒细胞的功能对卵泡生长发育、排卵、激素分泌等至关重要。研究通过探究连环蛋白β1（catenin beta 1, CTNNB1）对猪卵泡发育过程中颗粒细胞的增殖、凋亡及类固醇激素分泌等功能的影响,为猪卵泡发育的分子调控机制研究提供参考。 【方法】利用RNA抽提、实时定量PCR（Quantitative real time PCR, qRT-PCR）等方法,构建CTNNB1在母猪卵巢、肌肉、大脑等9个组织的表达谱;检测母猪性成熟过程中卵巢组织和小（≤3 mm）、中（3—6 mm）、大（≥6 mm）卵泡颗粒细胞中CTNNB1的表达情况。构建CTNNB1的真核表达载体及合成siRNA,转染至猪卵巢颗粒细胞,采用EdU、Annexin V- FITC/PI双染、ELISA等方法,检测CTNNB1对颗粒细胞增殖、凋亡、类固醇激素分泌的影响,以及对类固醇激素合成通路重要基因转录表达的影响。【结果】与肌肉、大脑等组织相比,CTNNB1在卵巢中mRNA表达水平最高。性成熟母猪卵巢中CTNNB1转录水平显著高于性成熟前和性成熟后的母猪;卵巢卵泡中CTNNB1转录和蛋白水平随卵泡发育明显上调;且卵巢颗粒细胞中CTNNB1转录和蛋白水平也随卵泡的发育逐渐上调。更重要的是,CTNNB1显著促进颗粒细胞增殖,抑制颗粒细胞凋亡;CTNNB1能够上调CYP1A1和HSD17B7的转录水平,下调CYP11A1、ESR1、ESR2、FSHR、LHR和NR5A1等类固醇激素合成相关基因的转录水平,进而促进颗粒细胞雌激素的分泌,抑制颗粒细胞雄激素和孕激素的分泌。【结论】本研究证实CTNNB1可能通过促进颗粒细胞增殖及雌激素的合成和分泌,抑制颗粒细胞凋亡及雄激素、孕激素的合成和分泌,进而促进卵泡的生长发育。     

小鼠腔前卵泡卵母细胞的采集和体外成熟

酶消化配合机械分离，采集１０日龄小鼠腔前卵泡中的卵母细胞－颗粒细胞复合体（ＯＧＣｓ），以自制的胶原膜为底物，在ＭＥＭ培养液中培养１０ｄ，卵母细胞－颗粒细胞复合体由１１０．５±１８．６μｍ增长到１８４．４±６０．６μｍ，卵母细胞由５６．２５±２．０μｍ增长到８２．０±１０．５μｍ．３６．７％的ＯＧＣｓ具有５层以上颗粒细胞，其中９．１％放出第一极体。     

小鼠卵巢移植到去势公鼠背部肌肉后的生长发育

将12日龄小鼠卵巢移植到8～10周龄去势雄性小鼠的背部肌肉中,分别于移植后7、26和40d观察移植体周围血管再生状况,分离并观察移植体上的卵泡和卵母细胞发育情况,并观察移植体的组织学结构及变化。结果发现:卵巢移植后7d,卵巢內大量卵泡发生退行性变化,卵泡数量骤减;移植后26d,移植体周围有明显的血管发生,移植体直径增加到1908μm,极显著大于12日龄小鼠卵巢(P<0.01),移植体边缘可见到各阶段的卵泡,卵巢的皮质和髓质界限模糊;移植后40d,移植体直径增加到2739μm,极显著大于12日龄小鼠卵巢(P<0.01),有明显的卵泡,从移植体中分离得到卵丘卵母细胞复合体(COCs)和卵母细胞,形态基本正常。提示:成年去势雄性小鼠背部肌肉组织环境可支持同种异性移植的小鼠卵巢上卵泡和卵母细胞进一步生长发育。     

小鼠腔前卵泡体外发育和体外排卵的研究

为探明小鼠腔前卵泡体外发育及体外排卵的特征和规律性 ,为利用卵巢资源奠定基础 ,采用机械方法分离未成熟小鼠腔前卵泡进行体外培养 .以 α- MEM加亚硒酸钠、维生素 C,L-谷氨酰胺、丙酮酸钠为基础培养液 ,分组添加 10 %的 2种不同来源的血清和 1μg/ m L FSH.在多卵泡培养体系中 ,培养 9～ 10 d,每天观察其体外发育情况 ,测定卵泡和卵母细胞大小 .培养结束时 ,用 h CG进行体外诱导排卵 .结果表明 :体外培养过程中 ,腔前卵泡贴附培养皿底 ,相互聚集粘附形成团状结构 ,在细胞铺层微滴培养中 ,卵泡呈单个生长 ,并发育形成卵泡腔或腔样结构 ;经9d体外培养 ,小鼠腔前卵泡达到排卵前大小 (>40 0 μm) ,卵母细胞从开始时的 5 3.2 μm生长到 6 8.0～ 70 .8μm,总存活率为 6 1.0 % ;卵母细胞的大小及存活率在不同的血清添加组间差异不显著 ;用 h CG可诱导体外排卵 ,发生卵泡破裂 ,卵母细胞排出 ,卵丘细胞扩展 ,卵母细胞生化泡破裂 ,放出第一极体 .总排卵率达 5 9.5 % .因此 ,采用多卵泡培养体系 ,小鼠腔前卵泡能够发育至成熟排卵 .     

促性腺激素促进雄性小鼠体内卵巢移植体卵泡卵母细胞生长发育的研究

 【目的】探索外源促性腺激素对卵巢在雄性受体内生长、卵泡发育和卵母细胞成熟与发育能力的影响。【方法】将1日龄小鼠卵巢移植到7～12周龄雄性小鼠肾囊下,回收前用促性腺激素对受体进行处理或不处理,同龄雌性小鼠用促性腺激素进行处理后作为对照。移植21 d后回收移植卵巢,观测移植体的回收率及生长和卵泡发育;对卵母细胞进行体外成熟、体外受精,观察2-细胞胚和囊胚发育率。【结果】移植21 d后,未处理组移植体回收率为85.4%,与处理组（90.7%）差异不显著（P＞0.05）。未处理组移植体卵泡发育至成熟阶段,回收卵母细胞均处在GV期,平均每枚移植体回收卵母细胞数为（41.4±25.8）枚,2-细胞胚胎发育率为17.5%,未能发育至囊胚;处理组移植体有黄体形成,有的卵泡中有扩展的卵丘卵母细胞复合体,平均回收卵母细胞数为（33.4±20.1）枚,其中MⅡ期卵母细胞为（8.5±7.1）枚,GV期、MⅡ期卵母细胞受精后2-细胞胚胎的发育率分别为33.9％和44.3%,囊胚发育率分别为0.48%和6.3%;试验组间回收卵母细胞数差异不显著（P＞0.05）,2-细胞胚胎发育率、囊胚发育率差异极显著（P＜0.01）。试验组卵母细胞2-细胞胚胎发育率显著低于对照组（P＜0.01）,处理组MⅡ期卵母细胞囊胚发育率与对照组差异不显著（P＞0.05）。【结论】外源促性腺激素对雄性小鼠卵巢移植体具有促进卵泡发育、卵母细胞成熟和胚胎发育的作用,但不增加卵母细胞产量。     

不同处理小鼠卵巢组织中HIF1α基因的表达分析及其真核表达载体构建

为研究低氧诱导因子1α(HIF1α)及其下游基因胰岛素样生长因子2(IGF-2)和血管内皮生长因子(VEGF)在注射孕马血清促性腺激素(PMSG)(促排组)的促排卵巢与注射生理盐水(对照组)的普通卵巢组织中的mRNA转录水平,构建小鼠HIF1α基因真核表达载体,观察其转染的小鼠颗粒细胞中HIF1α基因的表达情况,以探讨HIF1α与小鼠卵泡发育的关系。用荧光定量PCR检测不同处理组织中HIF1α、VEGF及IGF-2 mRNA转录水平,免疫组化技术定位HIF1α在卵泡中的表达,基因重组技术构建HIF1α-pcDNA3.1真核表达载体并将其转染小鼠颗粒细胞,荧光定量PCR与Western blot技术检测转染细胞中HIF1α表达情况。结果表明:HIF1α在促排小鼠卵巢中的mRNA转录水平极显著高于普通小鼠卵巢组织(P0.01),在促排组和对照组的其他组织内HIF1αmRNA转录水平并无显著差异;HIF1下游基因VEGF和IGF-2在促排小鼠卵巢组织中的转录水平分别显著(P0.05)与极显著(P0.01)高于普通小鼠卵巢组织中的转录水平;卵泡发育至有腔卵泡后,HIF1α才开始在卵泡中表达;HIF1α-pcDNA3.1真核表达载体能够在颗粒细胞中转录HIF1αmRNA并翻译成蛋白。结论:HIF1α只在有腔卵泡内表达,其转录水平与卵巢内有腔卵泡数量成正相关,HIF1α通过上调VEGF和IGF-2参与卵泡的发育及成熟。     

山羊小腔卵泡卵母细胞的体外受精试验

抽吸法采集２￣６ｍｍ山羊卵巢大腔卵泡卵母细胞后，以１．５ｍｍ间距纵横切割卵巢，回收（２ｍｍ小腔卵泡卵母细胞。随机测量其直径为１２９．８６±１８．８４μｍ。将２１８枚卵丘细胞层致密完整的卵母细胞分别培养于含颗粒细胞并用２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ缓冲的①ＴＣＭ１９９＋１％ＧＳ，②①＋ＦＳＨ，ＬＨ（１０μｇ／ｍＬ）＋１７β－Ｅ２（１μｇ／ｍＬ），③②＋ＩＴＳ（５μｇ／ｍＬ Ｉｎｓｕｌｉｎ，Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉ     

卵泡液对不同大小牛腔前卵泡体外培养过程中E2分泌的影响

Φ60~150μm牛腔前卵泡在有、无促性腺激素存在下,分别添加0、10%、15%、20%牛卵泡液(BFF)的McCoy′s 5 a无血清系统体外培养15 d,测定其雌二醇(E2)分泌量。结果显示:各添加卵泡液组在培养3、6、9、12 d的E2分泌量均显著高于对照组(0组)(P<0.01)。当培养液中有促性腺激素(FSH、LH)存在下,各添加卵泡液组的E2分泌量更高,其中添加10%牛卵泡液组中Φ>100μm腔前卵泡在培养6 d时E2分泌量达最高,为48.96±11.54 pg/mL。表明培养液中添加一定比例牛卵泡液(BFF)可显著刺激体外培养腔前卵泡E2的分泌,促性腺激素存在下更加强了卵泡液对E2分泌的刺激作用。     

增殖细胞核抗原在水牛腔前卵泡中的表达与卵巢组织定位

【目的】探讨在水牛中增殖细胞核抗原（PCNA）参与卵泡发生的时期及其在卵巢组织不同时期卵泡中的表达定位;【方法】采用石蜡切片结合免疫组化的方法对PCNA在卵巢组织中进行定位,利用实时荧光定量PCR（QRT-PCR）技术检测PCNA在腔前卵泡中的表达情况。【结果】免疫组化结果显示：原始卵泡中的卵母细胞能检测到PCNA的表达,但颗粒细胞并未观察到PCNA的免疫染色;初级卵泡到次级卵泡,卵母细胞和颗粒细胞中均可检测到PCNA的表达,且在颗粒细胞中的表达有增强的趋势;有腔卵泡中,颗粒细胞、卵泡膜细胞及包围卵母细胞的卵丘细胞中都能观察到很强的免疫染色。定量表达检测结果显示：PCNA在原始卵泡、初级卵泡及次级卵泡中的表达呈上升趋势,并且有显著差异（43.50333±0.138338 vs 1.633804±0.093796 vs 1±0.012219 , P<0.01）;【结论】从初级卵泡开始在颗粒细胞中能检测到PCNA的表达,并且其表达随着卵泡的发育有明显的增强趋势,腔前卵泡中PCNA表达的QRT-PCR测定结果与免疫组化结果相一致,研究结果为阐明PCNA参与卵泡发生的分子调控机制奠定了基础。     

IGF-I对体外培养山羊卵泡颗粒细胞增殖与分化的影响

为弄清ＩＧＦ－Ｉ在山羊卵泡不同发育阶段对颗粒细胞增殖与分化的影响,分类采集山羊小腔和大腔卵泡颗粒细胞进行体培养,对培养后颗粒细胞的ＤＮＡ含量和孕酮分泌量进行测定。结果表明,ＩＧＦ－Ｉ对来源于大,小卵颗粒细胞的增殖与分化都有促进作用。     

牛不同生长发育时期卵泡AKP酶与G-6-P酶的活性变化

用组织化学方法观察了AKP酶(碱性磷酸酶)和G-6-P酶(葡萄糖-6-磷酸酶)在牛各生长发育时期卵泡的活性变化.结果表明:不同发育时期的卵泡数量与AKP酶和G-6-P酶活性反应阳性之关系极为显著,其中有腔卵泡的酶活性反应显示之数量多于腔前卵泡;但G-6-P酶活性反应之阴性卵泡显著多于阳性卵泡.AKP酶活性强于G-6-P酶.腔前卵泡酶活性位置显示之主要在颗粒细胞和卵母细胞上,而有腔卵泡酶活性位置则主要在内膜细胞上.     

小鼠卵泡颗粒细胞分化不影响卵母细胞印迹基因DNA甲基化进程

雌性生殖细胞印迹的获得发生于小鼠的卵子发生过程中,本研究以颗粒细胞分化前后的卵泡卵母细胞为研究对象,利用重亚硫酸盐测序法,对卵泡腔形成前后的卵母细胞中Igf2r和Peg3两个印迹基因的甲基化状况进行了分析。颗粒细胞分化前,卵母细胞Igf2r和Peg3两个印迹基因DMR区CpG位点的甲基化比率分别为80.67%和82.78%;颗粒细胞分化后的早期有腔卵泡卵母细胞中,卵母细胞Igf2r和Peg3两个印迹基因DMR区CpG位点的甲基化比率分别为82%和83.89%。可见,卵泡腔的形成对于直径相同的卵泡卵母细胞印迹基因甲基化的建立没有影响。     

生长分化因子9在兔卵巢中的免疫组织化学定位

［目的］探讨生长分化因子9（GDF9）在兔卵巢卵泡发生过程中的调控机制。［方法］采用免疫组织化学方法测定GDF9蛋白在兔卵巢中的表达定位情况。［结果］GDF9在原始卵泡中没有表达;在初级卵泡、次级卵泡和有腔卵泡卵母细胞及有腔卵泡颗粒细胞、透明带及卵泡液中均检测到GDF9蛋白;在黄体中也有GDF9的表达。［结论］GDF9不仅是卵母细胞分泌因子,而且是颗粒细胞的分泌因子,其表达随兔卵巢中卵泡发生呈时空动态变化,在兔卵巢卵泡发生过程中发挥了重要作用,参与了黄体活动的调节。     

山羊卵巢颗粒细胞差异表达基因消减文库的建立

为了从单卵泡水平建立非闭锁大小卵泡颗粒细胞基因表达的消减文库,选择繁殖性能正常、空怀高繁殖力黄淮山羊2只,以氯前列烯醇处理40h后取卵巢,计数卵泡并测量卵泡直径,钝性分离采集卵泡颗粒细胞,置于液氮内保存,取样后的卵泡部分组织采用原位缺口末端标记法(TUNEL)进行闭锁鉴定。选择直径6和4mm非闭锁卵泡,提取颗粒细胞mRNA,扩增cDNA,监测抑制消减杂交及其文库构建的试验环节。结果表明:消减文库的阳性克隆测序成功率100%,从正向文库中随机挑取96个克隆进行差异表达的筛选,发现12个全新表达序列标签;应用RT-PCR对已知序列的抑制素βA亚基基因(INHBA)和谷胱甘肽S-转移酶A1基因(GSTA1)进行表达水平测定,证实了颗粒细胞2个基因mRNA的表达模式与差异显示的结果相同。表明消减文库构建成功。     

猪卵泡闭锁过程中circINHBB的鉴定及其对颗粒细胞凋亡的影响

【背景】卵泡的发育状况和成熟排卵数量是哺乳动物的繁殖力和生产性能的重要决定因素。卵泡闭锁是卵泡停止发育并发生退化的过程,可能发生在卵泡发育的各个阶段,而闭锁的发生与卵泡颗粒细胞的增殖和凋亡情况密切相关,而颗粒细胞的凋亡过程十分复杂并且受到各种细胞因子的调控作用。环状RNA（circRNA）是近年来在生物体内发现的一种环状结构非编码RNAs（ncRNAs）。研究证明circRNA普遍存在于各个组织且参与到各种生理过程的调节中,但其在家畜繁殖学领域,尤其是猪卵巢和卵泡中的表达变化、位置分布和生物学功能研究较少。抑制素（INH）是一种性腺糖蛋白激素,主要由雌性动物卵巢卵泡的颗粒细胞产生,是控制哺乳动物排卵的重要因子。前期实验发现,猪卵泡中INHβ亚基INHBB编码基因的mRNA的前体可能形成一个circRNA,即circINHBB。【目的】在猪中等有腔卵泡组织中验证circINHBB的序列结构及其在颗粒细胞中的分布情况;分析其在健康、闭锁卵泡中的表达差异;在体外培养的猪卵泡颗粒细胞中探索了circINHBB对细胞凋亡的调控作用,并对circINHBB可能介导的功能性miRNA做出预测,为家畜繁殖领域的circRNAs研究扩宽思路,为提高家畜繁殖力研究提供参考。【方法】采集中等大小猪卵泡,进行RNA提取及反转录获得猪卵泡的cDNA,利用反向引物进行PCR扩增,PCR扩增产物经Sanger测序证明circINHBB的序列和环状结构;设计circINHBB的特异性荧光探针,运用FISH实验验证circINHBB在猪卵泡颗粒细胞核、质中的分布情况;然后,通过外观、激素和颗粒细胞密度指标选取健康和闭锁两组,用qRT-PCR检测circINHBB在猪健康和闭锁卵泡中的表达差异;最后,设计circINHBB的特异性siRNA（si-circINHBB）,在体外培养的猪卵泡颗粒细胞中,转染si-circINHBB及其对照,利用流式细胞术检测circINHBB对猪卵泡颗粒细胞凋亡的调控作用,预测circRNA可能参与的miRNA调节。【结果】PCR及Sanger测序验证了circINHBB在猪卵泡中的特异性存在,且证实了circINHBB是由INHBB编码基因的mRNA的前体经反向可变剪切形成的环状结构RNA;FISH实验进一步验证了circINHBB在猪卵泡颗粒细胞的细胞质中分布;qRT-PCR结果证实,与猪健康卵泡相比,circINHBB的表达量在猪闭锁卵泡中显著降低;流式细胞术检测结果表明当敲减circINHBB后,猪卵泡颗粒细胞的凋亡水平显著上升,说明circINHBB对猪卵泡颗粒细胞的凋亡有显著的抑制作用;生物信息学分析表明,circINHBB可能与10个已知miRNA相互作用,通过TGF-β、Notch等信号通路参与调控颗粒细胞凋亡及卵泡闭锁过程。【结论】在猪卵泡中验证了circINHBB的环状结构及胞质中的特异性表达分布,证实了其在闭锁卵泡中表达量低于健康卵泡,通过体外实验证实了circINHBB是细胞凋亡的抑制因子,可能通过吸附相关miRNA参与调节卵泡的发育和闭锁过程。     

简易机械法分离牛腔前卵泡的超微结构研究

电镜研究发现,简易机械法分离得到的腔前卵泡有1~3层颗粒细胞,卵泡外层为颗粒细胞,包有一层厚的糖蛋白基底膜,外无卵泡膜,其颗粒细胞及卵母细胞超微结构特征与卵巢皮质片中的腔前卵泡一致。卵母细胞为球形或卵圆形,有一大而偏离中心的核,核内有一显著核仁,各细胞器均匀分布于细胞质中,卵母细胞中有大量线粒体及其它细胞器遍布卵胞质,卵母细胞质膜上有突起将卵母细胞表面的微绒毛与邻近的颗粒细胞相连。超微结构研究结果表明,本法获得的牛腔前卵泡没有受到分离过程的机械伤害。     

猪腔前卵泡的体外培养

为确定不同基础培养液和培养方法对猪腔前卵泡体外培养的影响,试验采用了M199和NCSU23两种基础培养液及96孔培养板法、凹窝培养法和颗粒细胞铺层培养法对猪腔前卵泡进行体外培养。结果表明:培养在M199的腔前卵泡生长显著快于培养在NCSU23的腔前卵泡,培养在该2组的猪腔前卵泡前5 d的生长速度都极显著地高于后5 d的生长速度,而腔前卵泡的成腔率和存活率没有明显差异;培养在凹窝培养体系的腔前卵泡生长速度显著低于96孔培养板法,但凹窝培养体系可以显著地增加腔前卵泡的存活率。同时证明,颗粒细胞铺层培养法对腔前卵泡生长没有显著影响。