准东油田萘降解菌群培养及菌群双加氧酶基因多态性分析

采用无机盐培养基,以萘为惟一的碳源物质对准东油田石油污染土壤中的萘降解菌进行液体富集培养。经过5次培养后,利用固体平板对获得菌群萘降解能力进行检测,同时利用HPLC对降解产物进行检测。离心收集富集培养基中的菌体,提取基因组DNA,基于Illumina Miseq测序平台对16S r RNA序列进行测序及生物信息学分析,同时采用萘双加酶基因通用引物对萘双加氧酶基因片段进行扩增、测序及分析。结果表明,含有萘的固体平板有清晰透明斑的出现;高效液相检测结果显示,萘被降解成小分子产物,证明液体培养基可富集培养获得萘降解菌群。萘降解菌群16S r RNA测序比对结果显示,富集培养获得菌群分属于5门9纲15目24科31属,共33种细菌。另外共获得萘双加氧酶基因片段11条,GenBank注册号为KY304819-KY304829。系统发育树结果显示,所获萘双加氧酶基因分为4个类群。通过HPLC及双加氧酶基因的分子检测,验证已从准东油田石油污染土壤当中富集培养获得萘降解菌群。     

红树林湿地土壤萘降解菌的分离与鉴定

[目的]研究降解菌株对萘的降解能力,为其应用于被石油污染滨海湿地的生物修复提供参考。[方法]采用富集培养方法,从珠海市淇澳岛被石油污染的红树林湿地土壤中富集、分离和筛选出能降解萘的菌株,观察各菌落及菌体形态特征;研究菌株N4的生理生化特征,并应用16S rDNA序列分析方法进行鉴定。[结果]从土壤样中分离得到26个能以萘为唯一碳源生长的菌株,其中4个在平板上菌落较明显且具有不同的菌落特征,分别命名为N1、N2、N3和N4。菌株N4对萘的降解能力最强,在初始萘浓度为100 mg/L的无机盐培养基中培养5 d,萘降解率为54.2%,而菌株N1、N2和N3的降解率分别为52.7%、52.5%和47.8%。菌株N4经16S rDNA序列分析方法鉴定为赤红球菌。[结论]从被石油污染的红树林湿地土壤分离筛选出对萘具有较高降解能力的菌株。     

萘降解菌的分离与鉴定

[目的]研究降解菌株对萘的降解能力,以期应用于被石油污染的土壤、水源等的生物修复。[方法]以多环芳香烃中含2个苯环结构的萘为材料,从襄樊市郊被石油污染的土壤中富集、筛选和分离能降解萘的微生物,通过生理生化试验,观察菌落及菌体形态。[结果]从土壤样和废油样中分离得到31个能以萘为唯一碳源生长的菌株,其中4个在平板上菌落较大,且具有不同的菌落特征,分别命名为L1、L8、L15和L19。其中,L1菌株对萘的降解能力最好,在初始萘浓度为100 mg/L的无机盐培养基中培养40 h,萘降解率为92%,且培养液中残留萘最少,仅有8 mg/L。菌L1菌株初步鉴定为微杆菌属。[结论]驯化条件是优势菌株筛选的重要制约因素,以萘为唯一碳源可驯化筛选出对萘具有较好降解效果的降解菌。     

一株新的多菌灵高效降解菌的筛选与降解特性分析

从长期施用多菌灵农药的土壤中,通过富集筛选,获得1株新的多菌灵高效降解菌株.通过生理生化实验和16S rDNA序列同源性分析鉴定该菌株,应用高效液相色谱法对纯培养条件下菌株的降解特性和粗酶提取液的降解性能进行了分析.结果表明,筛选所获得的菌株与Raoultella菌属的亲缘关系最近,将其命名为Raoultella sp.MBC,该菌株能在以多菌灵为唯一碳源的无机盐培养基中生长;25℃、pH7.0、200 r·min-1的最适生长条件下避光振荡培养72 h,多菌灵的降解率达到100％;在最适培养条件下外加氮源和碳源在培养后期均可以提高多菌灵的降解率,外加氮源对多菌灵的降解效果优于外加碳源;该菌体的粗酶提取液具有降解多菌灵活性,且多菌灵降解酶为诱导酶.研究结果为多菌灵污染土壤的生物修复和酶修复提供了材料和理论依据.     

4株石油降解真菌的生长及降解特性分析

通过对4株石油降解真菌的生长速率及其对液体培养基中的原油和土壤中污油的降解情况进行测定,分析了不同菌株对石油烃的降解特性。结果表明,J12(Fusarium sp.)菌株在液体和固体培养基中的生长速率最大。在原油液体培养基培养30d后,色谱-质谱检测表明:J12菌株对C16～C31的直链烃具有较强的降解能力;J3(Bionectria sp.)和J4(Stachybotrys sp.)菌株能够完全降解原油中的芳香烃和支链烃,并且J4菌株还可以完全降解C33的直链烃,但是新增了C14的直链烃和一种C16H22O4;J11(Fusarium sp.)菌株可以完全降解C10的芳香烃,但是产生了两种C16H22O4。从原油降解后的组分及土壤中污油的组分检测结果推断,C7和C10芳香烃可能是石油烃降解的中间产物;J12菌株对原油和污油30d的降解率都最高,分别为64.25%和30.58%;除了J3菌株外,其他3个菌株对土壤中的污油降解率都低于原油的降解率。通过对菌株的生长速率及降解率比较发现,试验中石油的降解率与菌株的生长速率没有必然联系,主要与菌株的降解特性及石油的组分含量有关。     

南阳油污土壤微环境分析及石油降解菌筛选

测定了南阳油田石油污染土壤的一些理化性质,分析各种理化因子对其中的微生物的影响,并通过用以石油为单一碳源的培养基富集培养的方法从油污土壤中筛选降油菌株,还对它们的降油能力进行了评价。结果表明,南阳油田油污土壤的pH值、含水率等指标较有利于原油的降解,且南阳油田石油污染的土壤中的细菌数量与土壤的污染程度呈正相关。在这些油污土壤中共筛选到20株石油降解菌,其中NY-2、NY-7、和NY-17菌株的除油能力较强,它们的石油降解率分别达到47.8%、51.2%和46.3%。     

一株DMP降解菌的分离鉴定及特性研究

为分离邻苯二甲酸二甲酯(DMP)降解菌,本研究以长期覆盖塑料废弃物垃圾场的土壤为试材,采用选择性培养基筛选降解DMP的菌株,并研究其降解和生长特性。结果表明,分离获得了一株能降解DMP的菌株QD15-1,根据其菌落的形态特征、生理生化试验及16S rDNA碱基序列同源性分析,鉴定QD15-1为Paracoccus sp.,革兰氏阴性。底物利用试验表明,菌株QD15-1具有降解多种邻苯二甲酸酯(PAEs)的能力;以DMP为唯一碳源,菌株QD15-1生长的最佳条件为pH 8,温度30℃;动力学试验表明,降解DMP过程符合一级动力学方程,随着DMP初始浓度的增加,半衰期缩短;该菌株中含有降解PAEs的基因——邻苯二甲酸双加氧酶基因(PApht Ab)和3,4-二羟基-3,4-二氢邻苯二甲酸脱氢酶基因(PApht B)。液相质谱试验表明,降解的中间产物有邻苯二甲酸单酯、邻苯二甲酸,推测其降解DMP的途径为:将DMP降解成邻苯二甲酸单酯,再分解成邻苯二甲酸(PA),通过PApht Ab和PApht B的作用进一步降解。综上所述,QD15-1是一株高效降解DMP的菌株,在修复DMP污染方面有一定的应用前景。     

克百威降解菌CYW-44的分离及其酶促降解研究

为了有效治理克百威农药污染,以克百威为唯一碳源,利用富集培养的方法从农药厂活性污泥中分离到一株克百威降解菌CYW-44,经生理生化、16S rDNA序列分析及API 50CHB鉴定试剂条分析,将菌株鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。该菌在营养培养基中培养5 d时对100 mg.L-1的克百威降解率为97.72%,6 d能够完全降解克百威。通过液相色谱(HPLC)法检测,发现在降解过程中,克百威降解产物呋喃酚及其他代谢产物不产生累积;研究证实该菌株能分泌胞外降解酶和胞内降解酶高效降解克百威,对克百威的降解率分别达到99.1%和82.63%;通过SDS-PAGE验证了克百威对菌株降解酶活性的诱导作用。     

一株产胞外邻苯二酚-2,3-双加氧酶菌种的筛选及鉴定

为了筛选得到一株产胞外邻苯二酚-2,3-双加氧酶的芘降解菌株,以新疆克拉玛依石油污染土壤为样品源,采用芘平板升华法,筛选具有多环芳烃降解能力的菌株。利用显色反应及酶促反应对菌株所产胞外邻苯二酚-2,3-双加氧酶进行定性定量试验并对其进行形态学观察、BIOLOG GENⅢ微孔板鉴定及16S rRNA序列分析。通过单因子影响试验和正交试验对菌株的生长特性及最佳降解条件进行了初步探讨。结果表明:芘降解菌株W39能分泌胞外邻苯二酚-2,3-双加氧酶,且经芘诱导后,产酶能力提高了3倍;经鉴定,菌株W39为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae);最适培养条件:35℃,p H 7.0,芘浓度50 mg/L。可见,邻苯二酚-2,3-双加氧酶是降解芘的关键酶之一,可对其进行进一步研究。     

呕吐毒素降解微生物的筛选及应用

为分离筛选可高效降解呕吐毒素(Deoxynivalenol,DON)的细菌,以期在粮食DON生物降解中应用.采用DON为唯一碳源的无机盐培养基作为富集驯化培养基,从鸡肠、鱼肠及土壤样品中富集培养可降解DON的混合菌,并逐一对分离单菌进行DON降解能力检测,获得降解效果最佳菌株.结果 表明:JC-5菌株在无机盐培养基中DON降解效果显著高于其他菌株,12h、24 h、36 h内的降解率依次为56.56％、91.12％、96.97％;将JC-5添加到DON污染的面粉中,其在12h、24h、36 h内对DON的降解率依次为50.32％、84.84％和90.66％.经形态学、生理生化特征、分子生物学鉴定,该菌株为江都丛毛单胞菌(Comamonas jiangduensis).与现有DON降解菌相比,该菌株具有降解效率高、降解效果好,可有效降解面粉中DON的优点.可为进一步开发粮食中霉菌毒素的高效降解途径研究奠定基础.     

2株石油降解菌的分离鉴定

为了筛选高效石油降解菌株,通过富集驯化培养,从江汉油田石油污染土样中筛选能以石油为唯一碳源生长的菌株。经过划线培养获得单菌落,并通过形态观察、生理生化及分子生物学分析对菌株进行了初步鉴定和系统分类。结果分离获得2株石油降解效率较高的菌(分别记为G-40和G-94),初步鉴定G-40为侧孢芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus),G-94为热带假丝酵母菌(Candida tropicalis)。     

克百威降解菌CYW-44的分离及其酶促降解研究

为了有效治理克百威农药污染,以克百威为唯一碳源,利用富集培养的方法从农药厂活性污泥中分离到一株克百威降解菌CYW-44,经生理生化、16S rDNA序列分析及API 50CHB鉴定试剂条分析,将菌株鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）。该菌在营养培养基中培养5 d时对100 mg·L-1的克百威降解率为97.72%,6 d能够完全降解克百威。通过液相色谱(HPLC)法检测,发现在降解过程中,克百威降解产物呋喃酚及其他代谢产物不产生累积;研究证实该菌株能分泌胞外降解酶和胞内降解酶高效降解克百威,对克百威的降解率分别达到99.1%和82.63%;通过SDS-PAGE验证了克百威对菌株降解酶活性的诱导作用。

     

萘降解菌的分离、鉴定及降解途径

从武汉市金口张公堤处污泥富集分离出2株能以萘为唯一碳源生长的优势降解菌株XA1和XB1,经形态学观察、生理生化鉴定及16SrDNA测序分析,确定它们属于荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)。其最适生长温度均为28℃,最适生长pH分别为7.5和7.0。在最适生长条件下,菌株XA1、XB1以3%的接种量对500mg/L萘的降解率在第3天时分别达到了93.4%和74.7%。采用PCR和琼脂糖凝胶电泳技术检测到XA1、XB1中有儿茶酚2,3-双加氧酶基因(nahH)等萘降解过程中的关键酶基因,与NCBI中发布的基因序列相比较,相似度均达到99%。     

Delftia tsuruhatensis AD9苯胺双加氧酶基因的过量表达及多功能降解工程菌的构建

Delftia tsuruhatensis AD9和Acinetobacter calcoaceticus PHEA-2分别能利用苯胺和苯酚作为唯一碳源生长,降解的第一个中间产物均为邻苯二酚,随后裂解为参与三羧酸循环的中间产物。通过PCR方法克隆到苯胺高效降解菌AD9的苯胺双加氧酶基因,并构建表达苯胺双加氧酶的广宿主质粒载体pVD,通过三亲接合,导入到AD9和PHEA-2中。对两种重组菌中苯胺双氧酶基因的表达及苯胺降解特性的分析结果表明,增加苯胺双加氧酶基因的拷贝数可以提高野生型AD9的苯胺降解速率,同时该基因的表达使PHEA-2菌获得苯瞎隆觎能寸1．     

来源于假单胞菌4-硝基酚降解基因簇中的偏苯三酚1,2-双加氧酶基因克隆和功能鉴定

通过富集培养的方法从农药厂废水曝气池的活性污泥中筛选到了一株既具有甲基对硫磷降解活性又可以有效降解4-硝基酚的高效菌株1-7,经16S rDNA鉴定为假单胞菌（Pseudomonas sp.）。根据4-硝基酚降解相关基因保守区设计简并引物扩增小片段,再应用TAIL-PCR克隆得到偏苯三酚1,2-双加氧酶基因dio1,基因全长873 bp,编码290个氨基酸,酶蛋白理论分子量为32.8 kDa。 doi1基因在E. coli BL21中过量表达,并通过Ni-NTA亲和层析纯化,结果表明该酶具有正常的生物学活性,证明了假单胞菌1-7可以通过偏苯三酚途径降解4-硝基酚。初步探讨了假单胞菌1-7的4-硝基酚降解机制。     

降解烟碱细菌的分离·筛选及初步鉴定

[目的]对1株具有高效降解烟碱能力的菌株进行初步鉴定。[方法]应用基础培养基、富集培养基从南昌卷烟厂废弃烟草及其污染的土壤中分离筛选出1株具有高效降解烟碱能力的菌株,通过观察该菌株的培养特征、生理生化特征对其进行初步鉴定。[结果]该菌在含0.5%烟碱为唯一碳源选择培养基上生长,48h烟碱降解率为83.2%,初步鉴定为革兰氏阳性的嗜烟碱节杆菌。[结论]试验所筛选的X5菌株在实际应用中具有重要意义,在烟草工业和环境保护中具有潜在的应用前景。     

黄连土壤阿魏酸降解菌的筛选及降解特性

为筛选黄连土壤来源的阿魏酸降解菌,从黄连种植基地的土壤中分离能够在以阿魏酸为唯一碳源的培养基中生长的真菌,ITS序列比对鉴定种属,采用高效液相色谱法检测菌株在不同条件下对阿魏酸的降解能力.结果表明:获得对阿魏酸具有降解能力的真菌F-0056,鉴定为齿孢青霉(Penicillium daleae);外源阿魏酸添加量为200μg/mL时,菌株F-0056培养72h后阿魏酸降解率达87.5%;真菌F-0056在土壤环境下144h对阿魏酸降解效率达71.8%.     

芳香烃化合物降解菌CP5的降解特性及降解基因

以苯酚作为碳源从化工厂污水样品中富集筛选出降解能力较强的降解菌CP5,该菌能利用多种芳香烃化合物生长。16SrDNA序列系统发育分析表明,该菌属于假单胞菌属(Pseudomonas)。CP5可以在48h内将500mg/L的苯酚完全降解。从该菌株中扩增获得邻苯二酚2,3-双加氧酶基因,该基因编码氨基酸序列与P.putida NCIB9816-4以及P.fluorescens PC20的双加氧酶具有最高同源度,均为99%。CP5菌株对芳香烃化合物的生物修复有较大的应用前景。     

菲降解细菌L2的培养条件研究及菲降解率测定

通过选择性富集培养,从沈抚灌区石油污染土壤中分离到1株菲降解细菌L2,该菌株能以菲为唯一碳源和能源生长。通过对L2菌株培养条件优化,确定其最佳培养条件为pH值7.0~7.2,温度28~30℃,150 ml容积三角瓶装液量50 ml。并测定了L2菌株对不同浓度菲的降解率,结果表明,在培养7 d后L2菌株对培养基中浓度为501、001、50 mg/ml的菲的降解率分别为100%、96.4%和97.4%。     

十溴二苯醚降解菌的分离鉴定及其降解特性的初步研究

通过选择性富集法从杭州炼油厂附近长期受石油污染的土壤中分离到1株以十溴二苯醚为唯一碳源、能源生长的细菌BD-24,经形态、生理生化、16S rDNA核苷酸序列分析,以及(G+C)mol%测定,菌株BD-24被鉴定为芽孢杆菌属(Bacillussp.);并用高效液相色谱法测定十溴二苯醚浓度.结果表明:菌株BD-24在含20 mg·L-1十溴二苯醚的无机盐培养基上培养15 d,十溴二苯醚残余率下降至75.1%,到第25天,残余率则为65.6%;不同种类碳源的添加均能不同程度地促进十溴二苯醚的降解,其中麦芽糖作用最为显著,培养5 d后,残余率仅剩83.5%;而不同氮源的添加对降解无显著作用.