鸡γ-干扰素与新城疫病毒F蛋白抗原表位融合基因的构建与表达

[目的]研究鸡γ-干扰素（ChIFN-γ）的免疫佐剂功能,构建ChIFN-γ与新城疫F蛋白抗原表位（NDV F2-3）的融合基因,并进行原核表达。[方法]以头尾相连的方式构建鸡γ-干扰素基因与NDVF2-3的pET-32a重组质粒,经PCR扩增、双酶切和测序鉴定后,重组子在E.coliBL21细胞进行IPTG诱导融合蛋白表达,采用SDS-PAGE和Western blot方法分别检测表达的产物。[结果]获得了726 bpChIFN-γ与NDVF2-3融合基因,经原核表达,融合蛋白分子量约为35 000,能与相应的抗体结合。[结论]ChIFN-γ与NDVF2-3串联基因在原核细胞中能有效表达,且融合蛋白具有一定的免疫活性。     

猪α、γ干扰素的原核表达、纯化及抗病毒活性初步研究

提取猪白细胞DNA、猪脾脏RNA,特异性引物扩增猪IFN-α、IFN-γ基因,将IFN-α和IFN-γ基因分别插入原核表达载体pET-30构建重组表达质粒pET-30-IFN-α和pET-30-IFN-γ,转化大肠杆菌B121,在IPTG诱导下表达猪IFN-α及IFN-γ,SDS-PAGE分析重组表达蛋白;用细胞病变抑制法检测重组表达蛋白的抗病毒活性.结果表明成功构建重组表达质粒pET-30-IFN-α和pET-30-IFN-γ;SDS-PAGE可检测到相对分子质量为21.3 Ku和19.4 Ku的蛋白条带,表达产物主要以包涵体形式存在;经Ni2+-NTA亲和层析纯化,获得高纯度重组蛋白;纯化的猪IFN-α和IFN-γ抗星状病毒复制的活性分别为3.15×103 U·mg-1和2.48×103 U·mg-1.     

猪α干扰素在大肠杆菌中的表达及抗病毒活性检测

【目的】利用基因工程技术寻求能够高效、稳定表达猪α干扰素,且表达产物易于纯化的表达系统。【方法】以含猪α干扰素(IFN-α)基因的重组质粒pGEM-T-IFN-α为模板,PCR扩增猪α干扰素基因。将IFN-α片段定向插入原核表达载体pGEX-4T-1中,构建重组表达质粒pGEX-IFN-α,转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下表达可溶性的融合蛋白(GST-IFN-α)。【结果】SDS-PAGE可检测到相对分子质量约为45 ku的GST-IFN-α,Westernblot证实GST-IFN-α能与猪IFN-α单克隆抗体发生特异性反应。重组猪α干扰素经谷胱苷肽Sepharose-4B亲和柱层析纯化后,在Vero细胞上抗水泡性口炎病毒的活性为2.24×103U/mg。【结论】建立的表达系统能够表达重组猪α干扰素,表达的重组猪α干扰素具有一定的生物活性。     

猪源IKKγ在原核和真核表达系统中的表达及其多克隆抗体制备

[目的]制备猪源IKKγ多克隆抗体,为进一步研究IKKγ蛋白生物学特性及揭示IKKγ蛋白与猪瘟病毒(CSFV)间相互作用机制打下基础.[方法]利用RT-PCR从猪肾细胞(PK-15)中克隆原核表达的IKKγ基因功能片段(561 bp),与原核表达载体pET-32a(+)构建原核重组质粒pET-IKKγ,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后进行IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经纯化和浓缩后,免疫小鼠制备猪源IKKγ多克隆抗体.同时克隆IKKγ基因全长序列(1356 bp),与真核表达载体pCMV-HA构建真核重组质粒pCMV-HA-IKKγ,分别转染293T细胞和PK-15细胞,检测融合蛋白表达情况.[结果]以原核重组质粒pET-IKKγ转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导能表达出约40 kD的融合蛋白,且融合蛋白主要以可溶性蛋白形式进行表达,可通过Ni-NTA亲和层析柱进行纯化,已获得较高纯度的融合蛋白IKKγ.构建的真核重组质粒pCMV-HA-IKKγ能在293T细胞中成功表达出IKKγ蛋白;制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体能与293T细胞表达融合蛋白IKKγ发生特异性反应,其抗体效价为1:16000,与PK-15细胞表达IKKγ蛋白也具有良好的反应性,其中CSFV感染后36 h是IKKγ蛋白表达高峰期.此外,制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体能在PK-15细胞中成功检测到IKKγ蛋白,说明猪源IKKγ多克隆抗体与真核细胞瞬时表达的IKKγ蛋白特异性良好.[结论]制备获得的猪源IKKγ多克隆抗体具有效价高、特异性强等特点,可用于检测CSFV感染PK-15细胞中IKKγ蛋白表达水平,为下一步研究IKKγ蛋白生物学特性及揭示NF-κB信号通路转录调节功能机制提供技术支持.     

延边白鹅IFN-γ基因的原核表达及其多克隆抗体的制备

为制备抗延边白鹅IFN-γ蛋白的多克隆抗体,以已制备的pMD-IFN-γ质粒为模板,通过PCR扩增到延边白鹅IFN-γ基因,经TA克隆和BamHⅠ、EcoRⅠ双酶切,将目的基因亚克隆至pGEX-4T-1原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),进行IPTG诱导表达,将经SDS-PAGE及Western blot鉴定正确的重组蛋白用GST标签纯化试剂盒纯化,以纯化的重组蛋白作为抗原,免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体并进行ELISA检测。结果显示,成功构建了原核表达载体p GEXIFN-γ,表达的重组蛋白以包涵体形式存在,分子质量约为43 ku,制备的小鼠抗IFN-γ多克隆抗体效价为1∶16 000。     

猪乙型脑炎病毒广西分离株FC792E基因主要抗原域的原核表达及抗原性鉴定

对广西猪JEV FC792株的E基因主要抗原域Ⅰ、Ⅱ基因(Ea基因)进行原核表达及抗原性鉴定,为猪流行性乙型脑炎病毒(JEV)诊断抗原和基因工程疫苗的研制奠定基础.结果:成功构建广西猪JEV FC792株Ea基因的克隆重组质粒pMD18-T-Ea及表达重组质粒 pET32a-Ea,经SDS-PAGE及Western blot鉴定表明,JEV FC792株Ea蛋白在Roetta(DE3)菌中成功进行融合表达,表达出约58 KDa的融合蛋白;经抗原性鉴定表明,表达的融合蛋白Ea能与猪JEV阳性血清抗体发生特异性反应,融合蛋白Ea具有良好的JEV抗原性.     

猪α干扰素基因的表达及其单克隆抗体的制备与鉴定

将猪IFN-α(poIFN-α)成熟蛋白基因克隆于pET-28a载体中,转染大肠杆菌,并进行诱导表达.经SDS-PAGE检测,融合表达的蛋白poIFN-α大小约27ku.收获融合表达的poIFN-α,免疫BALB/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,通过间接ELISA方法对融合细胞进行检测,结果获得了1株能稳定分泌抗poIFN-α蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为2H12株.Western-blotting结果及单克隆抗体亚型鉴定结果表明,单抗与重组蛋白发生特异性反应,单抗为IgG1亚型,且轻链为κ链.     

鸡白介素18与鸡γ干扰素基因融合表达载体构建

为了研究新型细胞因子制剂,构建鸡白细胞介素18和鸡干扰素γ的基因融合表达载体。无菌提取鸡脾细胞的总RNA,以其为模板经过RT-PCR的方法分别扩增出Ch IL-18和Ch IFN-γ基因片段,并连接到p MDTM18-T克隆载体上,构建重组质粒p MDTM18-T-Ch IL-18和p MDTM18-T-Ch IFN-γ。以重组质粒p MDTM18-T-Ch IL-18和p MDTM18-T-Ch IFN-γ为模板,利用多肽氨基酸接头和overlap技术,获得Ch IL-18-Ch IFN-γ融合基因并连接到克隆载体p MDTM18-T上,经PCR、酶切及测序鉴定正确后连接到p ET32a原核表达载体中。构建Ch IL-18-Ch IFN-γ原核表达载体。为下一步研究二者之间的作用关系及抗病毒功能奠定了基础。     

鸡γ-干扰素基因在大肠杆菌中的表达

构建鸡γ-干扰素基因(lFN-γ)的融合表达质粒,并在原核系统表达。根据GenBank发表的鸡γ-干扰素核苷酸序列,使用prim er5设计一对特异性引物,通过RT-PCR技术从ConA诱导培养的鸡脾脏淋巴细胞中克隆出鸡γ-干扰素基因并对其进行测序。测序结果表明,鸡γ-干扰素基因全长495bp,具有一个完整的开放阅读框,编码164个氨基酸,与国外发表的序列同源性为100%。将序列连接到原核表达载体pET28 a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳分析。结果表明鸡γ-干扰素表达蛋白大小为20.8KD,并以包涵体形式表达。为鸡γ-干扰素生物制剂或疫苗佐剂的开发奠定基础。     

猪IFN-α8的原核表达及抗猪繁殖与呼吸综合征病毒活性研究

为确定猪干扰素α8(poIFN-α8)蛋白对猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的抗病毒作用，合成poIFN-α8基因，克隆入pCSMH大肠杆菌表达载体，将重组表达载体转化DH5α感受态细胞，进行温度诱导表达后，收集菌体进行SDS-PAGE电泳。将表达的目的蛋白利用Ni-琼脂糖凝胶纯化柱纯化后，采用Western blot试验检测重组poIFN-α8的反应原性，利用猪肺泡巨噬细胞（PAM）检测0.01、0.05、0.1、1 ng/mL的重组poIFN-α8蛋白对PRRSV的抗病毒活性，并检测重组poIFN-α8蛋白对下游干扰素刺激基因（ISG）Mx1、OAS1、ISG15的诱导激活作用。结果表明，成功构建了pCSMH-IFN-α8表达载体，实现了poIFN-α8在大肠杆菌中的包涵体表达，且重组poIFN-α8蛋白具有良好的反应原性；0.05 ng/mL的重组poIFN-α8蛋白可显著抑制PRRSV在PAM中的复制，poIFN-α8的抗病毒效果显著优于猪干扰素α2(poIFN-α2)、猪干扰素α5(poIFN-α5)，且重组poIFN-α8能有效激活ISG的表达。综上，表达的重组poIF...     

猪干扰素α1与胸腺肽α1融合蛋白原核表达系统的建立

依据GenBank已发表的猪干扰素α1(poIFN-α1)成熟肽基因序列,胸腺肽α1(THY-α1)蛋白序列及Escherichia coliB密码子使用频率表,优化并人工合成poIFN-α1和THY-α1基因,利用SOE-PCR法在poIFN-α1和THY-α1之间设计1个13肽Linker。将融合基因克隆至pRSFDue-t 1表达载体,转化BL21(DE3)感受态,37℃培养至菌液OD600为0.6~0.8,IPTG(0.5 mmol/L)诱导,20℃培养12h,SDS-PAGE和Western blot鉴定。结果表明:目的蛋白为菌体内可溶性表达,经强阴离子交换层析和疏水层析纯化获得高纯度poIFNα1-THYα1融合蛋白。     

AA肉鸡IFN-γ的表达及蛋白结构的初步预测

为了进一步研究肉鸡Ⅱ型干扰素(ChIFN-γ)蛋白的结构与功能,将新城疫Ⅳ系苗接种于9～11日龄SPF鸡胚尿囊腔中,诱生ChIFN-γ,提取脾脏总RNA,经过RT-PCR扩增出ChIFN-γ基因cDNA,测序后亚克隆至原核表达载体pProEXTMHTb中,转化大肠杆菌DH5α,用IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE及Westen Blot检测,利用DNAStar软件包中的Editseq将ChIFN-γ核苷酸序列翻译成氨基酸序列,然后利用Protean软件进行氨基酸序列分析,对蛋白的二级结构进行初步预测,利用自动比较蛋白同源建模的服务器Swiss-Model对ChIFN-γ的氨基酸序列进行三级结构预测。结果显示,所克隆的ChIFN-γ序列大小为495bp,与Digby和Lowenthal首次克隆的鸡Ⅱ型干扰素的同源性为99.8%。表达出预期大小(18ku左右)的融合蛋白,可以与His单克隆抗体发生特异性反应,蛋白质结构预测表明,ChIFN-γ蛋白具有丰富的二级结构和多处抗原指数较高的区段,其解螺旋最低能量值为-4245.698kJ·mol-1,有6个α螺旋结构。     

重组犬IFN-γ在HEK293T细胞中的表达

为了建立一套犬IFN-γ(cIFN-γ)在HEK293T细胞中表达的方法,用伴刀豆球蛋白A(ConA)刺激犬脾细胞,通过RT-PCR方法从脾细胞中扩增犬IFN-γ基因,并将其克隆到pcDNA3.1A载体中,构建的真核表达载体pcDNA3.1A-cIFN-γ经磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行表达。结果表明:克隆的犬IFN-γcDNA基因与GenBank上发表的序列一致,同源性100%。表达产物经Western-blot方法检测,证明克隆的犬IFN-γ基因能够在HEK293T细胞中进行表达,并且表达产物能够分泌到细胞外。     

鸡柔嫩艾美耳球虫三价DNA疫苗的构建及鉴定

[目的]构建含鸡柔嫩艾美耳球虫3-1E和CDPK抗原基因及鸡IFN-γ基因的三价DNA疫苗。[方法]应用SOE-PCR将3-1E、CD-PK和鸡IFN-γ共3个基因通过2个（GGGGS）3连接子相连,扩增出IFN-γ/3-1E/CDPK三价融合基因,将其克隆入真核表达载体proVAX中构建三价融合真核表达质粒proIEC,后用双酶切和PCR进行鉴定。阳性重组质粒提取纯化后体外转染PK-15细胞,通过间接免疫荧光技术检测目的基因在转染细胞中的表达情况。[结果]经双酶切和PCR鉴定证实鸡柔嫩艾美耳球虫三价DNA疫苗构建成功,且在PK-15细胞中获得了成功表达。[结论]鸡柔嫩艾美耳球虫IFN-γ/3-1E/CDPK三价DNA疫苗构建成功,为进一步探讨其免疫保护性奠定了基础。     

鸡γ-干扰素的可溶性表达及纯化产物的抗NDV活性

将鸡γ-干扰素(chIFN-γ)基因先克隆,接着通过大肠杆菌表达后进行产物纯化与活性检测.通过PCR方法以带有信号肽的重组质粒PMD-18T-preIFN-γ为模板,扩增无信号肤chIFN-γ基因片段,克隆至原核表达载体pProEXTM HTa,构建重组表达质粒pProEXTM HTa-chIFN-γ,在大肠杆菌BL2...     

牛FcγRⅠ(CD64) GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达

采用PCR技术从牛巨噬细胞cDNA文库中扩增了牛的高亲和力IgGFc受体FcγRⅠ,测序结果显示与已报道的牛FcγRⅠ序列一致。在牛FcγRⅠ成熟蛋白胞外环区两端分别合成带有BamHⅠ、XhoⅠ限制酶切位点的引物,用PCR扩增后亚克隆到GST融合蛋白表达载体pGEX - 6P- 1,转化宿主菌BL2 1(DE3) ,经IPTG诱导,SDS -PAGE分析表达了N端带有GST的融合蛋白,Western -blotting试验表明融合蛋白在变性条件下能和牛IgG结合。GST -FcγRⅠ融合蛋白的成功表达为研究牛IgG和受体的相互作用机制及其介导的免疫反应打下了基础。     

猪干扰素-γ基因的表达、纯化及活性分析

依照猪IFN-γ基因序列设计引物,将该基因克隆至原核表达载体pET-30a,构建pET-30a-pIFN-γ重组表达载体,转化入寄主菌BL21(DE3),经PCR、双酶切、测序鉴定正确后,用IPTG进行诱导表达,可溶性的表达产物分别经镍柱和Sephadex-G100纯化;包涵体经DOC洗涤、SKL变性溶解、透析复性进行纯化,然后进行SDS-PAGE、Western-blot分析,并用细胞病变抑制法进行重组猪IFN-γ活性测定.结果表明:试验得到了高纯度的重组pIFN-γ,且纯化的重组猪IFN-γ蛋白具有较高的干扰病毒复制的活性,对PRV的活性为2.0×103U.mg-1,而对标准O型口蹄疫病毒的活性为2.56×105U.mg-1.     

鸡IFN-γ表达载体的构建

[目的]构建鸡IFN-γ的表达载体。[方法]采用PCR方法从pcDNA-ChIFN-γ重组质粒中扩增得到鸡IFN-γ基因,将目的基因定向克隆至能够在大肠杆菌、昆虫细胞和哺乳动物细胞中表达的pQE trisystem载体内,转化大肠杆菌M15菌株,以IPTG诱导表达8×H is-tag标签蛋白并对其进行纯化。[结果]通过SDS-PAGE检测方法表明,ChIFN-γ基因片段成功表达。[结论]鸡IFN-γ的表达载体成功构建。