卵丘细胞凋亡与增殖对牛卵母细胞体外发育的影响

 【目的】探讨卵丘-卵母细胞复合体（COCs）形态、卵丘细胞凋亡与增殖状态和卵母细胞发育能力之间的相关性。【方法】根据卵胞质均匀程度和卵丘细胞层数等形态指标,对所挑选的未成熟COCs进行分组,随后利用体外受精技术和TUNEL技术,并结合流式细胞仪,评价各组COCs的体外发育能力及其卵丘细胞凋亡和细胞周期差异。【结果】 与包被5层以上致密卵丘且卵胞质均质的COCs相比,具有2—5层轻度扩散卵丘与颗粒化卵质特征的COCs显示较好的后续胚胎发育潜力、较高的卵丘细胞凋亡程度和较低的G2-M期细胞比率。【结论】 卵丘细胞凋亡程度与未成熟卵母细胞发育潜能呈正相关;COCs形态、卵丘细胞凋亡或者G2-M期细胞比率指标可以用来指示未成熟卵母细胞的发育潜力。     

钙离子在哺乳动物卵母细胞发育关键时期的作用

Ca~(2+)是广泛存在的信号分子,钙信号转导对多种细胞生理生化活动有重要的调控作用,越来越多的证据表明钙信号参与卵母细胞减数分裂。钙稳态是细胞内Ca~(2+)信号在时间和空间上的动态平衡,对卵母细胞钙稳态的研究是目前重要的研究热点之一。本文综述了钙稳态及钙离子对卵母细胞成熟和发育过程中的双线期阻滞恢复、MII期阻滞恢复和细胞凋亡的作用,发现某些哺乳动物双线期及MII期适当增加胞内钙离子水平可以使卵母细胞退出阻滞,而超出生理水平的胞内钙则会诱导细胞凋亡,并通过探究钙离子在卵母细胞减数分裂恢复和调控凋亡过程中的作用机制,为辅助生殖技术的进一步研究提供依据。     

线粒体介导的三倍体虹鳟卵母细胞凋亡

采集不同发育时期三倍体虹鳟幼鱼卵巢,采用免疫组化、线粒体膜电位荧光探针、荧光定量PCR和蛋白免疫印迹等方法,观察、检测卵巢发育过程中卵母细胞细胞凋亡现象及线粒体凋亡途径,证实三倍体虹鳟卵母细胞发生线粒体介导的细胞凋亡。结果表明,12℃发育水温下,三倍体虹鳟卵母细胞在受精后210 d开始凋亡,受精后270 d凋亡达高峰,330 d凋亡逐渐消失。证明卵母细胞发生凋亡是导致三倍体雌性虹鳟不育的重要原因,为三倍体鱼类性腺发育深入研究提供理论依据。     

凋亡抑制剂Z-VAD-FMK在猪卵母细胞冷冻保存中的应用

在猪MII期猪卵母细胞冷冻解冻后的孵育液中添加凋亡抑制剂Z-VAD-FMK,通过检测线粒体膜电位、早期凋亡、胚胎发育和相关基因表达等研究Z-VAD-FMK对冷冻后卵母细胞的影响。结果表明:(1)冷冻后线粒体膜电位(0.91)与新鲜卵母细胞(1.33)相比显著降低,添加Z-VAD-FMK显著提高了线粒体膜电位(1.19);(2)冷冻后卵母细胞的早期凋亡率(57.65%)与新鲜卵母细胞(8.37%)相比显著升高,存活率(61.45%)、孤雌激活卵裂率(13.18%)和囊胚率(3.10%)与新鲜卵母细胞(98.97%、89.41%和41.40%)相比显著下降,冻后孵育液中添加Z-VAD-FMK处理能显著降低其早期凋亡率(32.82%),并显著提高其存活、孤雌激活卵裂和囊胚的发育能力(73.21%、39.83%和10.79%);(3)冷冻后死亡受体途径和线粒体途径中促凋亡基因表达显著增加,抗凋亡基因表达显著降低,加入Z-VAD-FMK后促凋亡基因表达显著下降,抗凋亡基因表达显著增加。总之,在冻后孵育液中添加凋亡抑制剂Z-VAD-FMK能提高卵母细胞膜电位水平,降低细胞凋亡和相关基因表达,从而达到提高冻后猪卯母细胞体外发育能力的目的。     

猪MII期卵母细胞玻璃化冷冻后的凋亡途径研究

为阐明猪卵母细胞玻璃化冷冻后的细胞凋亡模式,本试验利用原位荧光染色技术对冻后卵母细胞死亡受体介导的外源性凋亡途径和线粒体介导的内源性凋亡途径中的Caspase 3、Caspase 8、Caspase 9和总Caspase活性进行检测,用RT-PCR技术对不同途径中关键基因进行mRNA表达检测。结果显示:猪MII期卵母细胞冷冻后,死亡受体外源性凋亡途径的Caspase 8荧光强度值(32.03)和线粒体内源性凋亡途径的Caspase 9荧光强度值(16.56),以及两者共同途径中的Caspase 3和总Caspase荧光强度值(16.70和8.43)均显著高于新鲜卵母细胞对照组所对应的荧光强度值(分别为4.02、4.83、4.23和3.08)。死亡受体外源性凋亡途径TNFα、FasL、CASP8和CASP3基因表达量也均有一定水平的提高,线粒体介导的内源性凋亡途径中CASP9、CASP3和P53基因表达水平呈上升趋势,而Bcl2、BAX、SOD1和survivin的基因表达水平显著下降。综上所述,死亡受体介导的外源性凋亡和线粒体介导的内源性凋亡共同参与了猪MII期卵母细胞冻后的凋亡过程。     

生长激素和胰岛素对体外培养猪COCs的影响

研究了生长激素(STH)和胰岛素(Insulin)对体外培养猪COCs卵母细胞成熟及孤雌激活后卵裂、卵丘细胞凋亡及凋亡相关基因Bcl-2、Bax表达的影响,结果表明:STH和Insulin对卵母细胞的成熟和激活后卵裂具有双重效应.培养液中添加适当浓度的STH(0.151μg·mL-1)或Insulin(51μg·mL-1)可提高卵母细胞成熟率和卵裂率,与对照组及其他试验组相比差异显著(P<0.05).在猪COCs体外成熟过程中,适当浓度STH和Insulin能抑制卵丘细胞凋亡,抑制Bax在卵丘细胞的表达.     

敲低TPX2对猪卵母细胞纺锤体组装及凋亡的影响

[目的]本研究旨在探究Xklp2靶蛋白(TPX2)在猪卵母细胞减数分裂过程中的表达定位及其潜在功能。[方法]采集猪卵丘-卵母细胞复合体(COC)并随机分组后进行体外成熟培养，通过间接免疫荧光染色与蛋白免疫印迹等方法检测TPX2在卵母细胞减数分裂过程中的亚细胞定位与动态表达情况；通过生发泡期(germinal vesicle, GV)显微注射特异性siRNA以敲低TPX2,研究其对卵母细胞减数分裂进程、纺锤体结构以及早期凋亡的影响。[结果]TPX2在第一次减数分裂中期(metaphaseⅠ,MⅠ)表达量显著上升，其亚细胞定位与α-微管蛋白(α-tubulin)的分布特点相似，并主要富集在纺锤体两极。TPX2被敲低后卵母细胞第一极体(PB1)排出率显著下降(P<0.05),且大多数细胞被阻滞在生发泡破裂期(GVBD)和第一次减数分裂后末期(ATⅠ),同时纺锤体结构异常比例显著升高(P<0.05),并伴随染色体排列紊乱。与对照组相比，敲低TPX2后卵母细胞早期凋亡率急剧增加(P<0.05),凋亡相关基因Caspase 3表达量以及Bax/Bcl2值显著升高(P<0.0...     

牛卵泡微环境对颗粒细胞和卵母细胞及早期胚胎发育的影响

[目的]研究卵泡微环境对颗粒细胞与卵母细胞质量及体外受精胚胎发育的影响。[方法]从不同直径大小的卵泡中收集卵母细胞和颗粒细胞,Hoechst33342染色观察卵母细胞核形态;采用Annexin-V-FITC/PI法染色、流式细胞仪检测颗粒细胞的凋亡情况;进行受精卵体外培养,并计算受精率及受精卵的囊胚率。[结果]大卵泡（〉10 mm）和小卵泡（〈3 mm）内颗粒细胞凋亡率明显高于3～7和7～10 mm卵泡内的颗粒细胞凋亡率（P〈0.05）大卵泡和小卵泡内的大量卵母细胞呈现出染色质固缩、核碎裂及胞浆浓缩等凋亡特征。3～7和7～10 mm卵泡内的卵母细胞成熟率明显高于大卵泡和小卵泡（P〈0.05）。来源于不同直径卵泡的卵母细胞,其卵裂率和囊胚率差异均不显著。[结论]卵泡微环境是影响牛胚胎体外生产的主要环节,直径为3～10 mm卵泡内颗粒细胞质量及卵母细胞的体外成熟率较高,卵泡直径对卵母细胞受精及受精卵的早期发育没有影响。     

猪MII期卵母细胞冷冻前后全基因组表达谱分析

为探究猪MII期卵母细胞冷冻前后基因表达的变化,采用猪全基因组表达谱芯片对其冷冻前后的基因进行表达谱分析,筛选出2倍以上差异表达基因,并利用生物信息学对这些基因进行GO和KEGG Pathway分析。结果表明:(1)猪卵母细胞玻璃化冷冻前后共获得2倍以上差异表达基因171个,其中冻后上调表达基因103个,下调表达基因68个;选取的6个差异表达基因的RT-PCR验证结果与芯片分析结果一致。(2)损伤应答、细胞凋亡、程序性细胞死亡、细胞坏死及蛋白激酶调节、RNA拼接、核mRNA拼接和mRNA代谢等参与了卵母细胞冻后基因差异表达的生物学过程;(3)胞外区、基底质膜、细胞外间隙、质膜、肌动蛋白细胞骨架、线粒体脊、线粒体、细胞器膜和线粒体包膜等参与了卵母细胞冻后基因差异表达的细胞组分调控;(4)类固醇结合、酶抑制剂的活性、激素结合、核苷酸结合、辅酶结合和ATP酶活等参与了卵母细胞冻后差异表达基因的分子功能调控。(5) KEGG Pathway分析表明,Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路、黏着连接和MAPK信号通路等参与了冻后卵母细胞的基因表达调控。综上所述,冷冻能造成猪MII期卵母细胞多系统的损伤,如线粒体损伤、凋亡、坏死、质膜损伤和RNA拼接与代谢异常等。     

猪胎儿卵母细胞发生早期的细胞凋亡变化

为研究猪卵母细胞发生早期卵巢上细胞的凋亡情况,制作妊娠33、40、46、54、61 d母猪胎儿卵巢的石蜡切片,并进行荧光染色。结果发现,母猪妊娠到33 d时,胎猪卵巢上即可见原始生殖细胞和卵原细胞的凋亡,随着妊娠时间的延长,凋亡也逐渐增加,妊娠33、40、46、54和61 d母猪胎儿卵巢上卵原细胞的凋亡率分别为3.13%、4.32%、5.50%、9.43%和11.10%,同时,颗粒细胞的凋亡率则分别为8.89%、12.45%、14.74%、17.96%和22.81%。结果说明,在猪胎儿卵母细胞发生早期,即开始发生了卵原细胞和颗粒细胞的凋亡,且有逐渐增加的趋势。     

萝卜愈伤细胞凋亡的初步研究

[目的]探明萝卜无菌苗组织培养过程中愈伤组织细胞凋亡的形态变化。[方法]以萝卜种子为材料,通过组织培养获得无菌苗和诱导出愈伤组织,利用离子胁迫诱导愈伤组织的细胞凋亡,并对其样品进行组织制片,染色后用光学显微镜观察与电镜超薄切片观察萝卜愈伤组织凋亡形态变化。[结果]在萝卜的细胞凋亡过程中存在和动物细胞凋亡类似的染色质浓缩、颗粒化和边缘化以及后期发生降解形成凋亡小体等现象。钠离子和钙离子对萝卜愈伤组织细胞凋亡的影响程度不同,钠离子影响不大,而钙离子对细胞凋亡影响较明显,且随着离子浓度的增加,凋亡所需时间越短。[结论]细胞凋亡的过程往往伴随染色质DNA的特异性断裂,形成寡聚核苷酸片段,电泳后形成DNA梯形带。     

昆虫细胞凋亡的线粒体通路研究进展

介绍了哺乳动物和一些代表昆虫的线粒体凋亡途径研究进展,特别是与线粒体途径密切相关的凋亡调控因子,如细胞色素C,caspases家族,Bcl-2家族等的功能作用,阐述了线粒体在昆虫细胞凋亡中的作用,为进一步研究昆虫细胞凋亡机制以及发展以昆虫细胞凋亡因子为靶标的特异性杀虫剂提供理论基础。     

葛仙米提取物诱导肝癌细胞HepG2凋亡的活性研究

[目的]研究葛仙米提取物诱导肝癌细胞HepG2凋亡的活性。[方法]采用二甲基四氮唑蓝（MTT）法测定细胞存活率,形态学法观察凋亡的特征性变化,AnnexinV/PI双染及PI单染流式细胞术法检测凋亡率。[结果]经不同浓度提取物作用后,HepG2细胞的生长受到显著抑制,并呈现时间-浓度依赖关系趋势。观察细胞形态,发现有凋亡特征性变化。AnnexinV/PI双染结果显示,癌细胞早期凋亡率随提取物浓度的升高而显著增高,最高可达79.2%。PI法同样显示凋亡的发生,其凋亡峰最大比率为9.6%,显著高于对照组。[结论]葛仙米甲醇提取物能够诱导肝癌细胞HepG2的凋亡。     

运动、胸腺细胞凋亡与机制研究

主要通过文献资料法,对细胞凋亡的机制及运动与胸腺细胞凋亡的关系等进行了述评,其中细胞凋亡与死亡受体信号转导途径、细胞凋亡与线粒体凋亡途径和细胞凋亡与内质网凋亡途径是本文论述的重点。结果显示,有关胸腺细胞凋亡的死亡受体信号转导途径机制和线粒体机制研究不多,有关胸腺细胞凋亡的内质网机制甚少。现有研究显示运动诱导胸腺细胞凋亡与线粒体凋亡途径关系密切,其他有待进一步研究证实。     

试验用和临床用紫杉醇诱导肝癌细胞凋亡的比较

[目的]为了探讨试验用和临床用紫杉醇对肝癌HepG2细胞凋亡诱导作用的差异。[方法]用不同浓度的试验用和临床用紫杉醇处理肝癌HepG2培养细胞后,通过显微观察和流式细胞术检测其细胞凋亡。[结果]临床用紫杉醇在终浓度为0.5、1.0和2.0 mg/ml时,24 h非常显著性诱导细胞凋亡,48 h诱导细胞凋亡更剧烈。试验用紫杉醇24 h在终浓度为2.5、5.0和10.0 mg/ml时,非常显著诱导细胞凋亡;当试验用紫杉醇浓度为2.5 mg/ml时,48 h诱导细胞凋亡更剧烈。当试验用紫杉醇浓度为5和10 mg/ml细胞凋亡率逐步变低,可能走向死亡。[结论]在诱导肝癌细胞凋亡中,试验用紫杉醇要比临床所用紫杉醇的浓度要高。     

DNA Ladder和ELISA联合检测PRRSV诱导Marc 145细胞凋亡动态变化规律的研究

对PRRSV诱导Marc145细胞凋亡的动态变化规律进行了研究,实验收集PRRSV SC1株感染Marc145细胞后0、24、48、72、96、120、144h和同一时间点未接毒的细胞样品,用DNALadder定性检测和ELISA定量检测细胞凋亡的变化规律。定性检测结果表明,PRRSV能诱导Marc145细胞发生凋亡,病毒感染后凋亡细胞DNA电泳呈典型“梯状”条带。定量检测结果表明,Marc145细胞在PRRSV感染后24h开始出现凋亡,48h凋亡更加明显,72h达到高峰,明显高于对照组。     

Role of the kinase MST2 in suppression of apoptosis by the proto-oncogene product Raf-1

The ablation of the protein kinase Raf-1 renders cells hypersensitive to apoptosis despite normal regulation of extracellular signal-regulated kinases, which suggests that apoptosis protection is mediated by a distinct pathway. We used proteomic analysis of Raf-1 signaling complexes to show that Raf-1 counteracts apoptosis by suppressing the activation of mammalian sterile 20-like kinase (MST2). Raf-1 prevents dimerization and phosphorylation of the activation loop of MST2 independently of its protein kinase activity. Depletion of MST2 from Raf-1-/- mouse or human cells abrogated sensitivity to apoptosis, whereas overexpression of MST2 induced apoptosis. Conversely, depletion of Raf-1 from Raf-1+/+ mouse or human cells led to MST2 activation and apoptosis. The concomitant depletion of both Raf-1 and MST2 prevented apoptosis.     

细胞凋亡及其在昆虫生理学研究中的意义

从细胞凋亡的概念、发生特点、形态学、生化特征和生物学意义方面进行了综述,并在近年昆虫细胞凋亡研究的基础上,阐述了细胞凋亡在其生理学研究上的重要意义。     

细胞凋亡对柔嫩艾美耳球虫入侵的影响

为了研究球虫与宿主细胞间相互关系,利用含有6%乙醇的DMEM完全培养基培养对MDBK细胞进行凋亡诱导,通过膜联蛋白V(Annexin V)/PI染色法、HE染色法和吖啶橙染色法来鉴定MDBK细胞的凋亡情况。蔗糖密度梯度离心法获得的柔嫩艾美耳球虫子孢子与诱导凋亡的细胞共培养1 h后,利用HE和吖啶橙染色法来研究子孢子入侵细胞的状况。结果显示,在诱导凋亡的细胞中,没有发现柔嫩艾美耳球虫的子孢子,对照组未诱导凋亡的细胞中有子孢子入侵。表明球虫无法入侵诱导凋亡的细胞,进一步揭示了球虫在入侵过程中可能存在的识别机制和入侵机制,为将来开发新疫苗和新药物提供了基础数据。     

金黄色葡萄球菌诱导牛原代乳腺上皮细胞的凋亡

【目的】观察金黄色葡萄球菌能否诱导牛原代乳腺上皮细胞发生凋亡。【方法】先以新鲜牛奶为材料分离培养牛乳腺上皮细胞并鉴定,然后用金黄色葡萄球菌侵染牛乳腺上皮细胞,采用普通光镜和扫描电子显微镜观察金黄色葡萄球菌诱导牛乳腺上皮细胞凋亡的形态学变化;用流式细胞仪（Annexin V/PI双染法）定量检测金黄色葡萄球菌感染对牛乳腺上皮细胞凋亡的诱导作用;RT-PCR检测细胞凋亡通路中关键蛋白caspase 3和caspase 8的变化情况。【结果】从乳汁中分离的细胞经原代培养后,细胞呈典型的铺路石状,细胞表层可产生大小不等的乳滴,RT-PCR法扩增出乳腺上皮细胞的骨架蛋白8特异性条带;免疫荧光细胞染色法结果显示分离培养的牛乳腺上皮细胞表达角蛋白8;金黄色葡萄球菌感染牛乳腺上皮细胞3 h后,可诱导牛乳腺上皮细胞发生凋亡,表现为细胞核皱缩,染色质边缘化和细胞浆内空泡增多等典型凋亡特征;Annexin V/PI双染法检测后发现,与对照组相比,感染组细胞凋亡率明显升高,差异极显著（P﹤0.01）;与对照组相比,感染组细胞caspase3及caspase 8表达量明显增高。【结论】金黄色葡萄球菌可以诱导牛原代乳腺上皮细胞凋亡,具有细胞凋亡的典型形态特征和生化特性,凋亡通路可能涉及caspase 3和caspase 8参与的外源性凋亡途径。