草鱼PepT2基因的克隆及其表达分析

采用RT–PCR和cDNA末端快速扩增技术克隆草鱼(Ctenopharyngodon idellus) II型小肽转运载体(PepT2)基因全长cDNA序列,对其进行生物信息学和共线性分析,并采用实时荧光定量PCR技术检测分析健康草鱼PepT2基因在不同组织中的表达情况。结果表明：草鱼PepT2基因的cDNA序列全长为2733 bp,包括开放阅读框2169 bp(编码722个氨基酸残基),5′非编码区82 bp和3′非编码区482 bp;草鱼PepT2基因结构含有20个外显子和19个内含子;预测蛋白相对分子质量为8.032×104,等电点为6.01,该蛋白具有与哺乳动物同源蛋白类似的12个螺旋跨膜结构,并且在跨膜区9和10之间有1个大的外环,跨膜区氨基酸高度保守,含有6个蛋白激酶C磷酸化位点和3个N–糖基化位点;预测的PepT2蛋白三级结构包含有18个α–螺旋和21个β–折叠;氨基酸序列同源性分析结果显示,草鱼PepT2氨基酸序列与斑马鱼(Danio rerio)的同源性最高,为86.65%,与其他所比较的物种的同源性则为52.83%~68.15%;系统进化树分析表明,草鱼与斑马鱼的亲缘关系最近;与斑马鱼相比,草鱼PepT2所在的染色体保留着大多数基因,具有保守的基因块;实时荧光定量表达分析表明,草鱼PepT2在肠道中的表达量最高,在肾脏中的表达量次之。     

百子莲生长素受体基因TIR1的全长cDNA克隆及功能分析

采用cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)方法获得百子莲生长素受体TIR1基因cDNA全长序列,对该序列进行生物信息学分析的结果显示,TIR1基因的mRNA序列全长为2 235bp;5’非编码区296bp,3’非编码区172bp;该基因的ORF全长为1 764bp,编码一个含有588个氨基酸的蛋白。百子莲TIR1推导蛋白序列与葡萄(Vitis vinifera)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)、高粱(Sorghum bicolor),玉米(Zea mays)等植物均具有较高的同源性,同源性最高的是葡萄,可达78%。系统进化树表明,百子莲与葡萄距离最近。由α-螺旋,随机卷曲和延伸链组成一个磁状结构,为亲水蛋白,疏水性值为-0.092,在百子莲体细胞胚胎发生过程中,实时荧光定量PCR结果表明TIR1基因表达量在愈伤组织中含量最低,在胚性愈伤组织和体细胞胚胎中含量均有所升高,而在体胚幼苗中表达量最高,表明该基因介导的生长素信号在体细胞胚胎发生过程中发挥着非常重要的作用。     

黄颡鱼DMRT1基因cDNA全长克隆及其表达分析

利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆了黄颡鱼DMRT1基因cDNA全长序列,并利用实时荧光定量RT-PCR技术对该基因在黄颡鱼成体不同组织及不同发育阶段的表达情况进行研究。结果表明,黄颡鱼DMRT1基因cDNA序列全长1 381bp,其中5′端非翻译区30bp,3′端非翻译区454bp[不包括poly(A)],开放阅读框885bp,编码295个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明,黄颡鱼DMRT1基因与革胡子鲶同源性最高(为81%),与黑鲷、虹鳟、斑马鱼、青鳉的同源性分别为60%、59%、64%和52%,与小鼠、人的同源性较低,分别为42%和44%。实时荧光定量RT-PCR分析表明:DMRT1基因在黄颡鱼胚胎发育阶段及胚后发育的1～51d仔鱼均有表达,且在胚后发育的第31天表达量最高;在成体,只在雄性精巢中特异性表达,其他组织均无表达,且性腺发育阶段的Ⅳ期精巢表达量最高,表明该基因可能在黄颡鱼雄性性腺的形成或功能维持上具有重要作用。     

木薯蔗糖磷酸合成酶基因克隆及组织表达分析

通过同源克隆从木薯品种辐选01(RS01)中获得SPS基因保守序列,利用RACE扩增技术获得全长cDNA序列并使用相关软件进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR分析木薯SPS基因在不同时期、不同组织中的相对表达量。结果表明:克隆获得的木薯SPS基因cDNA序列全长3 857bp,开放阅读框(ORF)长3 228bp,编码1 076个氨基酸,命名为MeSPS(GenBank登录号KX822780);同源性分析表明,MeSPS基因与麻风树、蓖麻和荔枝的SPS基因序列同源性较高,分别为89%、89%和87%;其氨基酸序列与其他植物SPS氨基酸同源性在77%~92%;经qRT-PCR分析结果表明,MeSPS在苗期的相对表达量较高;在同一生长时期,MeSPS在叶片中相对表达量高于茎段和块根。     

红花查尔酮异构酶基因全长cDNA的克隆及表达分析

【目的】克隆红花(Carthamus tinctorius L.)黄酮合成途径中的关键酶查尔酮异构酶(Chalcone isomerase,CHI)基因的全长序列,研究其组织表达特异性,为红花代谢调控研究提供参考。【方法】利用RT-PCR技术克隆CHI基因的cDNA全长,并对其全长基因进行生物信息学分析;构建系统发育树,研究其与相似序列的同源性;利用实时荧光定量PCR方法,分析CHI基因在红花不同开花时期的表达量。【结果】CHI基因全长1 161bp,开放阅读框长654bp,编码217个氨基酸,理论分子质量约为23.14ku,等电点为5.67,序列含有典型的加尾信号序列AATAA和Poly(A)。系统发育树表明,该基因与其他物种CHI基因具有较高的同源性,其中与青木香的同源性最高,达到82%。实时荧光定量PCR结果表明,CHI基因在红花花蕾期的表达量最高。【结论】克隆得到了红花CHI基因,其在红花花蕾期的表达量最高。     

黄喉拟水龟肺炎克雷伯菌外膜蛋白 A 的原核表达与纯化

【目的】克隆黄喉拟水龟肺炎克雷伯菌外膜蛋白A(KpOmpA)基因,构建重组质粒并诱导其表达,纯化获取重组蛋白KpOmpA,为黄喉拟水龟抗肺炎克雷伯菌的相关疫苗研究奠定基础。【方法】以黄喉拟水龟肺炎克雷伯菌DNA为模板,克隆获得KpOmpA基因后与pET-32a表达载体连接;将构建的重组质粒pET-32aKpOmpA转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导,通过SDSPAGE电泳检测KpOmpA重组蛋白的表达情况,并对重组蛋白进行可溶性分析;经Ni-IDA琼脂糖纯化树脂柱纯化KpOmpA重组蛋白,应用Western blot方法鉴定纯化蛋白。【结果】KpOmpA基因CDS序列全长为1 071 bp,推定编码356个氨基酸,与其他肺炎克雷伯菌的OmpA氨基酸序列同源性超过99%,高度保守。重组质粒pET-32a-KpOmpA经双酶切、测序确认基因序列无移码或突变,表明重组质粒成功构建。转化后的BL21感受态细胞经终浓度为1 mmol/L IPTG在37℃下诱导4 h后进行SDS-PAGE检测,结果表明,KpOmpA重组蛋白大量表达,以包涵体形...     

‘辽宁2号’DELLA蛋白编码基因的克隆及表达分析

以‘辽宁2号’核桃的叶片为试材,通过同源克隆和RACE技术克隆DELLA家族蛋白的编码基因,并进行了同源性分析和氨基酸序列的多重比对;通过实时荧光定量PCR分析了该基因在‘辽宁2号’核桃中的组织特异性表达情况。主要研究结果如下:获得了DELLA蛋白编码基因的cDNA全长,命名为JrGAI(Genebank:JF766606),cDNA全长为2 361bp,包含1 842bp编码区序列,推测其编码的蛋白包含613个氨基酸,分子量为66.78kDa。同源性分析及氨基酸序列的多重比对结果表明该蛋白与其他物种的DELLA蛋白高度相似,并且具有完整的DELLA、TVHYN、VHIID、RVER和SAW等结构域;实时荧光定量PCR结果显示JrGAI基因在‘辽宁2号’核桃的叶芽、混合花芽、叶片、雄花、茎段和果实中普遍表达,并且在休眠期组织中具有较高的表达量,其中以休眠期的混合花芽中的表达量最高。     

广西草龟GH基因全序列克隆及测序分析

[目的]了解广西草龟生长激素(GH)基因全序列结构特点及其与其他物种间的关系,为进一步研究GH基因的结构、功能、遗传变异规律及其与生产性能的关系提供科学依据.[方法]根据GenBank上已公布的黄喉拟水龟GH基因序列设计合成9对特异性引物,以广西草龟基因组DNA为模板进行PCR扩增,所获得目的片段经纯化、克隆、鉴定和测序后,用Vector NTI Advance 10软件将各扩增序列拼接,获得草龟生长激素基因全序列,并用DNASTAR软件MegAlign程序中的Alignment Report和NCBI的BLAST对草龟GH基因全序列进行同源性比对分析及构建基于GH基因编码序列的物种间亲缘进化树.[结果]广西草龟GH基因全长8538 bp,与黄喉拟水龟GH基因全长8517 bp相比,二者的同源性高达98%,其中有118个碱基发生突变,插入37个碱基,14个位点发生碱基缺失;与鸡、鸭、鹌鹑、鸵鸟、红树林蛇的同源性分别为88%、83%、87%、86%和84%.[结论]GH基因编码序列具有较高的保守性.     

荸荠淀粉合成酶AGPase的基因克隆及表达分析

【目的】克隆荸荠ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase)小亚基基因EdAPS1的cDNA序列,并分析其序列特征及其在荸荠不同组织和球茎发育过程中的表达情况,为研究荸荠淀粉生物合成机制提供理论依据。【方法】通过RT-PCR技术从荸荠球茎中克隆EdAPS1基因的cDNA序列,采用生物信息学方法对其序列和所编码的蛋白进行预测分析,利用实时荧光定量PCR技术检测EdAPS1基因在荸荠不同组织和球茎发育过程中的表达情况。【结果】克隆获得的EdAPS1基因cDNA序列全长1716 bp,包含1个1521 bp开放阅读框(ORF),编码506个氨基酸。EdAPS1蛋白分子式为C_(2469)H_(3896)N_(672)O_(746)S_(23),相对分子量为55.67 kD,等电点为5.98,具有NTP_transferase和PbH1结构域。同源性和系统进化树分析结果表明,EdAPS1蛋白与不同植物相应蛋白的同源性在68.80%～86.91%,其中与油莎草相应蛋白(ALL29329.1)的亲缘关系最近。荧光定量PCR分析结果表明,EdAPS1基因在荸荠不同组织中均有表达,其中在球茎的表达量最高,与在其他组织的表达量差异显著(P0.05,下同),尤其在球茎发育后期的表达量更高,且显著高于球茎其他发育时期。【结论】从荸荠中成功克隆了EdAPS1基因,可为后续阐明荸荠淀粉生物合成机制及培育高淀粉荸荠品种提供参考依据。     

黄颡鱼神经肽Y基因(NPY)cDNA全序列的克隆及其表达特征分析

【目的】克隆黄颡鱼神经肽Y基因(NPY),研究其在不同组织及在饥饿情况下脑组织中的表达情况,探讨其在黄颡鱼摄食活动中的作用。【方法】利用RT-PCR和RACE技术,克隆黄颡鱼NPY基因的cDNA序列全长,对其编码氨基酸进行生物信息学分析;利用半定量PCR和实时荧光定量PCR技术,对NPY基因在黄颡鱼成体不同组织(脑、心脏、肝脏、肾脏、脾脏、胃、肌肉、鳃、性腺)中的表达情况进行研究,并检测饥饿不同时间(0,24,48,72,96,120,144和168h)以及饥饿168h重新投饵1,3和5h后黄颡鱼脑组织中NPY表达水平的变化。【结果】黄颡鱼NPY基因cDNA序列全长772bp,开放阅读框282bp,编码93个氨基酸,其与瓦氏黄颡鱼同源性最高(97%),与斑点叉尾鮰、建鲤、胭脂鱼、中华倒刺鲃的同源性分别为87%,72%,72%和70%。NPY基因在黄颡鱼成体组织脑、脾脏、肝脏、鳃、性腺中都有表达,而在心脏、肌肉、胃、肾脏中不表达,在脑中的表达量极显著高于其他组织(P<0.01);在饥饿处理24～144h时,随饥饿时间的增加,黄颡鱼脑组织中NPY表达量升高,但在饥饿168h重新投饵3h后,NPY表达量即可下降到正常水平。【结论】NPY基因在黄颡鱼脑中大量表达,随着饥饿时间的增加脑组织中NPYmRNA表达量上升,重新投饵后其表达量很快下降到正常水平,表明NPY基因在黄颡鱼摄食活动中发挥着重要作用。     

马铃薯乙烯响应因子基因的克隆表达及生物信息学分析

根据番茄ERF5基因(NM_001247583.1)序列设计引物,采用RT-PCR方法得到马铃薯ERF基因的cDNA,并对其进行生物信息学及表达分析.结果表明:该cDNA全长789bp,阅读框为732bp,编码243个氨基酸.序列同源性分析表明该基因序列与番茄ERF5基因的序列同源性达82%,氨基酸序列同源性达70%.对该马铃薯ERF基因的氨基酸序列经BLAST进行多序列比对,发现该氨基酸序列的98～160bp为AP2结构域,属于AP2/EREBP转录因子的EREBP亚族ERF类.蛋白质三级结构预测表明该基因的AP2结构域非常保守.对ERF基因进行荧光定量PCR分析,表明该基因可能参与了马铃薯块茎解除休眠与发芽过程的调控.     

白菜型油菜MPK12基因克隆及表达分析

【目的】克隆白菜型油菜‘陇油6号’MPK12基因的全长cDNA序列,研究其组织表达特异性,分析MPK12基因在低温、盐、ABA和H_2O_2处理下的表达情况,以阐明MPK12基因在油菜中的生物学功能。【方法】利用RACE技术克隆MPK12基因cDNA全长,并对其全长基因进行生物信息学分析;构建系统发育树,研究其与相似序列的同源性;利用实时荧光定量PCR方法,分析MPK12基因的组织表达特异性以及在低温、盐、ABA和H_2O_2逆境胁迫下的表达情况。【结果】油菜MPK12基因cDNA全长1 395bp,包括5′-UTR 69bp,3′-UTR 207bp,开放阅读框1 119bp,编码372个氨基酸,预测蛋白质分子量42.6ku,理论等电点为7.9,二级结构主要包括α-螺旋和不规则卷曲。多序列比对和系统进化分析表明,油菜MPK12与拟南芥AtMPK12具有很高的同源性,为90.7%。实时荧光定量PCR结果显示,MPK12基因在油菜根、茎、叶、芽和种子中均有表达,没有组织特异性;同时,该基因的表达受低温、盐、ABA和H_2O_2胁迫诱导。【结论】克隆得到油菜MPK12基因,其在油菜适应逆境胁迫过程中发挥作用。     

菊花脑热激蛋白70基因的克隆及表达分析

采用同源克隆结合RACE技术从菊花脑叶片中克隆菊花脑(Chrysanthemum nankingense)热激蛋白70基因(hsp70)的cDNA序列,并通过荧光定量PCR(qRT–PCR)分析菊花脑在40℃高温下热激不同时间(0、0.5、1、2、3、6 h)后叶片中hsp70基因的表达差异。结果表明,克隆的cDNA序列全长2 224 bp,与水母雪莲花、紫茎泽兰的hsp70基因在核苷酸和氨基酸水平的同源性分别为88%、98%,表明该序列为菊花脑的hsp70基因序列(GenBank登录号,KJ561911),命名为Cnhsp70。Cnhsp70基因的开放阅读框为1 944 bp,其编码的蛋白(647个氨基酸)的相对分子质量约为70 900,含有HSP70家族序列标签。qRT–PCR分析的结果表明,Cnhsp70基因的表达在热激后短时间内迅速上调,热激3 h达到最高,热激6 h时表达量迅速下调。     

鸭肝脏基础型脂肪酸结合蛋白Lb-FABP基因的克隆、组织表达谱和序列特征分析

 【目的】克隆仙湖肉鸭肝脏基础型脂肪酸结合蛋白Lb-FABP基因的cDNA,并进行组织表达谱和蛋白结构分析,为肉鸭的分子育种提供基础资料。【方法】通过比较基因组学,采用RT-PCR和RACE技术,获得了Lb-FABP基因的cDNA序列全长序列;并采用半定量PCR分析了Lb-FABP基因在16个组织的表达;通过生物信息学方法预测了Lb-FABP基因的蛋白结构。【结果】仙湖肉鸭Lb-FABP基因的cDNA全长548bp,包括97bp长的5′非翻译区(5′UTR)和70 bp长的 3′非翻译区(3′UTR)以及381 bp开放阅读框(ORF,含终止密码子)。Lb-FABP基因组序列包括4个外显子和3个内含子,3个内含子分别长为991 bp、292 bp和713 bp。在所检测的16个组织中Lb-FABP基因mRNA均有表达,尤其在肝脏组织中的表达明显高于其它组织。Lb-FABP理化性质表明该蛋白为一偏碱性蛋白,无明显的信号肽和跨膜区域;蛋白二级结构主要由β折叠和少量的α螺旋、loop环构成,预测发现在第5—22氨基酸残基处存在一个细胞溶质脂肪酸结合蛋白活性功能区;其三维结构由反向平行的10条β链及2条短α链组成的有一开口的“蛋白桶”构成。Lb-FABP基因氨基酸序列与鸡的该基因氨基酸的相似性为97.0%,与其它非哺乳脊椎动物的同源性达80%以上,比对尚未发现哺乳动物存在该基因。【结论】成功克隆肉鸭Lb-FABP基因cDNA序列以及基因组序列,该基因在肝脏组织的表达高于其它组织,并获知在5—22氨基酸处存在其蛋白活性功能区。     

暴马桑黄羊毛甾醇14α-脱甲基酶基因的克隆、序列分析及原核表达

为深入了解暴马桑黄三萜合成途径的调控机理,基于前期测得的转录组数据,同时结合基因组数据(GenBank登录号为LNZH00000000.2),筛选得到暴马桑黄羊毛甾醇14α-脱甲基酶(lanosterol 14-alpha-dem-ethylase,LSD)基因序列,并设计特异引物.以暴马桑黄菌丝体总RNA反转录得到的cDNA为模板,采用PCR技术克隆得到LSD基因cDNA序列全长,命名为SbLSD1(登录号为MN640689).序列分析结果表明,SbLSD1基因cDNA序列全长1 746 bp,编码581个氨基酸,分子量为65.96 ku,没有信号肽,在53～75位氨基酸序列之间含有一个跨膜螺旋结构,属于P450超家族成员.系统发育分析表明,暴马桑黄LSD1蛋白和灵芝LSD蛋白同源性最高.将SbLSD1基因cDNA序列构建到原核表达载体pET-32a上,获得重组质粒pET-32a-SbLSD1,然后将其转入Escherichiia coli BL21中进行SbLSD1蛋白诱导表达.SDS-PAGE结果显示,SbLSD1基因成功表达出蛋白,并在63～75 ku出现与预期大小一致的蛋白条带.通过对SbLSD1基因的克隆及表达分析,为进一步研究该基因在暴马桑黄三萜生物合成过程中的功能奠定基础.     

油菜BnICE1的克隆及表达分析

【目的】从超强抗寒油菜品种陇油6号中克隆抗寒转录因子BnICE1,并对其进行序列特征分析,研究BnICE1在低温胁迫下表达水平的变化,探讨BnICE1对油菜耐低温胁迫能力的影响。【方法】利用RACE技术获得油菜BnICE1全长的cDNA序列。对该序列进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR研究BnICE1低温及不同组织表达量。【结果】cDNA片段全长1 737 bp,包含1 500 bp完整的开放阅读框,该基因编码499个氨基酸残基,分子量53.2 kD,等电点5.0。序列比对表明,该蛋白C端含有一个典型的bHLH结构域,与其它植物的ICE1蛋白具有较高的同源性,因此命名为BnICE1（GenBank登录号为JF268687）。进化树分析表明,BnlCE1同羊草和白菜亲缘关系较近。实时荧光定量PCR结果表明,该基因在油菜茎、叶和下胚轴均有表达,下胚轴中表达量最高,同时该基因的表达受低温胁迫诱导。【结论】从油菜中克隆了抗寒基因BnICE1,实时荧光定量PCR分析表明其在油菜适应低温胁迫的过程中发挥作用。     

当归甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的克隆及组织稳定性分析

通过同源比对查找GAPDH基因的保守区,运用逆转录PCR、同源克隆及cDNA末端快速克隆(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)等技术从当归中克隆GAPDH基因的全长cDNA序列,利用生物信息学分析工具对该基因编码蛋白的基本性质、结构特点及生物学功能进行初步预测,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析当归GAPDH基因的表达稳定性。结果表明,克隆得到当归GAPDH基因cDNA全长序列为1 345个核苷酸,开放阅读框(open reading frame,ORF)为1 005 bp,3’UTR和5’UTR长度分别为268 bp和72 bp,共编码334个氨基酸,该基因命名为AsGAPDH。AsGAPDH基因编码蛋白的预测相对分子质量为36.3 kD,理论等电点为7.06,为亲水性非分泌型蛋白,与伞形科植物白芹的亲缘关系最近。AsGAPDH基因在当归根、叶柄及叶中的表达量相近且稳定性好,扩增特异性强。     

马尾松PmMYB169基因的克隆及表达分析

MYB基因家族在植物生长发育和应答逆境胁迫中有重要作用.通过RT-PCR和RACE技术从马尾松中克隆获得了PmMYB169全长cDNA序列,分析了其在低磷胁迫下的表达特性.PmMYB169全长为1 407bp,开放阅读框为927bp,编码308个氨基酸.生物信息学分析表明,PmMYB169蛋白序列中存在MYB家族结构区域,属于R2R3类MYB转录因子;同源性分析表明,PmMYB169在MYB家族保守区域上同源性较高,它与北美云杉亲缘关系最近.荧光定量PCR对低磷胁迫下PmMYB169的表达分析结果表明,PmMYB169的表达量随低磷胁迫时间延长呈上调趋势,说明PmMYB169参与了低磷胁迫应答;对不同组织的表达分析发现,PmMYB169为组成型表达,在马尾松根茎叶中均有表达,以叶的表达量最高.     

多枝赖草谷胱甘肽还原酶基因的克隆及分析

以盐胁迫处理的多枝赖草(Leymus multicaulis)植株新鲜叶片为材料,根据其他植物谷胱甘肽还原酶(GR)氨基酸保守区序列设计简并引物,通过RT—PCR扩增到1个408 bp的cDNA片段(Genbank注册号为 AY781786);利用DNAMAN软件将5’和3’RACE获得的5’和3’端序列,拼接成1个全长1 580 bp的cDNA序列,其包含1个1 140 bp的开放阅读框架,该阅读框架编码380个氨基酸;多枝赖草谷胱甘肽还原酶氨基酸序列与其他植物的同源性为77％～92％,定量PCR结果表明,GR基因的表达随着盐胁迫时间和盐浓度的增加而加强。