龙眼子叶胚3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的cDNA克隆及序列分析

从龙眼子叶胚中分离得到一个大量表达的表达序列标签(EST),该EST编码序列与金鱼草3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)基因的同源性为84%,利用cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆了龙眼GAPDH基因全长序列.序列分析表明,龙眼GAPDH基因的cDNA全长为1395 bp,包括一个长1008 bp、编码336个氨基酸的开放阅读框(ORF),5′端非编码区(UTR)长71 bp,3′-UTR长316 bp.龙眼GAPDH基因编码的氨基酸序列与水稻、葡萄、小果野蕉、拟南芥、银杏等GAPDH基因的氨基酸序列同源性均高达85%以上,该基因在GenBank中的登录号为FJ694011.     

刺五加GAPDH 基因全长cDNA 的克隆与生物信息学分析

采用cDNA末端RACE技术,从刺五加叶片中克隆到GAPDH基因cDNA的全长序列,并运用生物信息学方法对该基因的cDNA序列、保守区、氨基酸序列、亲缘关系等特征进行分析,并预测其编码蛋白质的结构和功能.研究结果表明,刺五加GA PGH基因的cDNA全长为1 437 bp,开放阅读框全长为1 023 bp,编码一个具有340个氨基酸残基的蛋白,蛋白分子质量为37.070 ku,理论等电点(pI)为7.71.刺五加GAPDH蛋白不存在跨膜结构域,定位于细胞质中,属于亲水蛋白.     

‘辽宁2号’DELLA蛋白编码基因的克隆及表达分析

以‘辽宁2号’核桃的叶片为试材,通过同源克隆和RACE技术克隆DELLA家族蛋白的编码基因,并进行了同源性分析和氨基酸序列的多重比对;通过实时荧光定量PCR分析了该基因在‘辽宁2号’核桃中的组织特异性表达情况。主要研究结果如下:获得了DELLA蛋白编码基因的cDNA全长,命名为JrGAI(Genebank:JF766606),cDNA全长为2 361bp,包含1 842bp编码区序列,推测其编码的蛋白包含613个氨基酸,分子量为66.78kDa。同源性分析及氨基酸序列的多重比对结果表明该蛋白与其他物种的DELLA蛋白高度相似,并且具有完整的DELLA、TVHYN、VHIID、RVER和SAW等结构域;实时荧光定量PCR结果显示JrGAI基因在‘辽宁2号’核桃的叶芽、混合花芽、叶片、雄花、茎段和果实中普遍表达,并且在休眠期组织中具有较高的表达量,其中以休眠期的混合花芽中的表达量最高。     

白背飞虱海藻糖合成酶基因的克隆及序列分析

为进一步深入研究白背飞虱的迁飞能力与能量代谢,利用同源克隆及RACE的方法,从白背飞虱Soga-tella furcifera中克隆获得海藻糖合成酶基因(TPS)的全长cDNA序列(Genbank登录号:JQ013797),该基因全长为3 278bp,包含353bp的3非编码区域(UTR)和501bp的5UTR,开放阅读框(ORF)为2 424bp,编码807个氨基酸。该基因预测的蛋白分子量为90.372kD,等电点为6.08,有3个预测的糖基化位点,无信号肽及跨膜结构。进化分析结果表明:白背飞虱的海藻糖合成酶与其它昆虫的海藻糖合成酶基因的同源性较高,与褐飞虱相比较同源性高达98%。     

白背飞虱海藻糖酶Treh-2基因克隆及生物信息学分析

利用同源克隆及RACE方法,从白背飞虱Sogatella furcifera中克隆获得海藻糖酶基因(Treh-2)全长cDNA序列(GenBank登录号:JX204291),该基因全长为2 065 bp,包含73 bp 3,UTR和150 bp5,UTR,开放阅读框(ORF)为1 842 bp,编码613个氨基酸.该基因预测蛋白分子质量为70.45 ku,等电点为5.65,有5个预测糖基化位点,有1个信号肽结构.进化分析结果显示,白背飞虱海藻糖酶Treh-2与其他昆虫海藻糖酶Treh-2同源性较高,与灰飞虱相比,同源性为95％,与褐飞虱相比较,同源性为93％.海藻糖酶Treh-2基因克隆和比较分析为进一步深入研究白背飞虱迁飞能力与能量代谢具有重要意义.     

斑茅过氧化氢酶基因(EaCAT-1a)克隆与序列分析

斑茅是栽培种甘蔗最重要的近缘物种之一,具有抗逆性强等特点。本文以高粱过氧化氢酶基因(NCBI登录号为XM002437586.1)c DNA序列为探针,对甘蔗属EST数据库进行同源检索、筛选和拼接,后经基因组PCR、分子克隆、序列分析验证成功分离了1个斑茅过氧化氢酶基因DNA序列(Ea CAT-1a,Gen Bank登录号为KF864223)。该序列全长3831 bp,包含8个外显子和7个内含子,c DNA序列长为1532 bp,包含10 bp的5’非翻译区(UTR)和43 bp的3’UTR,以及一个1479 bp的开放读码框,编码492个氨基酸,此蛋白序列具有过氧化氢酶保守结构域,属于CAT家族。将推测的Ea CAT-1a蛋白序列与高粱、水稻、玉米等物种进行同源进化分析,均表现出较高的保守性。     

虹鳟PDCD6基因cDNA全长的克隆与功能预测

程序性死亡因子6（PDCD6）基因编码1个含EF-hand结构域的钙离子结合蛋白。应用逆转录PCR及cDNA末端快速扩增（RACE）技术从虹鳟（Oncorhynchus mykiss）脑组织中克隆了PDCD6基因cDNA的全序列（GenBank No：FJ591154）。序列全长1 179bp,其中5’端非翻译区长48bp,3’端非翻译区长567bp,开放性阅读框长564bp,编码187个氨基酸。电子表达谱分析结果表明该基因在4种脊椎动物的多个部位或组织中均有表达。同源模建蛋白三级结构显示该蛋白具有8个主要的α螺旋结构。虹鳟PDCD6蛋白序列与斑马鱼、非洲爪蟾、人、小鼠和鸡的同源性均高于85%,表明PDCD6基因在进化过程中是高度保守的,在细胞程序性死亡过程中发挥重要作用。     

叶用莴苣热激蛋白LsHsp70-1707基因的克隆及表达分析

为了解叶用莴苣热激蛋白LsHsp70-1707基因在高温下的作用机制,通过同源克隆及RACE技术克隆并获得叶用莴苣热激蛋白LsHsp70-1707基因全长cDNA序列,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析基因在不同叶用莴苣品种中的表达量差异。该基因全长2 400bp(KP258179),开放阅读框为2 106bp,编码701个氨基酸,与西瓜(AAC03416.1)、牵牛花(ABZ04081.1)、黄瓜(CAA52149.1)、菠菜(AAB91471.1)等HSP70蛋白高度同源。实时荧光定量PCR结果表明:高温处理时,该基因在热敏品种中表达没有明显增加,随着处理时间的增加甚至表现为下调,而在耐热品种中,其表达上调。成功克隆得到叶用莴苣热激蛋白LsHsp70-1707基因,热胁迫下该基因在不同品种中的表达有一定的差异性,推测该基因可能与叶用莴苣耐热性相关。     

华山新麦草蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶基因Ph-1-SST的克隆及序列分析

蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶基因1-SST在植物逆境胁迫反应中起重要作用。为了挖掘华山新麦草(Psathyrostachys huashanica Keng)抗非生物胁迫关键功能基因,以华山新麦草叶片为材料,利用RT-PCR结合RACE技术克隆1-SST基因的全长cDNA,命名为Ph-1-SST,登录号为KX761897。通过PCR法扩增其gDNA序列,测序结果表明该基因的gDNA和cDNA序列长度分别为3 344bp和2 001bp,编码666个氨基酸残基,序列结构分析结果表明该基因含4个外显子3个内含子,预测该蛋白相对分子质量为72.9ku,理论等电点为4.87。序列比对显示,该基因与大麦1-SST基因编码蛋白的相似性最高(90%),为糖基水解酶32家族成员。对1-SST氨基酸序列的系统进化树分析显示,Ph-1-SST及其同源蛋白位于不同分支,初步推断此全长cDNA是华山新麦草中编码蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶的一个新基因。结果为作物非生物胁迫改良提供重要基因资源。     

橡胶树PEPC基因的克隆、生物信息学和表达分析

【目的】克隆橡胶树磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)基因的全长cDNA,通过生物信息学和基因表达分析,为基因功能研究奠定基础。【方法】根据橡胶树PEPC基因片段序列设计引物,通过RACE获得cDNA全长,用DNAMAN软件预测编码多肽序列,用Prot Param工具分析多肽基本理化性质,用NCBI-Blast工具搜索同源的核酸及多肽序列,用Clustal X2.0软件比对不同植物来源的多肽序列,并用MEGA 6.06软件构建系统进化树,用Real-time RT-PCR分析基因表达模式。【结果】从橡胶树胶乳中克隆到一个新的PEPC基因的全长cDNA,其长度为3206 bp,包含一个2898 bp的开放读码框(ORF),112 bp的5’UTR和196 bp的3’UTR。预测该基因编码965个氨基酸的多肽(HbPPC2),其分子量为110.35 kDa,等电点为5.76;该基因的编码区核苷酸序列和其编码多肽氨基酸序列分别与早期克隆的橡胶树HbPPC1基因(KJ721228)的编码区和编码多肽序列有81.3%和92.1%的同源性。预测HbPPC2定位于细胞质,为不稳定蛋白,其活性受多种因素调控。预测HbPPC2酶活性中心是其第172位残基His,磷酸化位点是其第11位残基Ser,单泛素化位点是其第628位残基Lys。其第178、179、226和366位残基Arg在三维结构中靠近,构成葡萄糖-6-磷酸(G6P)的结合位点;其第450、641、753、767位残基Arg在三维结构中靠近,构成PEP的结合位点。HbPPC2基因在叶片、树皮、胶乳、雄花、雌花均有表达,在胶乳表达量最高;乙烯利处理显著下调该基因在胶乳的表达。【结论】本研究可为橡胶树PEPC功能研究提供理论基础。     

白背飞虱HSP90全长cDNA的克隆与特性分析

利用同源克隆及RACE的方法,从白背飞虱Sogatella furcifera中克隆获得热激蛋白HSP90基因的全长cDNA序列(Genbank登录号:JQ743628),该基因全长为2 707bp,包含421bp的3′非编码区域(UTR)和93bp的5′UTR,开放阅读框(ORF)为2 193bp,编码730个氨基酸。该基因预测的蛋白分子量为83.85kD,等电点为4.94,无信号肽、糖基化位点及跨膜结构。在N端具有HSP90基因保守的ATPase结构,含有HSP90家族的C末端的保守序列MEEVD。从进化分析结果看出,白背飞虱的HSP90与其它昆虫的HSP90蛋白的同源性较高,与褐飞虱相比较,同源性高达98%。HSP90基因的克隆和比较分析为进一步深入研究白背飞虱的抗逆机理、耐受性及进化具有重要意义。     

太子参GAPDH基因的克隆及序列分析

为了获取可靠内参基因,采用同源克隆技术和c DNA末端快速延伸技术,首次从太子参中克隆3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)的部分c DNA序列,命名为Ph GAPDH,序列长度为981 bp,包含699 bp的部分阅读框,推测其编码232个氨基酸,还含有282 bp的3'UTR。序列分析结果表明,太子参Ph GAPDH基因编码的氨基酸序列与同科植物香石竹(Dianthus caryophyllus)氨基酸序列同源性高达99%。PCR分析结果表明,Ph GAPDH基因在太子参不同种源块根、同一种源不同组织及不同生长时期的表达水平较稳定,可以作为太子参功能基因研究的内部参考基因。     

川西高原黑唇鼠兔乳酸脱氢酶C基因cDNA的克隆及序列分析

[目的]为研究以鼠兔LDH-C4为靶蛋白的节育型鼠药奠定基础。[方法]采用简并引物PCR克隆得到黑唇鼠兔LDH-C基因的EST序列,再根据EST序列采用RACE技术克隆出基因的开放阅读框（ORF）全长,和3’UTR序列。[结果]整个cDNA全长1 498 bp,其中ORF长996 bp,编码332个氨基酸,3’UTR长486 bp。ORF序列比对显示LDH-C基因在大的分类单位上均很保守。系统树分析显示黑唇鼠兔的LDH-C基因和灵长类及偶蹄目的遗传距离较近,和啮齿目较远。[结论]成功的克隆得到了黑唇鼠兔的LDH-C基因的cDNA序列。     

白背飞虱海藻糖酶Treh-2基因克隆及生物信息学分析

利用同源克隆及RACE方法,从白背飞虱Sogatella furcifera中克隆获得海藻糖酶基因(Treh-2)全长cDNA序列(GenBank登录号:JX204291),该基因全长为2 065 bp,包含73 bp 3,UTR和150 bp5,UTR,开放阅读框(ORF)为1 842 bp,编码613个氨基酸。该基因预测蛋白分子质量为70.45 ku,等电点为5.65,有5个预测糖基化位点,有1个信号肽结构。进化分析结果显示,白背飞虱海藻糖酶Treh-2与其他昆虫海藻糖酶Treh-2同源性较高,与灰飞虱相比,同源性为95%,与褐飞虱相比较,同源性为93%。海藻糖酶Treh-2基因克隆和比较分析为进一步深入研究白背飞虱迁飞能力与能量代谢具有重要意义。     

当归MYB4转录因子基因的克隆及表达分析

为探索当归(Angelica sinensis)药效成分阿魏酸生物合成中MYB蛋白的结构和功能,从当归中克隆转录因子基因MYB4,并进行序列分析和表达分析。根据MYB4转录因子的DNA保守结构域,结合同源克隆及RACE的原理,运用RT-PCR技术从当归中克隆MYB4基因cDNA的全长序列;利用生物信息学分析工具对该基因编码蛋白质的基本性质、结构特点及生物学功能进行初步预测;应用qRT-PCR分析该基因的表达特征;使用重组技术组装原核表达载体p GEX-4T-3-As MYB4,热击法转化至大肠杆菌BL21(DE3),IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导重组蛋白表达。结果表明,成功克隆1个MYB4基因,命名为As MYB4,在GenBank中注册,登录号为MG736315;序列分析表明,As MYB4的cDNA全长为1 189 bp,包括804 bp的开放阅读框,编码267个氨基酸,为典型的R2R3-MYB类转录因子家族成员; As MYB4与胡萝卜MYB308的同源性达到93%,且亲缘关系最近。组织特异性表达分析表明,As MYB4基因在当归叶片中的转录水平最高,分别是叶柄、根的1. 1、2. 0倍;异源表达分析表明,As MYB4蛋白以包涵体形式存在,分子质量为30 ku。     

SD-大白鼠催乳素受体基因的克隆与表达

应用RACE—PCR技术,克隆了全长2743bp的SD-大白鼠催乳素受体基因（gPRLR）cDNA。序列分析表明,cDNA含421bp 5′UTR、1357bp编码区和218bp3′U,UTR。比对奶牛催乳素受体基因并将前217bp看作第1外显子,则gem基因可划分为13个外显子。推导的蛋白序列含763个氨基酸,与奶牛、鸽及猪PRLR的同源性较高,其N末端含23个氨基酸的信号肽,成熟蛋白含789个氨基酸。gPRLRmRNA在成年鼠睾丸、输精管、卵巢、输卵管、肾、大肠、小肠、脾组织中均有表达。     

鹅Apo A1,CD36和DGAT2基因的cDNA克隆与序列分析

利用RACE技术,克隆获得了鹅Apolipoprotein A-1(Apo A1),Fatty acid translocase(CD36)和Diacylglycerol O-acyltransferase 2(DGAT2)基因的c DNA序列,包括全长的编码区序列(coding sequence,CDS)。结果表明,获得的鹅Apo A1基因的c DNA序列长度为1 106 bp(Gen Bank accession:KF460562),包括135 bp的5’UTR(untranslated region,UTR)序列,795 bp编码区和176 bp的3’UTR序列,编码265个氨基酸。获得的鹅CD36基因的c DNA序列长度为2 262 bp(Gen Bank accession:KF460563),包括196 bp的5’UTR序列,1 416bp编码区和650 bp的3’UTR序列,编码472个氨基酸。获得的鹅DGAT2基因的c DNA序列长度为1 341 bp(Gen Bank accession:KF460564),包括93 bp的5’UTR序列,1 077 bp编码区和171 bp的3’UTR序列,编码359个氨基酸。同源性分析结果表明,鹅这3个基因c DNA与鸭的同源性最高,达到90%以上,与人等哺乳动物的同源性均较低。     

橡胶死皮相关水通道蛋白编码基因的克隆与序列分析

死皮是指橡胶树(Hevea brasiliensis)产排胶过程中出现的一种割线症状,它是影响橡胶产量的关键因素。研究基于一条在死皮植株中下调表达的EST,采用电子克隆和RT-PCR相结合的方法从橡胶树的树皮中扩增出HbPIP2;2 903 bp的cDNA,该序列包含867 bp的ORF,13 bp的5’UTR和23 bp的3’UTR;基因预测编码288个氨基酸,理论分子量为30.71 kD,等电点为8.20。生物信息学分析显示,HbPIP2;2含有1个保守的MIP结构域,6个跨膜螺旋,细胞膜定位,可归为水通道蛋白(Aquaporin,AQP)家族PIP亚族。同源分析显示,HbPIP2;2与蓖麻(Ricinus communis)、杨树(Populus trichocarpa)、核桃(Juglans regia)和可可(Theobroma cacao)中同源蛋白的相似性都在90%以上,显示出进化的高度保守性。该研究为下一步揭示AQP调控死皮发生的机制创造了条件。     

梭梭HaACT基因片段的克隆和3’UTR序列分析

【目的】以克隆HaACT基因为出发点,为进一步分析其表达特点奠定基础。【方法】根据NCBI上已发表的藜科其他植物肌动蛋白(Actin)序列的保守区设计一对简并性引物,以梭梭(Haloxylon ammodendron)同化枝为材料提取总RNA,采用RT-PCR法和3’RACE技术克隆了HaACT基因部分片段及3’UTR序列。【结果】得到HaACT基因片段1 107 bp,该序列编码257个氨基酸,3’UTR序列长度为416 bp。使用NCBI和DNAMAN软件对3’UTR序列进行了同源性分析。HaACT基因3’UTR序列与CaACT基因3’UTR序列的相似性高达93%,与BvACT基因3’UTR序列相似性为92%,与GhACT基因3’UTR序列相似性最低,为86%。【结论】HaACT基因与其他植物Actin基因可能具有相似的调控机制。