家蚕5龄幼虫期乙酰化修饰丝胶蛋白对蚕丝性能的影响

乙酰化修饰即在翻译中或翻译后的蛋白质分子链上嫁接乙酰基团,是通过化学修饰改变蛋白质性质的方式之一,丝胶蛋白是高度乙酰化的蛋白质。以丝腺组织大量合成丝蛋白的家蚕5龄第2天幼虫供试,分别将去乙酰化酶抑制剂TSA和乙酰化酶抑制剂C646自幼虫第2腹节注射入体内丝腺,上调和下调丝胶蛋白的乙酰化水平,探究通过乙酰化修饰丝胶蛋白的方法改善蚕丝性能的可行性。收集试验组家蚕的茧丝进行力学性能测试、红外光谱分析、X射线衍射分析、扫描电子显微镜(SEM)观察,结果证实丝胶蛋白的乙酰化修饰并不会改变蚕丝丝素的晶体结构,但具有增强丝胶与丝素表层附着力的作用。研究结果可为蚕丝精练脱胶和染整工艺的改进提供新的理论依据。     

家蚕丝素蛋白抗氧化肽的制备及其稳定性研究

利用碱性蛋白酶水解家蚕丝素蛋白制备抗氧化肽,考察水解pH、水解时间、加酶量、底物浓度、水解温度5个因素对水解产物DPPH自由基清除率的影响,在此基础上采用响应面试验优化水解工艺条件,并调查家蚕丝素蛋白抗氧化肽对热、酸、碱和体外肠道消化的稳定性,测定不同分子质量范围的家蚕丝素蛋白水解产物组分的抗氧化活性.结果 表明,碱性蛋白酶水解制备家蚕丝素蛋白抗氧化肽的最优工艺条件为水解pH 8.69、水解时间60 min、加酶量3035 U/g、底物(丝素蛋白)质量浓度26.80 g/L、水解温度53.89℃,在此条件下制备获得的家蚕丝素蛋白抗氧化肽对DPPH自由基的清除率为55.16％.家蚕丝素蛋白抗氧化肽具有良好的热稳定性;在中性环境中抗氧化活性很稳定,但在强酸和强碱环境中抗氧化活性明显降低;经体外模拟胃肠道消化后,对DPPH自由基的清除率比未消化处理对照组提高了9.43百分点.分子质量小于5 kD组分是家蚕丝素蛋白抗氧化肽的主要活性组分.研究结果为家蚕丝素蛋白功能产品的开发提供了试验依据.     

家蚕丝素重链C末端序列分析、克隆及表达纯化

蚕丝主要由丝素和丝胶蛋白组成,其中丝素包括丝素重链,丝素轻链和P25蛋白。丝素重链蛋白分子量大,体外表达困难,难以分离纯化,很难对其结构进行研究。本文通过对丝素重链基因的分析,以家蚕5龄3d后部丝腺cDNA为模板,克隆获得了丝素重链C末端碱基序列,并将其构建到pET-50b(+)表达载体上,转入到大肠杆菌中进行表达,通过镍柱亲和层析纯化获得了丝素重链C末端的融合蛋白,为进一步研究蚕丝蛋白的折叠和组装奠定了研究基础。     

家蚕丝素基因的研究进展

家蚕丝素蛋白基因不仅高度专一地在后部丝腺中表达，而且在家蚕胚胎发育及幼虫发育过程中，丝素蛋白基因的表达在时间和空间上受到精细的调控，因此研究丝素蛋白基因的调控方式，能使我们了解生物体如何利用遗传信息，对基因进行时间和空间上的表达调控。调控丝素蛋白基因表达专一性的启动子／增强子结构相对较为简单，也更利于研究。本文就近年来在家蚕丝索蛋白基因研究中取得的成果进行综述。     

家蚕丝素P25蛋白的多克隆抗体制备与应用

P25蛋白是家蚕(Bombyx mori)丝素蛋白的主要成分之一。根据BmP 25基因ORF序列设计引物,以家蚕5龄第3天丝腺cD NA为模板,RT-PCR扩增获得BmP 25的ORF全长片段。将构建的含BmP 25的原核表达重组质粒转化大肠埃希菌Rosetta(DE3)菌株感受态细胞,对家蚕丝素P25蛋白进行重组表达和纯化,并免疫家兔制备获得多克隆抗体,用于研究家蚕丝腺中P25蛋白的合成和分泌规律。利用制备的多克隆抗体对家蚕品种大造5龄第3天幼虫9个组织的总蛋白质样品进行Western blot检测,结果在中部丝腺和后部丝腺检测到P25蛋白,表明该抗体有较好的特异性。进一步利用此多克隆抗体分别对家蚕5龄第5天幼虫中部丝腺和后部丝腺不同区域进行荧光免疫组化分析,结果在后部丝腺的细胞和腔内观察到明显的荧光信号,而中部丝腺后部的细胞仅有微弱信号,腔内的荧光信号强度随着丝素蛋白的从后向前运输越来越弱,以致在中部丝腺的前部和中部未检测到荧光信号。推测可能是P25蛋白在丝素蛋白从溶胶状态到凝胶状态的转化过程中,被逐步包裹在丝素蛋白聚合物中导致其不能被检测到。利用该多克隆抗体对家蚕不同品种的茧丝蛋白进行Western blot检测,均能获得特异性的杂交条带,表明该抗体还可用于家蚕茧丝及丝制品的分子检测鉴定,为开发丝制品的检测试剂盒提供了条件。     

用保幼激素和蜕皮激素处理离体培养家蚕丝腺对丝蛋白基因表达的影响

蜕皮激素(20E)和保幼激素(JH)具有共同调控家蚕丝蛋白合成的作用。将家蚕5龄第3天幼虫的中部和后部丝腺置于含不同浓度20E或JH的培养基中进行离体培养,于培养不同时间通过定量PCR检测丝素蛋白基因及丝胶蛋白基因的表达变化。结果表明,蜕皮激素处理对丝蛋白基因表达的影响,因激素使用剂量和作用时间不同而异;保幼激素处理会抑制丝蛋白基因的表达,尤其对丝素蛋白重链基因Bmfib-H的表达抑制作用更为明显,50 ng/m L JH处理48 h后Bmfib-H的表达水平下调1倍左右;蜕皮激素和保幼激素共同处理比单一激素处理更有助于丝蛋白基因的表达,但用保幼激素先处理丝腺24 h后再用蜕皮激素和保幼激素共同处理,会显著抑制丝素蛋白轻链基因Bmfib-L的表达。试验在排除蚕体内源激素干扰的条件下,从转录水平初步分析了保幼激素和蜕皮激素对家蚕丝蛋白基因表达的调控机制。     

柞蚕丝素/丁二醇多孔材料的制备及性能测试

为了降低柞蚕丝素多孔支架材料的水溶性,采用硫氰酸锂(LiSCN)溶液溶解柞蚕丝素纤维得到再生柞蚕丝素蛋白溶液,加入一定量的1,4-丁二醇溶液后,利用冷冻干燥方法制备出平均孔径380～1 050μm、孔隙率82%～92%的柞蚕丝素/丁二醇多孔支架材料。用扫描电子显微镜观察柞蚕丝素/丁二醇多孔材料的内部孔呈长梭形,在大孔孔壁上分布着一些小孔,孔与孔之间相互贯通,且孔壁表面粗糙,有凸起的纳米颗粒与纳米纤维附着在孔壁上。采用X-射线衍射法、红外光谱法对柞蚕丝素/丁二醇多孔材料的结构进行表征,并测定丝素蛋白溶失率,结果表明:纯柞蚕丝素蛋白形成的多孔材料主要以α-螺旋结构为主,其蛋白溶失率达到30%左右;加入1,4-丁二醇后,柞蚕丝素蛋白的聚集态结构逐渐向β-折叠结构转变,材料的溶失率也随之减小。对柞蚕丝素/丁二醇多孔材料的压缩性能测试显示其具有一定的力学性能,当多孔材料压缩30%时,丝素蛋白质量浓度为20 mg/mL的多孔材料的压缩应力可以达到16.5 kPa,且随着丝素蛋白质量浓度的提高,材料的压缩强度逐渐增大。试验结果显示,采用冷冻干燥方法制备的柞蚕丝素/丁二醇多孔支架材料,具有溶失率低、孔径可控、孔隙率高及力学性能好的特点。     

家蚕丝素蛋白对大鼠胆固醇代谢的影响

研究了经酸解后制得的家蚕丝素蛋白氨基酸组成以及对高血脂实验鼠血清和肝脏内胆固醇及转氨酶的活性变化的影响。结果表明 :所得的家蚕丝素蛋白粉氨基酸组成丰富 ,其中甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸和酪氨酸含量占全部氨基酸总量的 95 %;家蚕丝素蛋白能显著地降低血清胆固醇含量和谷草转氨酶及谷丙转氨酶活性 ,提高动物肝组织中的胆固醇浓度和谷丙转氨酶的活性。     

多酚氧化酶对蚕丝及丝蛋白生物材料的改性与应用研究进展

多酚氧化酶能催化氧化酚类结构生成醌类活性中间体,引发酚类单体之间聚合。家蚕丝素蛋白和丝胶蛋白大分子肽链上均含一定数量的酪氨酸残基,酪氨酸的酚羟基能被多酚氧化酶催化氧化,生成醌类活性基,不仅可促成丝蛋白大分子交联,而且可与外源氨基功能化合物发生迈克尔加成或席夫碱反应,实现底物分子改造。本文讨论了多酚氧化酶的催化氧化机制,侧重阐述了近年来国内外应用多酚氧化酶(漆酶和酪氨酸酶)进行丝蛋白生物材料加工的研究,包括丝纤维制品酶法抗菌和防皱整理、丝素或丝胶酶促交联与接枝改性、再生丝蛋白膜及功能性生物材料制备等,为蚕丝及丝蛋白基材料的生物改性研究及开发利用提供参考。     

家蚕丝素重链启动子克隆片段在家蚕体内和昆虫培养细胞内的渗漏表达

为了探讨家蚕丝素重链基因的调控机制,应用重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)为基因转移载体,以绿色荧光蛋白基因为报告基因,研究了丝素重链基因启动子克隆片段在家蚕丝腺的不同部位,以及脂肪体细胞和Sf9培养细胞中的表达渗漏。结果发现,丝素重链启动子克隆片段在家蚕中部丝腺存在表达渗漏,并且在中部丝腺前部的表达活性要强于中部丝腺的中部和后部;克隆片段在脂肪体组织存在表达渗漏,通过荧光解剖显微镜可以在体表观察到绿色荧光;克隆片段在Sf9培养细胞中也存在表达渗漏。上述结果说明目前已知的有关家蚕丝素重链基因的调控元件仍不充分,家蚕基因组中可能还有其他调控丝素重链基因表达组织和时相的特异性元件存在。     

丝胶茧蚕品种选育初报

利用家蚕资源库中的突变基因,初步育成了丝胶茧蚕品种。导入了与活性物质黄酮类产生有关的基因,使丝胶中含有特殊的功能性活性物质。为丝胶的保健食用和高档化妆品利用提供原料。     

丝素、丝胶质量标准指标的研究

为进一步制订丝素和丝胶的质量标准,并用以指导蚕丝蛋白规范生产,检测分析了丝素与丝胶中的氨基酸含量、干燥失重和灰分等质量指标,砷、铅等重金属含量的安全性指标,以及菌落总数、大肠菌群和致病菌等微生物指标。参照食品、化妆品等国家标准限量规定,结合蚕丝蛋白的特性和生产制备现状,初步提出了评价丝素与丝胶质量优劣的指标及相应的数值范围。     

用柞蚕丝素/柠檬酸对柞蚕丝绸的抗皱增重整理研究

为了改善柞蚕丝绸的服饰功能,自制柞蚕丝素与柠檬酸混合液对柞蚕丝绸进行抗皱增重整理。测试了柞蚕丝绸整理前及以不同整理剂整理后的折皱回复角、增重率、撕破强力、白度、悬垂系数、染色深度等性能指标,并通过正交试验确定柞蚕丝绸抗皱整理的最佳工艺条件为柞蚕丝素质量浓度30 g/L、柠檬酸质量浓度50 g/L、次亚磷酸钠质量浓度30 g/L、焙烘温度160℃、焙烘时间2.5 min,确定增重整理的最佳工艺条件为柞蚕丝素质量浓度30 g/L、柠檬酸质量浓度80 g/L、次亚磷酸钠质量浓度30 g/L、焙烘温度150℃、焙烘时间2.5 min。在最佳抗皱整理条件下,柞蚕丝绸的折皱回复角提高了36.7%,增重率为5.86%,撕破强力和白度的保留率分别为86.1%和90.8%,表观色深值增加1倍多。试验结果表明,柞蚕丝绸经柞蚕丝素/柠檬酸混合液整理后的抗皱性能、悬垂性能及柔软度和染色性能均有改善。     

木瓜蛋白酶对丝素蛋白的降解作用研究

丝素蛋白具有良好的生物相容性及降解性,被广泛地用于生物材料。本研究以废蚕茧为原料,通过脱胶、溶解、透析、浓缩等步骤制备了丝素蛋白溶液,再用木瓜蛋白酶降解丝素蛋白,利用SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE）进行丝素蛋白多肽的鉴定,探讨pH、温度及酶活等因素对木瓜蛋白酶降解丝素蛋白影响。结果表明：在pH8～9、温度60～70℃,木瓜蛋白酶的活性为20～25 U时丝素蛋白水解效果较好,酶的作用时间越长效果越好。本研究为开发丝素蛋白在食品、化妆品中的提供了基础。     

柞蚕丝素粉与鸟氨酸的混合物对酒精性脂肪肝的预防效果试验

以小鼠为试验动物,研究柞蚕丝素粉与鸟氨酸的混合物对酒精性脂肪肝肝体比和脂类代谢的影响。结果表明,该混合物能明显降低小鼠的肝体比和血清甘油三酯、总胆固醇、低密度脂蛋白的浓度,能提高高密度脂蛋白浓度。因此认为柞蚕丝素粉与鸟氨酸的混合物可有效预防酒精性脂肪肝的发生。     

柞蚕对ApNPV感染的抵抗性与部分生命力性状的相关性

柞蚕核型多角体病毒(ApNPV)是危害柞蚕的主要病原。以柞蚕部分现行品种、杂交种及引进品种为材料,研究柞蚕对ApNPV感染的抵抗性与部分生命力性状的相关性。结果显示,稚蚕对ApNPV感染的抵抗性与普通孵化率呈显著正相关,相关系数为0.71,而与5龄壮蚕对ApNPV感染的抵抗性及自然发病率无显著相关关系;5龄壮蚕对ApNPV感染的抵抗性与5龄壮蚕感染ApNPV后的虫蛹统一生命率呈显著正相关,相关系数为0.98。研究结果表明,柞蚕品种的抗ApNPV病毒性能应依据稚蚕期和5龄壮蚕期2个发育阶段对病毒感染的抵抗性进行综合鉴定。     

家蚕种克卵粒数容许差距的测算方法

控制样本间克卵粒数的差距是保证家蚕种良卵率检测准确性的关键。通过调查和理论分析,认为家蚕卵粒质量的分布服从正态分布。在置信概率为95%下,3次重复间样本卵粒数的容许差距估计公式为d=0.191 3×n3/2×10-3。当克卵粒数在1 600~1 699、1 700~1 799、1 800~1 899、1 900~2 000区间时,容许差距分别为13、14、15、16粒。     

柞蚕雄蛾浓缩液生产的部分工艺条件改进与产品质量检测

以初羽化、未交尾的柞蚕雄蛾为原料,采用低温负压浓缩技术生产柞蚕雄蛾浓缩液,通过改进粗制柞蚕雄蛾浓缩液离心去杂质、去脂肪工艺流程中的离心时间、离心速度、离心温度等条件因素,改善柞蚕雄蛾浓缩液产品的感官性状。试验结果表明,粗制柞蚕雄蛾浓缩液在-5℃低温下,以4 500～5 000 r/min离心15 min,可在保证营养与活性成分含量的基础上,去除杂质和部分脂肪。采用改进后的工艺生产的柞蚕雄蛾浓缩液清澈透明,不浑浊,感观品质好,脂肪质量分数由原来的0.30%降低到0.09%,可延长产品的保质期。该项生产工艺已获得国家发明专利(专利号:2009 1 0016120.X),生产的柞蚕雄蛾浓缩液可直接加工成产品服用或用于勾兑蚕蛾酒及饮料等。     

家蚕地理系统间茧丝蛋白酶抑制剂含量的比较分析

以中国系统、日本系统、欧洲系统、多化性系统品种各 11个及丝胶茧 (Nd s)、裸蛹 (Nd)等为材料 ,对茧丝蛋白酶抑制剂的含量、热稳定性及与其它主要经济性状的相关性进行了研究。结果表明 :不同家蚕品种间茧丝蛋白酶抑制剂的含量差异极显著 ,且中国系统 >日本系统 >欧洲系统 >多化性系统 ,中、日、欧 3个系统的茧丝蛋白酶抑制剂含量与多化性系统间有极显著的差异 ;中系品种C12 和日系品种J12 茧丝蛋白酶抑制剂的热稳定性很强 ,欧系品种罗尼 9号和多化性品种四海茧丝蛋白酶抑制剂的热稳定性相对较弱 ;丝胶茧 (Nd s)中有少量蛋白酶抑制剂存在 ,裸蛹 (Nd)所吐的少量丝胶中无蛋白酶抑制剂存在 ;家蚕茧丝蛋白酶抑制剂的含量与茧层量、茧层率呈极显著的正相关 ,与全茧量、死笼率、幼生率、虫蛹率无显著的相关性。     

低溶胀壳聚糖/丝素蛋白复合膜的制备及性能测试

为改善单纯壳聚糖膜用作医用创面敷料在湿环境下的力学性能,将壳聚糖(CS)和家蚕丝素蛋白(SF)混合,采用延流法制备壳聚糖/丝素蛋白(CS/SF)复合膜。物理与机械性能测试表明:CS/SF复合膜的溶胀率较单纯CS膜显著降低,且其溶胀能力具有pH依赖性;CS/SF复合膜的水蒸气透过率较单纯CS膜略有下降,但仍保持在2 043～3 363 g/(m2.d);CS/SF复合膜在湿环境下的力学强度较单纯CS膜显著提高,当加入SF的质量分数为15%时,复合膜的力学性能最好,其拉伸强度为34.5 MPa±1.8 MPa,比单纯CS膜提高近18%,而其断裂伸长率也由初始的83.1%±6.7%提高到119.3%±8.2%。CS/SF复合膜具有较好的药物释放性能,对抗感染药物盐酸万古霉素表现出在初始1 h内的突释行为和随后较长时期的缓释行为,十分有利于降低感染和加速伤口愈合。此外,CS/SF复合膜对STO小鼠胚成纤维细胞具有良好的生物相容性。各项性能测试显示CS/SF复合膜作为医用敷料具有潜在的应用前景。