羊口疮的研究

本文报道了对羊口疮的病原学、流行病学、实验病理学、血清学诊断以及免疫预防等问题所进行的系列研究结果。应用电镜技术,首次在国内观察到了羊口疮的病原——羊口疮病毒。对该病毒的某些生物学特性和理化学特性进行研究的结果表明,该病毒的感染范围比较广泛,对干燥耐受性强,对热、紫外光和福马林敏感;在奶山羊睾丸细胞上生长良好,CPE变化显著,并有多倍性现象;通过系统取样和超薄切片,在电镜下观察到了病毒在培养细胞中的主要复制过程,以及培养细胞本身的亚微结构变化。试用差速离心联用30—45％蔗精密度梯度超速离心,能有效地提纯病毒,为纯化痘类病毒提供了一种较为理想的方法。中性无离子去污剂TritonX—100与2—巯基乙醇联合,可使病毒裂解,便于分离囊膜蛋白亚单位;用SDS—PAGE分析法,发现病毒最少可泳动出28条多肽区带,而病毒的囊膜亚单位则由18条多肽区带组成。将病毒亚单位作为抗原免疫羔羊,可激发羊只产生抗全病毒抗体和迟发性变态反应,这在国内属首次报道。流行病学的调查表明,羊口疮在甘肃省存在历史已久,分布广泛,对养羊业危害严重;病的自然感染主要见于绵羊和山羊,以羔羊最为易感,除口唇感染外,未见其他临诊病型;采取不同地区的病羊痂皮在羊体作交叉免疫试验,未发现病毒有型别差异。人工感染病羊的血常规检查和血清蛋白的电泳分析未见异常;病理组织学变化以表皮的网状变性、真皮的炎性浸润和结缔组织增生为最特征。首次在国内将反向间接血凝、对流免疫电泳、酶联免疫吸附,琼脂凝胶扩散以及血清中和等五种血清学方法用于羊口疮的诊断,填补了国内在这方面的空白,其中前三种方法在当时的国外文献中也未见有报道。以改良、完善现行方法为目的,对活毒苗免疫接种法作了系统的研究,证明是一种行之有效的应急性免疫措施,有在疫区推广应用的价值;对灭活苗所进行的探索性试验表明,灭活的病毒似能激发羊体产生一定程度的免疫,为今后进一步提高灭活苗的免疫效果以及研究其在实践中应用的可能性打下了有益的基础。     

羊口疮病毒ORFV/GD-QY/01 株的分离鉴定

利用MDBK细胞对广东清远某羊场的痂皮病例进行病毒分离,获得一株ORFV,命名为ORFV/GD-QY/01。参考NCBI羊口疮病毒(Orf virus)保守基因B2L序列,设计一对特异性引物进行PCR扩增后测序;运用序列分析软件对获得的羊口疮病毒株B2L基因核苷酸序列与其他羊口疮毒株进行多序列比对,构建系统发育进化树。结果表明:接种病料悬液的MDBK细胞出现细胞病变,扩增出ORFV B2L基因,该毒株与台湾山羊株(EU935106、DQ904351)相似性最高(均为99.2%),亲缘关系最近。     

羊传染性脓疱病的防治

羊传染性脓疱病（Contagious ecthyma,CE）,又称羊口疮（Orf）、羊传染性脓疱坏死性皮炎、羊传染性脓疱口膜炎或羊口膜炎,是由痘病毒科（Poxviridae）、副痘病毒属（Parapoxvirus）、羊传染性脓疱病病毒（又名口疮病毒）引起的羊的一种传染性丘疹性和痂皮性疾病,主要危害绵羊的山羊,尤其是羔羊。     

鸡传染性法氏囊病病毒的分离培养和鉴定

从南京、宜兴鸡传染性法氏囊病(IBD)鸡群中,采集病变典型的法氏囊组织。采用特殊培养条件分离培养IBDV:延长病毒吸附时间(120分钟);提高犊牛血清(CBS)灭活温度(65℃);降低CBS用量(1％)和在维持液中添加100mM氯化钠。经在鸡胚成纤维单层细胞(CEF)盲传3代,本病毒可使CEF产生明显的致细胞病变效应(CPE)。连续传至第9代,CPE出现规律性变化:细胞浆成长丝状或条索状,变圆脱落的细胞呈颗粒状粘附在条索上。接毒后48小时,CPE达90～100％。经病毒血清中和试验、病毒核酸聚丙烯酞胺凝胶电脉等试验证实,JS-2株病毒属于IBDV。     

羊口疮的特效综合疗法

羊口疮又称羊传染性脓疱口腔炎,是由羊口疮病毒引起的绵羊和山羊的一种传染病,该病以患羊口、唇等部皮肤,黏膜形成丘疹、脓疱、溃疡以及疣状厚痂为特征。一、流行特点本病主要侵害3—6月龄羔羊,常呈群发性流行,成年羊发病较少,呈散发性流行,人和猫也可     

羊口疮病毒DZ株在不同细胞上的增殖特性研究

为研究羊口疮病毒(ORFV) DZ株在不同细胞上的增殖特性,将ORFV-DZ株分别接种犊牛睾丸细胞(BT)和鸡胚成纤维细胞(CEF)2种原代细胞,以及山羊皮肤成纤维细胞系(GSFs)、小鼠胚胎成纤维细胞系(NIH3T3)、宫颈癌细胞系(Hela)、牛肾细胞系(MDBK)、犬肾细胞系(MDCK)、非洲绿猴肾细胞系(Vero)、乳仓鼠肾细胞系(BHK-21)7种传代细胞,通过细胞病变(CPE)、间接免疫荧光试验(IFA)、TCID50测定和实时荧光定量PCR检测ORFV-DZ株在不同细胞上的增殖特性.结果 表明:ORFV-DZ株能在BT、Hela以及MDBK 3种细胞中有效增殖,且出现细胞变圆、聚集、脱落等CPE;IFA检测ORFV-DZ株接种这3种细胞均能出现特异性绿色荧光;收集BT、Hela和MDBK细胞培养的F5代细胞毒,测得其TCID50值分别为10-5.81·0.1 mL-1、10-4.22· 0.1 mL-1、10-4.88·0.1 mL-1;qPCR检测结果中,ORFV-DZ株在BT细胞中随传代次数增加病毒拷贝数未发生明显变化,在MDBK细胞中F5代时病毒拷贝数已下降,而在Hela细胞中,随着传代次数的增多,病毒拷贝数逐步下降.这一研究得到了适合ORFV-DZ株有效增殖的细胞为BT和MDBK,为后续ORFV的基础研究以及疫苗研发等提供了细胞学研究基础.     

羊传染性脓疱的临床诊断及防制方法

羊传染性脓疱俗称“羊口疮”,是由羊口疮病毒引起的绵羊和山羊的一种传染性疾病。本病以患羊口唇等部位皮肤、粘膜形成丘疹、脓疱、溃疡以及疣状厚痂为特征。     

Marc-145细胞低血清适应培养传代稳定性和无血清驯化研究

通过驯化建立无血清悬浮培养型Marc-145细胞系,分析驯化传代对细胞特性的影响,为大规模生产疫苗用的宿主细胞提供基础。采用缓降培养液中血清浓度的方法,连续传代培养50代,并用无血清培养基进行悬浮培养驯化,对传代和驯化过程中的P10、P20、P30、P40和P50代细胞的形态、倍增时间、生长曲线、染色体和对蓝耳病病毒敏感性等特性进行对比分析。研究发现,传代过程中Marc-145细胞均呈扁平多边形上皮样生长,P10代细胞倍增时间为34.15 h,P50代细胞倍增时间为36.16 h,P50代细胞倍增时间稍有延长但差异不显著。P10、P20、P30、P40和P50代的Marc-145细胞生长曲线均呈“S”形;P10代和P50代细胞染色体众数都集中在88~90条。接种病毒后,P10、P20、P30、P40和P50细胞TCID₅₀间无显著差异,表明细胞传50代后,细胞特性没有发生明显变化。P50细胞进行无血清悬浮培养48 h后,细胞密度可达到4.14×10⁶ mL^-1。     

ORFV-Yulin株的分离鉴定及其B2L基因在昆虫杆状病毒系统中的表达

【目的】从榆林市具有典型羊口疮症状的陕北白绒山羊唇结痂病料中分离羊口疮病毒(Orf virus,ORFV),克隆分析其B2L基因序列,并通过昆虫杆状病毒表达B2L基因。【方法】利用牛肾传代细胞进行ORFV的分离培养,通过PCR的方法从分离到的病毒中扩增出B2L全长基因,测序后进行序列及遗传进化分析。利用扩增所得的B2L基因构建昆虫杆状病毒表达载体,包装出杆状病毒后侵染sf9细胞,并通过SDS-PAGE、Western-blot以及质谱鉴定等方法验证目的基因的表达情况。【结果】成功分离出1株羊口疮病毒,命名为ORFV-Yulin株;扩增的B2L全长基因长度为1 137bp,与Hub13和GY-AHF10株亲缘关系最近,核苷酸序列和氨基酸序列的相似性分别为99%和99.2%。通过昆虫杆状病毒表达系统成功表达了B2L基因,获得了47ku的重组蛋白。【结论】从榆林市陕北白绒山羊中获得了羊口疮病毒分离株(ORFV-Yulin);通过昆虫杆状病毒表达系统成功表达了ORFV-Yulin株的B2L基因。     

羊传染性脓疱的防治

羊传染性脓疱俗称＂羊口疮＂,是由羊口疮病毒引起的绵羊和山羊的一种传染性疾病。本病以患羊口唇等部位皮肤、黏膜形成丘疹、脓疱、溃疡以及疣状厚痂为特征。1病原羊口疮病毒分类上属于痘病毒科,副痘病毒属。病毒粒子呈砖形或呈椭圆形的线团样（病毒粒子表面呈特征性的管状条索斜形交叉,呈编织样外观）,一般排列较为规则。核酸类型为双股脱氧核糖核酸（DNA）。羊口     

鸡新城疫病毒感染不同细胞的病变特性研究

为了探讨鸡新城疫病毒(Newscastle disease virus,NDV)感染不同细胞的病变特性,选用NDV强、弱毒株感染鸡胚成纤维细胞(DF-1)、仓鼠肾细胞(BHK-21)和人宫颈癌细胞(HeLa).结果表明:NDV强毒株在DF-1、BHK-21、HeLa上均能增殖,在DF-1、BHK-21、HeLa上产生的细胞病变(cytopathic effect,CPE)以发生细胞融合和形成合胞体为主要特征,在DF-1上增殖速度较快,HA效价也高;NDV弱毒株含10μg/mL胰蛋白酶的DMEM培养基上,DF-1、BHK-21、HeLa可引起细胞变圆、脱落,没有典型的CPE,盲传15代CPE特征未发生改变,血球凝集(HA)效价较低.可见,NDV在其种属来源相同的DF-1中更适宜增殖,DF-1可用作NDV感染的最佳细胞模型.     

山东地区牛传染性鼻气管炎病毒的分离鉴定

从山东某地区发生呼吸道症状的奶牛场中采集样品,按常规方法处理后,接种牛肾细胞(MD-BK),分离病毒,盲传3代后,接种病料的MDBK细胞出现细胞圆缩、聚集成葡萄串样群落、在单层细胞上形成空洞等病变,且随着传代次数的增加,细胞病变更加规律。对所分离病毒进行TCID50测定,其TCID50值为108/ml;用IBRV特异性引物对分离病毒进行PCR扩增,获得与设计基因片段大小一致的特异性条带,序列测定分析结果确认所分离病毒为牛传染性鼻气管炎病毒。     

鸭坦布苏病毒鸡胚弱化毒株的选育

【目的】将鸭坦布苏病毒BZ_2010株在SPF鸡胚上进行连续传代致弱,旨在选育安全性高、免疫原性好的活疫苗候选毒株。【方法】以SPF鸡胚为增殖宿主,将BZ_2010株连续传代,直至第120代,以1日龄雏鸭和30周龄的产蛋种鸭为试验对象,对第120代次毒株（命名为VC2）的安全性进行评价;以1d雏鸭为试验对象,对VC2株的返强情况进行评价;以18周龄的种鸭为试验对象,对VC2株免疫后的中和抗体进行监测;以25周龄的种鸭为试验对象,对VC2株免疫后的保护效果进行评价;利用RT-PCR方法分别扩增BZ_2010株和VC2株的E基因和NS4A基因,进行测序分析。【结果】传代病毒对鸡胚的平均死亡时间逐渐缩短,而病毒毒价有逐渐提高的趋势,ELD50由第20代的10^-5.3/0.1mL提高到第120代的10^-5.8/0.1mL,而且第80代之前提高较快,后期基本稳定。将VC2株通过颈部皮下接种1d雏鸭和肌肉接种30周龄产蛋种鸭,接种后试验鸭无异常临床表现,肝脏也无明显病理变化,这说明VC2株具有良好的安全性。将VC2在1d雏鸭进行连续5次传代,未发现试验鸭有任何异常症状,将第5代组织悬液接种1d雏鸭,采集肝脏进行病理切片观察,发现无明显病理变化,这说明VC2株具有良好的稳定性。基因测序分析结果显示,VC2株 E蛋白的第86、157、189、301和312位氨基酸发生改变,而NS4A蛋白只有一个氨基酸发生突变,即第54位氨基酸由F变为L。VC2免疫种鸭后抗体水平上升很快,第4周即可达到高峰,并且维持较长时间;VC2免疫后于第2周和第50周利用强毒株进行攻毒试验,结果VC2免疫组在攻毒后未出现异常症状,粪便正常,产蛋率保持正常,这说明VC2株免疫可对强毒株的攻击产生完全保护。【结论】本研究通过鸡胚连续传代成功获得了一株安全性高、免疫原性好的鸭坦布苏病毒鸡胚弱化毒株。VC2免疫种鸭后抗体水平上升很快,可维持较长时间。攻毒试验结果表明,VC2株免疫可对强毒株的攻击产生完全保护。     

Influenza virus effects on cell membrane proteins

During infection by influenza virus, viral proteins become firmly attached to (or part of) host cell plasma membrane, nuclear membranes, mitochondrial, and microsomal membranes. Purified virus particles contain less than I percent host cell protein. Virus envelope proteins completely replace host membrane proteins in those discrete spots on the plasma membrane from which progeny virions bud out.     

Cytopathic effect of canine distemper virus in tissue culture

A characteristic cytopathic effect was obtained with canine distemper virus (Onderstepoort strain) propagated in chick embryo fibroblast monolayer tissue culture. In limiting dilutions the lesions were focal. The titer at the 20th tissue culture passage was approximately 10(5) TCD(50)/ml. Cytopathogenicity was specifically inhibited by distemper immune serum. Minute plaques were produced under agar overlay.     

新型鸭呼肠孤病毒在DF-1细胞系中的增殖特性

为了研究新型鸭呼肠孤病毒(new-type duck reovirus,NDRV)在鸡胚成纤维细胞DF-1中的增殖特性,将NDRV JDM10毒株接种到DF-1细胞,连续传代后,通过观察病毒对细胞的致病变效应,测定半数组织感染量(TCID₅₀)、RT-PCR检测、间接免疫荧光(IFA)及Western-blot免疫学检测,探索NDRV对DF-1细胞的作用效果。结果表明,NDRV JDM10毒株在DF-1细胞中能有效增殖,产生明显的致病变效应;RT-PCR检测成功扩增出1条大小为1 001 bp的条带;病毒蛋白在细胞中获得了良好的表达,并与抗NDRV σC单克隆抗体发生特异性反应;NDRV JDM10毒株在感染DF-1细胞后会经历潜伏期、快速增长期、稳定期3个时期,并在72 h病毒效价达到峰值,TCID₅₀为1×10^-7.90·(0.1mL)^-1。本研究为进一步研究NDRV的致病机理和研制细胞疫苗奠定了基础。     

猪伪狂犬病病毒的分离鉴定

从山西某猪场发病猪的脑组织中分离到1株疑为猪伪狂犬病病毒(PRV)毒株,通过BHK-21细胞培养、病毒毒力滴定、中和试验、PCR检测病毒方法对该分离株进行了鉴定,结果发现:分离的病毒在BHK-21细胞培养盲传4代后出现典型细胞病变;用BHK-21细胞测定其毒价TCID50为10-8.042/0.1 mL;PCR体外扩增可见其扩增片段与预期目的条带相一致;据此分离病毒株的上述特征,鉴定该病毒为猪伪狂犬病病毒,并命名为SX09。     

TK基因重组缺陷山羊痘病毒构建及其生物学特性鉴定

[目的]利用同源重组技术构建TK基因缺陷的山羊痘病毒（GTPV）毒株,为研制出更安全、高效的GTPV弱毒疫苗和病毒载体提供备选毒株.[方法]采用PCR克隆GTPV AV41株TK基因（ORF56）及其侧翼基因组片段,在TK基因内部插入报告基因EGFP抗性基因gpt达盒,构建GTPV重组转移载体pTK-Eg.将重组转移载体pTK-Eg与GTPV AV41株共转染Vero细胞,通过空斑纯化筛选阳性重组病毒,鉴定其生长特性和遗传稳定性,并接种山羊评价其安全性和免疫原性.[结果]成功构建获得一株TK基因缺陷的重组病毒vTK-Eg.与亲本毒株GTPV AV41相比,vTK-Eg的生长特性及其形成的细胞病变均未发生显著改变,只是毒价略微下降100.5个数量级;在原代牛睾丸（BT）细胞上连续传代,至少在10代内保持遗传性状和病毒滴度稳定.接种vTK-Eg的山羊精神和食欲均正常,接种后体温升高和局部反应的严重程度均较接种亲本毒株GTPV AV41的山羊有所降低;vTK-Eg与GTPV AV41株诱导山羊产生的GTPV中和抗体水平无明显差异（P＞0.05）.[结论]构建的TK基因重组缺陷病毒vTK-Eg具有良好的遗传稳定性和免疫原性,较亲本毒株其安全性也有所提高,可作为研制GTPV基因工程弱毒疫苗和活载体疫苗的备选毒株.     

细胞内转录拯救Asia1型口蹄疫病毒

 【目的】建立口蹄疫病毒（FMDV）感染性分子克隆的体内拯救技术平台,为深入研究该病毒基因组的结构与功能奠定基础。【方法】将置于T7启动子下的FMDV Asia1/JS/China/2005株全长cDNA的真核重组质粒pFMDV-A经Not I线化后和表达T7 RNA聚合酶的真核质粒pcDNAT7P共转染BHK-21细胞,进行病毒体内拯救的研究。【结果】转染细胞盲传第3代48 h后出现致细胞病变（CPE）,第4代10 h出现典型的CPE。RT-PCR、间接免疫荧光、电镜等均检测到了拯救的FMDV,而且存在分子标签,表明构建的FMDV全长cDNA分子克隆在BHK-21细胞内成功包装出FMDV。拯救毒与亲本毒对乳鼠的致病力（LD50）差异不显著,具有相似的生物学特征。共转染试验重复多次,均拯救到FMDV病毒。【结论】成功建立了基于质粒为基础的FMDV的体内拯救方法。