猪瘟病毒和猪圆环病毒2型二重荧光LAMP检测方法的建立

建立二重荧光LAMP方法,检测猪瘟病毒(CSFV)和猪圆环病毒2型(PCV2)。根据CSFV E2基因和PCV2 ORF2基因序列保守区域,分别设计并合成了2组针对CSFV和PCV2序列的特异性引物和2条标记不同的荧光基团探针,在CSFV探针序列5′端标记FAM荧光基团,3′端标记BHQ1淬灭基团,PCV2探针序列5′端标记CY5.5荧光基团,3′端标记BHQ2淬灭基团。以设计合成的引物、探针以及LAMP反应试剂建立二重荧光LAMP检测方法区分CSFV和PCV2,对该方法中的反应体系进行优化,并进行特异性、敏感性和干扰性测试以及临床样品验证测试。结果表明,建立的方法可鉴别CSFV和PCV2,特异性试验显示,该方法只检测出CSFV或PCV2,且与参试的对照病毒无交叉反应,特异性好。该方法最低检测CSFV或PCV2为100拷贝/μL,敏感性好。临床样品的检测结果与荧光定量PCR检测结果一致。建立的CSFV和PCV2二重荧光LAMP检测方法具有良好的特异性和敏感性,可适用于CSFV和PCV2的鉴别检测。     

副溶血弧菌主要毒力因子三重荧光定量PCR检测方法的建立与应用

为建立快捷、准确、高效检测副溶血弧菌的方法,以副溶血弧菌种属特异性基因toxR和毒力因子tdh、trh基因序列,分别设计3对特异性引物及相应TaqMan探针,并在toxR、tdh和trh基因的3个探针的5'端分别标记FAM、HEX、CY5荧光报告基团,3'端标记BHQ1淬灭荧光基团,通过优化反应体系和反应参数,确定最佳反应体系,建立一种基于Taq Man探针定量检测副溶血弧菌的三重荧光定量PCR方法。结果:本试验所建立三重荧光定量PCR方法与其他菌株无交叉反应,其最低检出限达到了10 CFU/m L,重复性试验中每组变异系数均小于1%;检测人工染菌的虾肉和贝类样品时,最低检出限亦达到10 CFU/m L,且整个检测扩增时间大约为1 h。结果表明,本研究建立的三重荧光PCR检测方法,特异性强、敏感性高、重复性好且耗时短,是高通量检测致病性副溶血弧菌的有效手段。     

猪链球菌2型主要毒力因子三重荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中猪链球菌2型三种毒力因子CP2SJ、MRP、EF基因序列,利用Primer Express 3.0软件分别设计3对特异性的引物及相应的Taqman探针。CP2SJ、MRP、EF探针5′端分别标记FAM、HEX、CY5荧光发射基团,3′端标记BHQ1淬灭荧光基团。通过优化反应体系和程序,建立了一种基于Taqman探针法的三重荧光定量PCR,可同时检测上述三种毒力基因。该方法灵敏度高,CP2SJ、MRP、EF的最低检测限分别为90、40、60拷贝数/μL的质粒;特异性强,与其他病原菌无交叉反应;重复性好,变异系数均小于3%。整个检测扩增在60 min内完成。以上结果表明本试验所建立的三重荧光定量PCR方法的敏感性、重复性及特异性均较好,可用于同时快速检测猪链球菌2型三种毒力因子。     

猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒一步法双重荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立猪瘟病毒(CSV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)现场快速鉴别检测方法,参照GenBank中CSV和PRRSV特异性基因序列,设计特异引物和TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了检测CSV和PRRSV的一步法荧光RT-PCR方法,并验证了该方法的特异性、敏感性、重复性。结果显示,该方法检测CSV和PRRSV的灵敏度分别可达0.25和1.99 TCID_(50)/100μL,对猪细小病毒(PPV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)的检测结果均为阴性。本试验建立的TaqMan一步法荧光定量RT-PCR检测方法,可对CSV和PRRSV进行快速诊断,适合现场检测。     

猪细小病毒和猪圆环病毒2型二重液相芯片检测方法的建立

作者拟建立检测猪细小病毒(PPV)和猪圆环病毒2型(PCV2)的二重液相芯片(xMAP)检测方法,以满足出入境检疫和临床高通量检测的要求.依据GenBank中PPV结构蛋白VP2基因及PCV2全基因序列,设计PPV和PCV2特异性探针、引物及探针互补序列,将探针与磁性微球偶联,对下游引物和探针互补序列标记生物素,采用不对称性二重PCR扩增靶序列,将PCR产物与偶联好的探针进行杂交,用液相芯片仪进行检测.通过对检测条件优化,建立检测PPV、PCV2两种病毒的二重液相芯片技术,并对临床样本进行检测.建立的PPV和PCV2二重液相芯片检测方法,特异性良好,该方法对PPV和PCV2基因拷贝数检测下限分别为1.53×10 4、2.58×102;对56份临床样品检测表明,该方法与单项PCR检测结果符合率为100％.成功建立了PPV、PCV2二重xMAP检测方法,该检测技术可用于出入境检疫和兽医临床检验.     

猪细环病毒LAMP检测方法的建立

为建立一种特异和快速的猪细环病毒(TTSuV)检测方法,本研究通过比对TTSuV的全基因序列,选择其保守区域,设计了针对TTSuV检测的LAMP引物,利用LAMP Real Time Turbidimeter LA-320仪对反应体系及条件进行了优化,建立TTSuV环介导等温扩增的检测方法.结果表明:该方法最佳反应条件为64℃恒温50 min,病毒的最低检出限为5.5拷贝/μL,并且与其他相关传染病无交叉反应.临床样品检测结果显示,猪繁殖与呼吸综合征病毒-(PRRSV)和2型猪圆环病毒(PCV2)阳性的样品中TTSuV呈高阳性率,分别为92％和87.3％,显著高于非PRRSV和PCV2阳性的猪群.该方法的建立为快速及特异性的检测猪TTSuV提供了有效的方法.     

猪圆环病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究以猪圆环病毒2型(PCV2)核衣壳蛋白ORF2基因为目的基因,设计合成特异性引物和探针。PCR扩增得到目的基因,并克隆到pMD18-T载体,筛选得到标准阳性质粒。通过对荧光定量PCR反应条件的优化,建立了PCV2的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。试验结果表明,该方法特异性强,对猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)等猪常见病原的检测结果均为阴性;与普通PCR方法相比,其敏感性高出100倍,可达100拷贝/μL;对临床样品的检测证明,该方法可有效检测出淋巴结、肺脏等组织中的PCV2。     

H9N2亚型禽流感病毒二重荧光RT-LAMP检测方法的建立

根据H9N2亚型禽流感病毒(AIV)的HA和NA基因的保守序列,设计2套特异性LAMP引物和2条探针引物,同时在2条探针的5′端分别标记不同的荧光基团,在3′端都标记猝灭基团,然后使用多色荧光成像仪观察反应后是否有荧光产生来判断反应管里是否有阳性扩增,通过荧光颜色的不同来分析阳性扩增产物的类型。特异性试验结果显示该方法能特异性扩增H9亚型和N2亚型AIV,对其他15个HA亚型和其余8个NA亚型AIV以及禽类常见病原体均无扩增;干扰性试验结果显示H9和N2两种亚型AIV可以在同一反应管中独立完成扩增,二者互不干扰;敏感性试验显示其最低检测限度为100拷贝/μL。试验结果表明本试验建立的二重荧光RT-LAMP检测方法具备反应快速、灵敏、特异性强同时可以用肉眼直接观察辨别扩增产物的优点,对H9N2亚型AIV临床快速检测具有较好的应用前景。     

猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型TaqMan-MGB双重荧光定量PCR检测方法的建立及应用

参照GenBank中猪伪狂犬病毒(PRV)gE基因以及猪圆环病毒2型(PCV2)中ORF2特异性序列,设计特异引物和TaqMan-MGB探针,通过优化反应条件,建立了同时检测PRV野毒株和猪圆环病毒(PCV2)的双重荧光定量PCR检测方法,并验证该方法的特异性、敏感性、重复性。结果表明,该方法检测PRV和PCV2灵敏度分别可达2.23×101、4.5×102拷贝/μL,均比常规PCR检测方法高100倍;同时检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖和呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、均为阴性,无交叉反应;对30份疑似病料进行检测并与普通PCR进行比较,结果显示,二者检测PRV的总符合率为96.67%,检测PCV2的总符合率为93.33%。本试验建立的TaqMan-MGB双重荧光定量PCR检测方法可同时对PRV野毒株和PCV2进行早期快速诊断,可应用于病原学监测,流行病学调查等。     

应用二重实时荧光定量RT-PCR鉴别坦布苏病毒与产蛋下降综合征病毒

为更加快速敏感地对两种导致产蛋下降的禽类病毒:坦布苏病毒和产蛋下降综合征病毒进行鉴别,试验建立了一套二重实时荧光定量RT-PCR方法。通过针对两种病毒的特异保守序列,设计两套引物和探针,分别标记不同的荧光基团和淬灭基团,并优化反应体系。结果显示:建立的二重实时荧光定量RT-PCR方法只扩增这两种病毒的目的片段,无交叉扩增反应,与其他常见禽类病原体也无扩增反应;该检测体系最低可同时检测100个拷贝的坦布苏病毒和产蛋下降综合征病毒,比常规PCR和RT-PCR敏感10~100倍;检测30份样品,共检出7份EDSV阳性,6份TMUV阳性,与病毒分离结果符合。表明建立的二重实时荧光定量RT-PCR方法可以快速、敏感、特异地鉴别诊断坦布苏病毒和产蛋下降综合征病毒。     

联合表达PCV2 ORF2和PPV VP2基因病毒样颗粒获得及免疫原性

将包含有完整阅读框架,长1 740、705 bp的PPV VP2基因、PCV2 ORF2基因分别插入真核表达栽体pPI-2.EGFP,构建了重组质粒pPI-2.EGFP.VP2.ORF2.观察由脂质体介导转染重组质粒后的Vero细胞,结果最早在转染后20 h左右出现荧光,36 h达到高峰;对转染细胞进行电镜检测,结果观察到病毒样颗粒存在.为证实所获病毒样颗粒是否为重组颗粒,将纯化后的病毒样颗粒免疫仔猪,检测其血中T淋巴细胞的动态变化以及血清抗体水平.结果免疫仔猪的CD3+、CD4+T淋巴细胞在外周血淋巴细胞中的比率均有一定程度的升高;CD8+T淋巴细胞在免疫后7～14 d有所下降,之后再升高.抗体检测结果表明,免疫动物血清中有较高水平的PPV、PCV2特异性抗体.结果表明重组质粒pPI-2.EGFP.VP2.ORF2获得成功表达并形成重组病毒样颗粒,且该颗粒具有良好的免疫原性.     

Establishment and Preliminary Application of Nested PCR for the Detection of Porcine Circovirus Type 2

Porcine circovirus type 2 (PCV2) caused significant economic losses of swine industry,it's very important to establish a economy and rapid detection method.To strengthen the prevention and control of porcine circovirus disease,rapid and high sesitive detection method of PCV2 was established using nested PCR.According to PCV2 ORF2 gene conservative region,we designed two pairs of nested PCR primers,constructed ORF2 gene recombinant plasmid for standard template and optimizated the PCR reaction conditions to establish nested PCR detection method of PCV2 and detect the clinical samples of pig farms.Our results showed that the sensitivity and repeatability of this method were very high,the minimum detection level was 10 copies/μL and detection rate of clinical samples was 97.3%.In brief,the established nested PCR detection method of PCV2 in this study provided powerful means for quick and efficient detection of PCV2,and prevention and control of porcine circovirus disease in the swine industry.     

猪圆环病毒2型巢式PCR检测方法的建立与初步应用

猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)给养猪业造成了重大的经济损失,建立经济、快速的检测方法尤为重要。本研究旨在利用巢式PCR技术,建立高灵敏度PCV2检测平台,以加强对猪圆环病毒病的防控。根据PCV2 ORF2基因保守区,设计内、外2对巢式PCR引物,通过优化PCR反应条件,建立巢式PCR检测方法,并对猪场临床样本进行检测。结果显示,本研究建立的巢式PCR检测方法灵敏度高、重复性强,最低检出量为10拷贝/μL,检出率达97.3%。本研究建立的巢式PCR检测方法为快速、高效地检测PCV2以及为猪圆环病毒病的防控提供有力手段。     

Establishment and Rudimentary Application of the nano-dPCR for Detection of PCV2 and PCV3

This study was aimed to establish a duplex nanoparticle-assisted PCR (nano-dPCR) method for the simultaneous detection of porcine circovirus type 2 (PCV2) and PCV3, and to apply this method in the detection of PCV2 and PCV3. Primers specific to PCV2 and PCV3 were designed by reference to the respective gene sequences in GenBank. The reaction conditions of nano-dPCR were also optimized. An evaluation of the specificity and sensitivity of the established nano-dPCR protocol proved the method to be both specific and sensitive, with the lower detection limit for the amount of nucleic acid in PCV2 and PCV3 to be 93.2 and 91.6 copies/μL, respectively. This sensitivity was 100 times higher than that of conventional PCR. The method was applied to inspect 265 clinical samples sent for testing, and the results showed that PCV2 and PCV3 infection in pig was rather common, with 16.6% positive for PCV3, 14.7% positive for PCV2, and 6.8% for mixed infection. The detection results on clinical samples supported the newly established nano-dPCR method as a rapid and sensitive differential diagnosis for the early infection of PCV2 and PCV3.     

PCV2和PCV3双重纳米PCR方法的建立及初步应用

本研究旨在建立一种同时检测猪圆环病毒2型（PCV2）和猪圆环病毒3型（PCV3）的双重纳米PCR（nano-dPCR）方法,同时应用该方法对PCV2和PCV3进行检测。参考GenBank中登录的PCV2和PCV3型基因序列分别设计特异性引物,对nano-dPCR的反应条件进行优化;同时考察所建立的nano-dPCR检测方法的特异性和敏感性。结果显示,所建方法的特异性和敏感性良好,对PCV2和PCV3两种病毒的最低核酸检测量分别为93.2和91.6拷贝/μL,其敏感性比普通PCR高100倍。应用该方法对送检的265份临床样本进行检测,结果显示,PCV2和PCV3在猪群中存在普遍感染,PCV3和PCV2的阳性率分别为16.6%和14.7%,混合感染阳性率为6.8%。临床样品的检测结果表明,本试验建立的nano-dPCR方法为PCV2和PCV3早期感染进行快速、敏感鉴别诊断提供了新方法。     

Establishment and Preliminary Application of the Multiplex PCR Method for Detection of 4 Kinds of Swine Diseases

The aim of this study was to establish a multiplex PCR method for simultaneously detecting porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV),porcine circovirus type 2 (PCV2),porcine pseudorabies virus (PRV) and Mycoplasma hyopneumoniae (Mh).Four pairs of primers were synthesized according to the reference.The multiplex PCR method was developed by optimizing the reaction condition,specificity and sensitivity detection.Four different amplicons with size of 424,490,298 and 360 bp for PRRSV,PCV2,PRV and Mh,respectively,were yielded.The sensitivity of multiplex PCR indicated that the detection limit was 3 copies by using Multiplex PCR Master Mix,and other common pathogens were not amplified.A total of 60 specimens from piglets were tested by multiplex PCR method.The positive accordance rate between simple and multiplex PCR was 100%.This study indicated that multiplex PCR might be a useful tool for rapid and sensitive etiological diagnosis and provided an effective technical support for pathogenic molecular epidemiology investigation.     

新疆地区4种猪病多重PCR检测方法的建立与初步应用

本试验旨在建立一种可同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)、猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)、猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mh)的多重PCR检测方法。参考相关文献合成PRRSV、PCV2、PRV、Mh的特异性引物,通过对反应条件优化、特异性、敏感性测定,建立了可同时检测以上4种猪多发传染病的PCR诊断方法。扩增的片段长度分别为424 bp (PRRSV)、490 bp (PCV2)、298 bp (PRV)和360 bp (Mh),对其他常见猪病病原无特异性扩增,采用Multiplex PCR Master Mix对PRRSV、PCV2、PRV、Mh的核酸最低检出量为3个拷贝。采用多重PCR方法对60份临床样本反复检测,与单重PCR相比,4种病原符合率均为100%。结果表明,建立的多重PCR诊断方法可用于猪群中上述4种病原的单一或混合感染的快速鉴别诊断和流行病学调查。     

Diagnosis and Pathogen Analysis of Mixed Infection of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,Porcine Circovirus Type 2 and Haemophilus parasuis

To identify the causative agent of porcine respiratory disease complex (PRDC) occurred at a pig farm in Kaifeng city,Henan province,we identified the potential causative bacteria of the morbid nursing piglets by bacterial test and drug sensitivity test of the clinical samples (lung,liver and spleen),and detected the common potential pathogens causing PRDC diseases by PCR and RT-PCR assays,including porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV),porcine circovirus type 2 (PCV2),swine influenza virus (SIV),pseudorabies virus (PRV),classical swine fever virus (CSFV) and Mycoplasma hyopneumoniae (Mhp),and then sequcing and phylogenetic analysis of the structural gene of positive causative pathogens were carried out.The results showed that a Haemophilus parasuis (Hps) strain were isolated and identified by the observation of bacterial morphology and satellite phenomenon,and the sequence analysis of 16S rRNA gene.The drug sensitivity test showed that the Hps strain was sensitive to ampicillin,amoxicillin-clavulanic acid,ceftiofur and tetracycline.Meanwhile,PCR and RT-PCR assays indicated that all the samples were positive for PRRSV and PCV2,and named the involved strain as PRRSV/HN-2019 and PCV2/HN11-2019,respectively.Sequencing and phylogenetic analysis of the ORF5 gene of the newly identified PRRSV revealed that the PRRSV/HN-2019 strain was closely related to the NADC30-like strains and grouped into NADC30-like genotype clade.And cap gene of the newly identified PCV2 strain the PCV2/HN11-2019 strain was closely related to the PCV-2d strains and grouped into PCV-2d genotype clade.In conclusion,this study demonstrated that the morbid piglets were co-infected with PRRSV,PCV2 and Hps,which provided a basis for the development of effective control strategies in the pig farm.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒2型与副猪嗜血杆菌混合感染的诊断及病原分析

为确定河南开封某猪场发生猪呼吸系统疾病综合征（PRDC）的病原,本研究无菌采集病死保育猪肺脏、心脏和脾脏等组织样品,进行细菌学检验和药敏试验,通过PCR/RT-PCR检测样品中猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪圆环病毒2型（PCV2）、猪流感病毒（SIV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪瘟病毒（CSFV）和猪肺炎支原体（Mhp）等病原,并对核酸阳性病毒性病原的抗原结构基因进行测序和遗传演化分析。结果表明,通过细菌分离培养、形态观察、卫星现象观察和16S rRNA基因鉴定,从病死保育猪体内分离鉴定出1株副猪嗜血杆菌（Hps）,药敏实验表明该菌株对对氨苄西林、阿莫西林克拉维酸、头孢噻呋和四环素几种药物敏感。核酸检测PRRSV和PCV2核酸阳性,分别命名为PRRSV/HN-2019和PCV2/HN11-2019;进一步对PRRSV/HN-2019和PCV2/HN11-2019的结构基因分析发现,PRRSV/HN-2019与与NADC30分支的毒株亲缘关系较近,属于NADC30-like毒株;PCV2/HN11-2019与PCV-2d分支的毒株亲缘关系较近,属于PCV-2d分支。综上所述,本研究确定该猪场存在PRRSV、PCV2和Hps的混合感染,为该猪场下一步的PRDC有效防控提供了参考依据。     

猪GM-CSF基因对猪圆环病毒2型DNA疫苗诱导仔猪免疫反应的调节作用

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）能够诱导树突状细胞的成熟和存活，并提高其抗原递呈功能，是非常有潜力的分子佐剂之一。为了探讨猪GM-CSF对猪圆环病毒2型（PCV2）DNA疫苗诱导免疫反应的调节作用，本研究将表达猪GM-CSF和PCV2衣壳蛋白的重组质粒混合物（pcDNA3．1-gm-csf和pcDNA3．1-orf2）及在同一载体上表达PCV2衣壳蛋白与猪GM-CSF的双表达重组质粒（pIRES-orf2／gm-csf），分别接种于7日龄健康仔猪，共肌肉注射3次，每次间隔2周。结果表明猪GM-CSF基因能够明显增强PCV2DNA疫苗诱导的特异性体液免疫反应，提高外周血淋巴细胞（PBLC）对ConA刺激的增殖活性，增强NK细胞的杀伤功能，影响细胞因子IL-12、IFN-γ、IL-4和IL-10的表达水平。但GM-CSF基因单独表达和与PCV2衣壳蛋白基因在同一载体上表达，对上述4个细胞因子表达的影响有一定差异。