PRRSV Hn-1/06株GP5蛋白基因的克隆及表达载体的构建

[目的]克隆PRRSVHn-1/06株GP5蛋白基因并构建其原核表达载体。[方法]根据PRRSV美洲株ATCC-VR2332的ORF5基因序列设计特异性引物,用RT-PCR方法从Hn-1/06株中扩增得到GP5蛋白基因的片段,与PTG19-T载体连接获得其阳性克隆PTG19-T-ORF5。以该基因片段为模板分别设计ORF5完整序列和删除信号肽的ORF5序列两条引物,进行PCR扩增,将目的片段与原核表达载体pET32a连接,并对其进行酶切鉴定。[结果]扩增得到GP5蛋白基因全长序列603 bp,编码200个氨基酸残基;具有3个潜在的N-糖基化位点和9个半胱氨酸;分子量为22.4 kD,等电点为8.550;双酶切pET32a-ORF5鉴定,结果与预期一致,证实重组质粒构建成功。[结论]成功构建了PRRSVHn-1/06株GP5蛋白基因的表达载体,为深入研究GP5蛋白的本质与功能及其致病性奠定基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5基因疫苗的构建及免疫小鼠试验

参照已公布的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲株GP5蛋白基因序列,设计并合成1对引物,以RT-PCR方法扩增出PRRSV的GP5基因片段(603 bp)。回收目的基因片段,克隆到pMD18-T载体内构建成重组质粒pMD18T-G。经酶切鉴定、测序正确后,再回收目的基因片段,克隆到真核表达载体pIRES-neo内,经单酶切和双酶切鉴定,成功构建基因疫苗表达载体pIRES-G。免疫小鼠试验表明,2次免疫后抗体水平显著提高,但总的抗体水平体低于灭活苗。     

PRRSV Hr-1/06株GP5蛋白基因的克隆及表达载体的构建

[目的]克隆PRRSV Hn-1/06株GP5蛋白基因并构建其原核表达载体.[方法]根据PRRSV美洲株ATCC-VR2332的ORF5基因序列设计特异性引物,用RT-PCR方法从Hn-1/06株中扩增得到GP5蛋白基因的片段,与PTG19-T载体连接获得其阳性克隆PTG19-T-ORF5.以该基因片段为模板分别设计ORF5完整序列和删除信号肽的ORF5序列两条引物,进行PCR扩增,将目的片段与原核表达载体pET32a连接,并对其进行酶切鉴定.[结果]扩增得到GP5蛋白基因全长序列603 bp,编码200个氨基酸残基;具有3个潜在的N-糖基化位点和9个半胱氨酸;分子量为22.4 kD,等电点为8.550;双酶切pET32a-ORF5鉴定.结果与预期一致,证实重组质粒构建成功.[结论]成功构建了PRRSV Hn-1/06株GP5蛋白基因的表达载体,为深入研究GP5蛋白的本质与功能及其致病性奠定基础.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP_5基因重组腺病毒的构建及特性研究

将克隆到的猪繁殖与呼吸综合征病毒全长GP5基因插入到pAdTrack-CMV穿梭质粒中,再将重组质粒pAdTrack-CMV/GP5用PmeⅠ线性化后电转化携带有腺病毒骨架载体pAdeasy-1的大肠杆菌BJ5183感受态细胞,经细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒pAdEasy-GP5,经酶切充分暴露反向末端重复序列,再与脂质体混合转染AD-293细胞,成功获得了AD-GP5复制缺陷型腺病毒,经检测证实AD-GP5稳定性好,安全性高.转录水平检测证实,GP5蛋白基因得到了转录;荧光检测发现,外源蛋白已得到表达.     

PRRSV结构蛋白GP5的原核表达与鉴定

利用大肠杆菌原核表达系统体外表达猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒的GP5蛋白,可为GP5蛋白的应用奠定物质基础。研究利用PCR技术获得带有酶切位点的gp5基因,通过酶切、连接构建p Cold I-gp5重组质粒,并将其转化至BL21感受态细胞,获得阳性单克隆后诱导其表达,对表达产物进行SDS-PAGE和Western Blotting分析。结果显示,p Cold I-gp5原核表达载体构建成功,该重组载体在大肠杆菌表达系统中能够表达,并且重组蛋白GP5以可溶性蛋白的形式表达。     

表达PRRSV GP3蛋白减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株的构建

构建表达猪PRRSV GP3蛋白的口服重组减毒鼠伤寒沙门氏菌活载体疫苗株。将去信号肽序列的PRRSV ORF3基因插入到表达载体pYA3341(Asd+)中,构建重组质粒pYA3341-ORF3。将重组质粒电转入鼠伤寒沙门氏菌疫苗株X4550(Asd-、Cya-、Crp-),获得重组疫苗菌株X4550(pYA3341-ORF3)。体外鉴定重组菌表达的GP3蛋白、重组菌特性并进行小鼠免疫试验。酶切鉴定和序列测定证实重组质粒构建成功,SDS-PAGE电泳及Western blot检测有GP3特异性蛋白条带,小鼠免疫后可检测到GP3蛋白抗体。成功构建能稳定表达PRRSV GP3蛋白的口服减毒鼠伤寒沙门氏菌疫苗株。     

表达犬瘟热病毒核蛋白的重组犬2型腺病毒构建与包装

为构建表达犬瘟热病毒核蛋白的重组犬2型腺病毒,用MluⅠ和SphⅠ双酶切真核表达载体pVAXLPN,获得CDVN基因表达盒,将CDVN基因表达盒克隆入预先用SspⅠ酶切后的线性化质粒pVAXAE3中,构建含CDVN基因表达盒的转移质粒pVAX△E3LPN。用NruⅠ和SalⅠ双酶切转移质粒pVAX△E2LPN。回收E3区部分缺失的含CDVN基因表达盒的目的片段,定向克隆入同样酶切处理含CAV-2全基因组的质粒载体ppoly2-CAV-2中,构建E3区部分缺失的包含CDV N基因表达盒的重组质粒pCAV-2-CDVLPN。重组质粒pCAV-2-CDVLPN经AscⅠ酶切获得线性化基因组CAV-2-CDVLPN。此基因组与NruⅠ和Sal Ⅰ分别酶切CAV-2 SY基因组获得的片段混合,利用脂质体介导共转染MDCK细胞,重复转染3次后。出现典型CAV-2病变,经电镜观察和酶切鉴定,证明表达犬瘟热核蛋白的重组犬2型腺病毒包装成功。     

表达PRRSV GP2a/GP2b、GP3、GP4、GP5和M蛋白重组腺病毒的构建

以PRRSV FJ-1a株为模板,采用RT-PCR法分别扩增出GP2a/GP2b-3、GP3、GP4、GP5和M蛋白基因片段,双酶切后插入穿梭质粒pDC316.利用AdMaxTM法,将5个重组穿梭质粒分别与腺病毒辅助质粒共转染293细胞,得到重组腺病毒Ad-GP2a/GP2b-3、Ad-GP3、Ad-GP4、Ad-GP5和Ad-M.重组腺病毒滴度为107.7～109.0TCID50·mL-1,而以Ad-GP5滴度最低,仅为107.7TCID50·mL-1.PCR检测第3、6、9代重组腺病毒稳定性,确证重组病毒均能稳定携带目的基因.对目的基因转录的RT-PCR鉴定结果显示,重组腺病毒分别感染293细胞后能转录产生目的基因mRNA.表达PRRSV主要囊膜蛋白基因重组腺病毒的获得,为进一步研制PRRSV基因工程疫苗,解析主要囊膜蛋白功能奠定基础.     

PRRSV GZJL株GP5基因的克隆及原核表达

为成功表达PRRSV GZJL株GP5蛋白,本研究设计合成一对引物,并以PCR方法从阳性重组质粒pMD18-T-GP5中扩增得到PRRSV GZJL株GP5基因片段中的79～600 bp即dGP5.将dGP5基因连接至原核表达载体pET-32a(+),并转化入表达菌株BL21(DE3).经PCR、双酶切和测序鉴定,阳性...     

猪繁殖与呼吸综合症病毒结构蛋白GP5-M腺病毒载体的构建及其在山羊乳腺中的表达

猪繁殖与呼吸综合症(PRRS)是严重威胁养猪业的病毒性疾病,疫苗免疫是预防该病的最有效途径,PRRSV糖蛋白GP5和基质蛋白M融合后制成的基因工程疫苗能够有效激发机体产生免疫应答。通过在GP5和M基因的5′端依次加上组氨酸标签序列、信号肽序列,利用Linker(GP)序列将GP5和M基因连接构建融合表达GP5和M蛋白的重组质粒pMD18T-SignalP-His-GP5-M。以该质粒为模板,构建重组腺病毒载体并包装腺病毒。结果表明,用包装的腺病毒感染乳腺上皮细胞,测得最佳感染复数(MOI)为25,定量PCR和Western blot方法均检测到GP5-M的表达。大量扩增腺病毒并使用不连续氯化铯浓度梯度离心纯化病毒,使用纯化的病毒灌注山羊乳腺,采用Western blot在收集的乳汁中也检测到GP5-M蛋白的表达。结果证实,利用腺病毒载体作为基因转导的媒介,在山羊乳腺中可以表达GP5-M融合蛋白。     

PRRSVGP5基因的优化、表达及其表达产物的免疫学活性分析

PRRSV GP5基因含有一段信号肽及3个跨膜功能区,这些区域可以使翻译的GP5停留在内质网,从而抑制其表达.根据实验室分离测定的PRRSV T1株GP5基因序列进行优化设计,通过人工合成获得GP5-ShortDNA并构建表达载体pGEX-GP5,将其转入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达获得约41kD的目的融合蛋白.通过Western-blot检测,结果显示该融合蛋白可与PRRSV阳性血清发生特异性反应,表明该蛋白具有免疫学活性.研究结果为PRRSV基因工程苗的研究奠定了基础,同时也为基因的优化提供了借鉴.     

猪C3d分子佐剂PRRSV GP5基因核酸疫苗的构建及免疫效果的研究

 【目的】构建猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）GP5基因C3d-P28分子佐剂重组质粒,探明C3d-P28分子佐剂的免疫增强效果。【方法】用大肠杆菌疫苗对健康猪进行免疫激活,提取猪肝脏总RNA,RT-PCR克隆C3d-P28并连接至pUC19载体,构建pUC19-P28.n（2、4、6）串联体,然后分别将P28.n（2、4、6）连接至真核表达载体pcDNA3.1构建成 pcDNA3.1-P28.n（2、4、6）。RT-PCR扩增PRRSV GP5基因,分别定向克隆至pcDNA3.1-P28.n（2、4、6）中,构建pcDNA3.1-GP5-P28.n（2、4、6）重组质粒;提取重组质粒进行双酶切、电泳,同时用重组质粒转染Marc 145细胞,经间接免疫荧光进行蛋白表达检测,并用重组质粒免疫小鼠,通过ELISA试剂盒检测小鼠体内抗体、IL-4和IFN-γ的水平,检验重组质粒的免疫效果。【结果】从猪肝脏中克隆了C3d cDNA,构建了pcDNA3.1-P28.n（2、4、6）串联体,并将PRRSV GP5基因定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1-P28.n（2、4、6）中,构建了PRRSV GP5重组质粒（pcDNA3.1-GP5-P28.2、pcDNA3.1-GP5-P28.4、pcDNA3.1-GP5-P28.6）;通过检测小鼠血清中抗体、IL-4和IFN-γ的结果显示,抗体效价、IL-4和IFN-γ含量均比对照组高,且以pcDNA3.1-GP5-P28.6组的效果最好,与空白对照及PCDNA3.1-GP5组比较差异均显著（P<0.05）。【结论】构建了猪补体C3d-P28分子佐剂PRRSV GP5重组质粒,该质粒可刺激机体产生较高的体液免疫和细胞免疫水平,补体 C3d-P28分子佐剂能显著增强PRRSV GP5基因的免疫效果。     

秦川牛FABP4基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

【目的】旨在通过构建秦川牛FABP4基因的重组腺病毒载体,为在细胞水平研究FABP4基因的功能和作用机制做准备。【方法】根据GenBank收录的牛FABP4基因mRNA序列设计引物,PCR扩增并克隆测序。将目的基因连接到穿梭载体pAdTrack-CMV上并用PmeⅠ线性化后,转化含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的E. coli BJ5183感受态细胞进行同源重组,得到重组质粒pAd-FABP4,并用PacⅠ酶切鉴定。将经过PacⅠ线性化的pAd-FABP4转染HEK 293A细胞进行病毒包装和扩增,TCID50法测定病毒滴度。【结果】经测序鉴定本次克隆的FABP4 序列与GenBank收录的一致。 酶切鉴定、绿色荧光观察、PCR及测序检测均证明,重组腺病毒载体构建成功并获得重组腺病毒AD-FABP4,病毒滴度为1.58×109 PFU•mL-1。【结论】成功构建了秦川牛FABP4基因重组腺病毒载体并获得高滴度的重组腺病毒。     

猪繁殖与呼吸综合症GP5蛋白的纯化与免疫活性分析

[目的]对猪繁殖与呼吸综合症（PRRS）的GPS蛋白进行纯化与免疫活性分析,为建立相应的血清学诊断方法奠定基础。[方法]用构建好的重组表达质粒pGEX-6P-5转化B121后经IPTG诱导表达。对表达产物进行可溶性分析,再将重组目的蛋白纯化后进行SDS—PAGE鉴定和Western—blot分析,最后用重组抗原进行豚鼠免疫试验。[结果]经层析扫描分析目的蛋白含量占菌体蛋白总量30％左右,纯化后目的蛋白纯度可迭80％。经Western—blot及豚鼠免疫试验对纯化蛋白进行分析后证明,表达的蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。[结论]该研究为深入研究PRRSVORFs基因及其编码蛋白功能提供了材料,同时也为生产猪繁殖与呼吸综合症病毒基因工程产品奠定了良好基础。     

大肠杆菌LTB增强PRRSV-GP5蛋白免疫反应的研究

以猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)主要中和表位所在的糖蛋白GP5为模式抗原,采用肌肉注射、皮下注射和滴鼻免疫方式免疫6～8周龄ICR小鼠,利用间接ELISA检测血清抗体,MTT法检测淋巴细胞增殖.结果表明:三免后GP5弗氏佐剂乳化组小鼠血清抗体的水平最高,LTB+GP5免疫组的抗体水平显著高于单独GP5免疫组,肌肉注射免疫组的抗体水平明显高于皮下注射组,滴鼻免疫组没有检测到特异性血清抗体;各GP5免疫组均能不同程度地诱导脾脏B淋巴细胞增殖,其中GP5弗氏佐剂乳化组、LTB+GP5肌肉注射和LTB+GP5皮下注射组B淋巴细胞增殖显著,除了GP5弗氏佐剂乳化免疫组外,其他各免疫组均无明显的脾脏T淋巴细胞增殖反应.